缺失的遺傳學效應范文

導語：如何才能寫好一篇缺失的遺傳學效應，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

關鍵詞：異常孕產史 染色體 核型分析

中圖分類號：R596 文獻標識碼：B 文章編號：1004-7484（2011）06-0040-02

異常孕產史包括自然流產、死胎、死產、曾育畸形兒等，隨著細胞遺傳學研究的深入發展，發現染色體異常是重要原因之一。為探討染色體異常與異常孕產史的關系，本文對723對具有上述病史的夫婦進行了細胞遺傳學檢查，現將結果報告如下：

1 資料方法

1.1病例資料

從2005年4月~2011年1月，因有自然流產、死胎、畸胎和新生兒死亡等異常孕產史在我院就診的723對夫婦，其表型、智力均正常，行外周血染色體核型分析。女性年齡21~39歲，男性年齡23~42歲。

1.2染色體檢查方法

采用常規外周血染色體檢查方法，鏡下每例計數30個分裂相，應用染色體自動分析儀（CIARS1.0）分析染色體G顯帶核型5個，有異常則增加計數和分析數量，必要時加C帶處理分析。

2 結果

723對夫婦中，檢出染色體異常核型28例，異常檢出率1.94%，其中男性10例，女性18例。常染色體結構異常28例，其中相互易位23例，羅伯遜易位5例，倒位1例，無常染色數目異常，異常染色體核型與不良孕產史情況見表1。常染色體異染色質多態性變異136例，性染色體異染色質多態性變異27例。異染色質多態性變異情況見表2。

表1 28例染色體異常核型及主要臨床表現

類別 異常核型 例數 主要表現

相互

易位 46,XY,t(4;7)(q33;q22) 1 配偶流產2次

46,XY,t(1;7)(q32;q32) 1 配偶流產4次

46,XX,t(3;16)(q21;q22) 1 流產3次

46,XX,t(2;21)(q31;q22) 1 流產1次

46,XX,t(5;6)(q11;q23) 1 胎兒脊椎裂1次，死胎1次

46,XY,t(11;20)(q23;q13) 1 配偶流產3次

46,XX,t(2;11)(q14;q23) 1 流產4次，母親流產10次

46,XX,t(7;13)(q22;q21) 1 流產3次

46,XX,t(3;5)(q13;q15) 1 流產2次

46,XX,t(5;6)(q12;q26) 1 流產2次

46,XY,t(10;22)(q11;q11) 1 配偶流產2次

46,XY,t(10;18)(p11;p11) 1 配偶流產4次

46,XX,t(13;20)(q21;q12) 1 流產3次

46,XY,t(8;16)(q24;p13) 1 配偶流產2次

46,XY,t(1;3)(q22;q22) 1 配偶流產3次

46,XX,t(3;8) 1 流產5次

46,XX,t(10;13) 1 流產2次

46,XX,t(3;11) 1 配偶流產2次

46,XY,t(1;14) 1 配偶流產3次

46,XY,t(1;18) 1 胎兒腦積水1次，死胎1次

46,XY,t(5;6) 1 配偶流產2次

46,XX,t(4;15) 1 流產4次

羅伯遜易位 45,XX,rob(13;14) 3 各流產2次

45,XX,rob(14;21) 1 流產1次

45,XX,rob(14;22) 3 流產3次

倒位 46,XX,inv(10) 1 流產3次

表2 163例異染色質多態性變異情況

核型 例數

常染色體多態 46,XX/46,XY,1qh+ 50

46,XX/46,XY,15p+ 13

46,XX/46,XY,inv(9) 13

46,XX/46,XY,22S+ 11

46,XX/46,XY,16qh+ 9

46,XX/46,XY,14s+ 7

46,XX/46,XY,21s+ 7

46,XX/46,XY,9qh+ 6

46,XX/46,XY,15s+ 6

46,XX/46,XY,13s+ 6

46,XX,14p+ 2

46,XX/46,XY,21p+ 2

46,XY,13p+ 1

性染色體多態 46,XY,Yq+ 23

46,XY,Yq- 4

3 討論

本文對723對異常孕產史夫婦的 外周血染色體檢查中檢出染色體異常核型28例 ，染色體多態163例，總檢出率13.3%，略高于文獻報道的55%―6%的發生率，結果表明，染色體異常是異常孕產史的重要細胞遺傳學因素。染色體結構異常中平衡易位是不良孕產史夫婦中最常見的染色體異常，是兩條染色體同時斷裂后，兩個斷片相互交換位置后重接，而形成兩條衍生染色體。染色體平衡易位攜帶者的異常核型可以由父母遺傳而來，也可以在配子形成過程中或胚胎早期卵裂時，發生新的突變。染色體發生易位后，一般沒有遺傳物質的丟失，所以平衡易位攜帶者表型大多正常，但會影響生育。相互易位攜帶者生殖細胞形成正常配子僅占有1/18，與親代一樣帶有相互易位染色體的配子占1/18，而16/18的配子有染色體部分重復或缺失，即遺傳物質不平衡。與正常人婚配，16/18幾率的胚胎在臨床上表現為早期流產、胎死宮內或生育染色體異常后代。羅伯遜易位的平衡易位攜帶者，其胎兒只有1/6的可能為正常兒，1/6的可能為平衡易位攜帶者，其余的為胎兒死亡或先天畸形兒[1]。

倒位是一條染色體發生2次斷裂，其中間片段倒轉1800后又重新接上。這種倒位攜帶者無遺傳物質的丟失，故表型正常，但在生育下一代時理論上可形成4種結果：一種正常，一種倒位攜帶者，另兩種因染色體片段部分重復和缺失最終導致流產、死胎、畸形。倒位片段占所在染色體的比例不同，其遺傳效應不同，而遺傳效應主要決定于重復和缺失片段的長短。一般來說，倒位片段越短，其重復和缺失的部分越長，形成配子和合子正常發育的可能性越小，臨床表現為婚后不育、早期流產和死產的比例越高，娩出子女的可能性相對低；而倒位片段越長，則其重復和缺失部分越短，其配子和合子正常發育的可能性越大，娩出畸形胎兒的危險性相對較高[2]。

染色體多態性在人群中普遍存在，是指表型正常個體的染色體上的微小變異[3] ，表現為Y染色體長臂變異，D/G組染色體短臂變異，1，9，16號染色體的次縊痕的變異以及9號染色體臂間倒位等變異現象。以往多認為無臨床效應，現今對其研究較多。大Y染色體與胎兒發育異常、流產之間有著某種聯系，可能是Y染色體異染色質區DNA過度重復影響生殖細胞在減數分裂時染色體配對聯會，使受精卵細胞分裂、分化異常，從而導致胎停育、缺陷兒出生[4]。小Y是由于Y異染色質部分或完全丟失，導致常染色質排列松散，結果造成其基因功能喪失和生成異常；還有研究認為是Y染色質排列過度緊密影響其基因功能發揮。D/G組染色體隨體的結構、功能及變異均有可能在染色體不分離及三體的形成中起重要作用，發生機制可能是影響患者生殖細胞的分裂[5]。染色體的次縊痕異染色質區是易發和誘發斷裂的部位，由于增加或減少的是異染色質，故對個體本身表型影響不明顯，但減數分裂時可能引起其他染色體不分離導致胎兒染色體異常而流產。9號染色體臂間倒位，不能視為正常多態，應該引起高度重視。對在臨床上檢出的染色體臂間倒位攜帶者再次妊娠時應做好產前診斷，指導其生育，避免畸形兒的出生[6]。因此對異常孕產史的夫婦除做常規檢查外，還要進行細胞遺傳學檢查，以得出明確的遺傳學診斷，從而避免盲目治療，進行正確的婚育指導。

參考文獻

[1] 余云勛,馬旭,余國斌.中國遺傳咨詢[M].合肥:安徽科學技術出版社,2003,142-147.

[2] 劉權章.遺傳咨詢[M].哈爾濱:黑龍江科學技術出版社,1999,63-64.

[3] 劉權章.臨床遺傳學彩色圖譜[M].北京:人民衛生出版社,2006,59-62.

[4] 黃海燕,張香改,高羽,等.117例大小Y染色體臨床意義分析[J].中國計劃生育學雜志,2007,(2):106-107.

篇2

【關鍵詞】 不育癥； 男性； Y染色體； AZF； 無癥； 少癥

已婚育齡夫婦不孕癥的發病率高達10%~15%，其中男性不育約占40%，特發性無癥和嚴重少是男性不育的主要類型。引起無或嚴重少的原因極其復雜，遺傳缺陷是其中的重要原因之一。男性無和嚴重少患者除染色體異常外，Y染色體長臂有控制生成的無因子（Azoospermia factor，AZF），這一區域的基因微缺失與無和嚴重少密切相關。我們通過對無癥和嚴重少患者外周血染色體和Y染色體上AZF缺失的檢測，探討了引起無和少的遺傳因素和AZF缺失與表型效應的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

來自我院不育門診就診的男性不育患者。根據世界衛生組織標準進行常規分析、果糖測定、脫落細胞學檢查等，并排除繼發感染、輸精管缺如、其它外傷等病癥，經確診為無或嚴重少病例作為研究對象。無癥140例，嚴重少患者80例。按設計表格逐一填寫個人一般狀況、個人發育史、生育史、既往病史、體格檢查等情況。無癥和嚴重少病例年齡22~40歲，平均29.03±3.35歲 。以我院優生門診和沈陽市第一醫院婦產科有正常生育史患者的丈夫30例為對照組，以10例正常女性為陰性對照組，年齡24~35歲，平均28.12±2.83歲。

1.2 方 法

1.2.1 分析

根據世界衛生組織評估標準，每例患者重復兩次以上檢測，留取標本前應禁欲3~5天。無患者，經連續三次分析，并經離心沉淀均無者確診為無癥，并排除繼發感染、輸精管缺如、其它外傷等病癥。密度低于5×106/ml為嚴重少癥。

1.2.2 激素測定

采用SEROZYME I 磁分離酶聯免疫測試儀（瑞士）測定血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）激素，試劑為SEROZYME專用進口試劑。

1.2.3 染色體檢查

采用本室常規外周血染色體檢查方法，鏡下每例計數30個分裂相，G染色體顯帶核型分析5個。

1.2.4 Y染色體上缺失基因檢測

1.2.4.1 無基因引物

根據文獻資料，在Y染色體長臂5~6區30個基因片段位點分別選擇了引物AZFa區sY84、sY86，AZFb區sY102、sY134，AZFc區sY147、sY153、sY157和RBM，引物由中國科學院微生物研究所合成。它們的PCR擴增產物DNA長度分別為326bp、320bp、218bp、301bp、100bp、139bp、285bp 和825bp。

1.2.4.2 PCR反應檢測分析 1）標本DNA提取：采集患者外周血3ml，肝素抗凝，3000 rpm離心20min，取白細胞層加入等量的裂解緩沖液，充分混懸。15000rpm離心3min，去上清，沉淀加入1ml裂解液，重復1~2次，常規法提取DNA備用。

2）反應條件：25μl反應體系100 μl 10×緩沖液（10mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2），8μl dNTP混合物（每種核苷酸12.5mM），DNA聚合酶8μl（5UI/μl ），引物濃度按每反應體系50pmol加入超純水295μl；混合后分裝每反應管22μl，加入模板DNA3μl 。在PE480PCR擴增儀進行基因擴增。94℃預變性5min，94℃30sec，54℃45sec，65℃120sec，共完成45個循環，最后65℃5min延伸，PCR擴增產物置4℃冰箱中儲存。3)產物檢測分析：

每PCR反應管中加入載樣緩沖液3μl，吸取10μl加樣,用3%瓊脂糖凝膠（含0.5μg /ml，溴化乙啶）電泳，電壓8伏/cm，在紫外透射儀下觀察結果。

2 結果

2.1 染色體分析

在140例無患者中，發現19例患者染色體異常，異常率為13.57%，其中47，XXY14例，46，XY，del（Yq12）2例，46，XY，del（Yq）1例，46，XY，inv（9）2例。此外還發現4例患者Y染色體長臂明顯增大。80例嚴重少患者中未發現有染色體異常。

2.2 無基因檢測

2.2.1 在140例無患者中，除14例47，XXY患者未做無基因檢查外，其余全部進行8個基因位點的無基因測定。結果表明，有21例患者有AZF基因缺失，總缺失率為20.31%。其中2例sY84缺失，3例sY86缺失， 5例sY102缺失，6例sY134缺失、6例sY147缺失，15例sY153缺失，16例sY157缺失，4例RBM缺失。缺失率分別為1.59%、2.38%、3.79%、4.76%、4.76%、11.90%、12.70%和3.17%。AZFa、AZFb、AZFc、RBM缺失率分別為2.38%、4.76%、16.67%、3.17%。有3例同時存在AZFa、AZFb、AZFc缺失，有3例同時存在AZFb、AZFc缺失，15例為單純AZFc缺失，RBM基因缺失同時伴AZFc缺失。

2.2.2 在80例嚴重少患者中，有14例患者有AZF基因缺失，總缺失率為17.50%。其中AZFb區域1例sY102和sY134缺失，AZFc區域5例sY147缺失、11例sY153缺失、12例sY157缺失，1例RBM缺失。缺失率分別為1.25%、1.25%、7.50%、13.75%、15.00%、2.50%。未發現AZFa區域的sY84和sY86s缺失，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分別為1.25%和17.50%。

2.2.3 30例正常對照組未發現8種基因片段缺失；10例女性對照，8種引物未擴增出產物。

2.3 無癥患者精漿脫落細胞檢查

在126例無癥患者中，有23例患者檢查到有生精細胞，103例未見到生精細胞，21例AZF缺失患者中有4例中有生精細胞，占19.05%；105例無AZF缺失患者中有19例中有生精細胞，占18.09%。兩者無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

2.4 睪酮、黃體生成素、促卵泡刺激素水平

患者血清中T、LH、FSH激素平均濃度均在正常范圍，無癥患者血清中T、LH、FSH分別為（4.11±1.05）ng/ml、（9.91±6.23）mIU/ml、（10.27±8.25）mIU/ml；嚴重少癥患者血清中分別為（6.48±2.26）ng/ml、（10.45±5.61）mIU/ml 、（15.02±11.23）mIU/ml；AZF缺失患者分別為（5.04±1.34）ng/ml、（11.21±6.81）mIU/ml、（10.52±8.47）mIU/ml。除無癥T濃度明顯低于嚴重少癥（P

3 討論

引起無和嚴重少的原因很多，遺傳物質改變是其中主要因素，其中染色體異常約10%~15%，主要以47，XXY占絕大多數，還有一些結構異常，包括常染色體和性染色體。但是，性染色體數目異常和Y染色體與常染色體易位均表現有第二性征改變，常染色體和Y染色體部分缺失、增加一般副性征正常。本文無患者染色體異常發生頻率為13.57%，與文獻報道[1]相吻合。

自從Tiepolo[2]等人首次發現Y染色體長臂熒光區缺失的病人生成障礙后，一些學者對AZF的基因定位、構成和遺傳效應進行了大量的研究。Vergnaud[3]應用Y染色體DNA探針建立了人類Y染色體基因圖譜，將Y染色體分為7個區，長臂為5、6、7區。Ma[4]對50例無癥和嚴重少癥缺失部分進行DNA探針篩查時發現4例6區缺失，且不重疊，揭示AZF是一個基因家族。并首先提出RBM（最初稱YRRM）是無生成基因的候選基因。Vogt等[5]證實無因子（AZF）位于Yq11的第5、6區，這兩個區域有較多的控制發生的基因片段，分為AZFa、AZFb、AZFc三個區。目前資料報道，在無癥和嚴重少癥的患者中，有AZF缺失的約占3%~29%，它是染色體異常導致的無以外的第二個重要因素。

在我們的研究中，126例無癥有21例患者有AZF基因缺失，以AZFc缺失最多，缺失率高達16.67%。AZFa、AZFb、RBM缺失率較低，而且均伴有AZFc缺失。80例嚴重少患者中有14例患者有AZF基因缺失，主要以AZFc缺失為主，缺失率為17.50%，AZFb基因片段缺失僅為1.25%，而且未發現AZFa區域缺失。所以，Yq11的AZFb、AZFc區域的微基因缺失是引起無和嚴重少的主要原因。此外，我們的研究發現無癥和嚴重少癥中多數病例同時微缺失2個以上基因片段，說明AZF是個多基因的大家族，有許多不育基因與之有關。以往報道RBM基因族是無和嚴重少精的主要候選基因，RBM在AZFb區內，它的缺失對發生有影響。我們的結果是無中RBM缺失率僅占3.17%，而且，同時伴有AZFc缺失。本研究AZFa缺失很少，與以前報道的無與AZFa缺失有關不大一致，而主要是AZFc缺失,盡管我們對這個區域檢測的數量有限，但也提示AZFc區域的缺失導致生精障礙要比AZFb和AZFa區域缺失更常見，也有類似文獻報道[6]。

文獻資料表明[7]，睪酮是間質Leydig細胞產生的，除維持男性第二性征和的作用外，睪酮分泌減少將導致發生減緩。FSH主要促進生成和成熟，在青春期FSH可促進重量增加和曲細精管直徑增大。LH可刺激Leyig細胞合成和分泌睪酮，并將睪酮直接通過間質細胞作用于生精上皮細胞。我們對患者血清中激素水平測定結果表明，除無癥睪酮明顯低于嚴重少患者外，無、少和基因缺失患者的LH、FSH等激素水平均沒有明顯差異，沒有發現基因缺失與激素變化的關系。

Vogt[5]等并通過病人的組織分析發現，AZF基因缺失在同一區域，發生受阻也在同一時期。AZFb缺失表現為生殖細胞成熟障礙，內只見精原細胞和初級精母細胞，中無。AZFc的表現有兩種，可見精原、精母、精細胞、；僅見支持細胞，數量減少。我們對126例無患者進行脫落細胞檢查，發現僅有23例患者檢查到有生精細胞，103例未見到生精細胞，而且AZF缺失患者中有生精細胞人數和無AZF缺失患者中有生精細胞人數兩者無顯著差異。因此，AZF微缺失與無或少患者的表型效應關系需進一步探討。

我們的研究支持AZF區域微缺失與無之間有著因果關系，尤其是AZFc區的缺失的報道[8]。但是，大部分生成障礙尚未檢查出原因，可能受Yq11缺失多個基因位點影響，我們僅檢測了部分基因片段。此外，AZF的點突變也可能對生成有影響。因此，有關生成基因的課題尚待深入研究。鑒于染色體異常和AZF微缺失與無、少關系密切，遺傳學檢查對男性不育患者的病因診斷有著重要價值。

參考文獻

1 韓維田,曲鷗,孫曉玲,等.81例男性不育患者細胞遺傳學分析[J].中華醫學遺傳學雜志,1992，9（1）：40.

2 Tiepolo L & Zuffardi O. Location of factors conrtolling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm[J]. Hum Genet,1976, 34:119.

3 Henegariu O, Hirschmann P , Kilian K , et al. Rappid screening of the Y chromosome in idiopathic sterle men,diagnostic for deletions in AZF ,a genetic Y factor expressed during spermatogenesis[J]. Andrologia ,1994,26:97.

4 Ma K, Inglis JD & Sharkey A .A Y .chromosome gene family with RNA-binding protein homology:candidates for the azoospermia factor AZF contrlling spermatogenesis[J]. Cell,1993,75:1287.

5 Vogt PH, Edelman A , Kirsch S, et al. Human Y-chromosome azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yq11[J]. Hum Mol Genet, 1996, 5:933.

6 Yao G, Chen G, Pan T. Study of microdeletions in the Y chromosome of infertile men with idiopathic oligo- or azoospermia[J]. J Assist Reprod Genet , 2001,18(11):612.

7 黃宇烽,許瑞吉.男科診斷學[M].上海：第二軍醫大學出版社,1999，388.

篇3

關鍵詞：醫學遺傳學；教學方法；思維能力

中圖分類號：G642.1 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2013）42-0129-02

醫學遺傳學是遺傳學與醫學相結合的一門邊緣學科。隨著現代生物學和現代遺傳學研究的發展，醫學遺傳學成為醫學教育中的一門重要基礎課程，是基礎醫學與臨床醫學之間的橋梁課程。醫學遺傳學的研究對象是人類。人類遺傳學探討人類正常性狀與病理性狀的遺傳現象及其物質基礎。而醫學遺傳學則主要研究人類（包括個體和群體）病理性狀的遺傳規律及其物質基礎。醫學遺傳學通過研究人類疾病的發生發展與遺傳因素的關系，提供診斷、預防和治療遺傳病和與遺傳有關疾病的科學根據及手段，從而對改善人類健康素質作出貢獻。[1]筆者經過教學實踐，切身體會到，在醫學遺傳學教學中注重以下幾個方面的問題，可以取得較為理想的教學效果。

一、巧用啟發式教學，激發學生學習興趣

在講授中多提幾個“為什么”，往往能很好地開發學生的思維層次，當學生對這些問題產生興趣時，就會孜孜以求，全神貫注。

例如在講遺傳學緒論部分時，告訴同學在高考之前都要進行常規色盲的檢測，并出示幻燈片讓學生觀看，學生會看到一個色盲檢測的卡片動態圖，然后提出問題：“為什么高考的時候要做色盲測試呢？你們能辨認出色盲檢測卡片的數字嗎？色盲是否是遺傳病？色盲的致病基因是顯性還是隱性呢？色盲的致病基因是位于常染色體還是性染色體呢？”這一有趣的現象馬上會激起學生的興趣，這時告訴學生，解決問題的答案在本次課的講授內容，當然學生在以后的聽講中學習的主動性就會提高起來。又如在講授多基因遺傳與多基因病這一章節時，理論性較強，比較枯燥，學生往往覺得索然寡味，筆者結合新聞媒體及報紙上關于高血壓、糖尿病的發病率逐年上升而且年輕化的趨勢事件的報道，以及生活中經常見到痤瘡、小兒肥胖等癥狀，然后質疑：“為什么我國高血壓、糖尿病發病率比較高？這些疾病是由單個基因控制還是多個基因控制？會不會受到后天環境因素的限制？父母患此類疾病，子病風險如何？”學生往往對日常生活中出現的這一現象會滿懷興趣，這樣再介紹多基因遺傳與多基因病的概念，多基因遺傳特點，多基因病的遺傳特點，多基因病發病風險的估計時，學生的學習積極性就被充分調動起來，能更加透徹地理解所學的知識，加深印象。在近幾年教學實踐中，我體會到精選一些有趣的問題，可以很好地激發起學生對醫學遺傳學的興趣和學習的能動性，使學生從“要我學”轉變為“我要學”，不再認為學習是一種負擔。

二、在教學中注重學生思維能力的培養

學習知識的目的在于應用。在教學中教師不僅要教給學生知識，更重要的是要讓學生運用正確的思維方法去分析問題，解決問題，使知識和能力得到同步提高，這將有利于學生理解和了解遺傳學的基本概念和基本內容，培養學生的科學思維方法。[2]（1）培養學生的對照和比較能力。對相似又有聯系而又不完全相同的概念我們可以進行比較，找出他們的異同點，以澄清易混淆的概念，尋求概念的聯系和對相關概念的加強。如在不規則顯性遺傳中出現的表現度和外顯率這兩個概念，學生往往容易混淆，首先外顯率是指一定基因型個體形成一定表型的百分率。即某一顯性基因在雜合狀態下或純合隱性基因在一群體中得以表現的百分比；群體中如帶有某一致病基因的個體100%發病稱完全外顯，外顯率低于100%時，為不完全外顯或外顯不全。而表現度是指一定基因型所形成表型缺陷的嚴重程度。表現度不一致是指具有同樣基因型的個體，其表型缺陷嚴重程度有差異。如成骨不全患者家系中，有的患者僅有藍色鞏膜或骨折，有的有藍色鞏膜和骨折，有的有藍色鞏膜、骨折和耳聾。所以表現度要說明的是在致病基因已經表達的前提下表現的程度如何，是屬于“量”的問題；外顯率闡明基因表達與否，是屬于“質”的問題。通過這種比較就找出了兩者的區別，抓住了各自的特點。（2）培養學生的分析綜合能力。全面分析綜合是把事物各部分、各特性結合成一個整體，有利于對知識的理解以及復結。如染色體畸變根據畸變的類型不同，可分為兩大類即數目畸變與結構畸變，又可根據其特點對其進一步細分，引導學生找出它們的區別，作出圖表（圖1），在對知識的掌握以及以后的復習中就可以一目了然。（3）抓內因與外因關系，培養學生的科學思維能力。事物的發展是由內外因共同作用形成的，內因是根本，外因是條件。內因決定著事物的根本屬性，外因推動發展。任何孤立內外因的關系的說法都是錯誤的。利用內因與外因的關系有利于學生理解和了解遺傳學的基本概念和基本內容。我們知道多基因遺傳是指一種遺傳性狀或遺傳病受兩對或兩對以上基因的控制，每對基因彼此間沒有顯性和隱性的關系，每對基因對表型的效應都很小，但是各對基因的作用有積累效應，但是多基因性狀或遺傳病的形成除受微效基因影響外，也受環境因素的影響，所以這種遺傳方式稱為多基因遺傳或多因子遺傳，又稱復雜疾病。其中的決定遺傳形狀的多對微效基因也是我們所理解的內因，起著關鍵性的作用，而其中的環境因素也就是我們所理解的外因，則起著條件性的作用。這樣對多基因病的理解就更深入透徹。總之，啟發學生用正確的思維方法來學習，可以提高教學效率，事半功倍。

三、注重多媒體教學與傳統教學的結合

隨著多媒體技術的日漸成熟，多媒體的傳播技術已進入千家萬戶。這使得學校里一只粉筆，一張嘴的傳統教學手段顯得落伍了，多媒體課件應運而生。[3]如在講授醫學遺傳學的21三體綜合征這一章節時，在放映患兒圖片的同時附有視頻資料，就能增強學生對該遺傳病的感性認識，幫助學生理解和掌握，還可以為學生以后在臨床上進行遺傳病的診斷打下基礎，并由此引發學生的興趣，充分調動他們學習的主動性和積極性。計算機輔助教學系統已成為高校教學改革的熱點。盡管多媒體技術作為現代教學的重要手段正以它的優勢挑戰傳統的教學模式。但在使用多媒體的同時不應忽略傳統的教學手段，應使兩者相輔相成，取長補短，達到教學過程的最優化。傳統教學方式有著悠久的歷史和豐富的經驗，尤其是其以人為本的教學理念正是現代機器的盲點。教師在黑板上邊寫、邊畫、邊講解，某些公式和定理的推導過程、某些經典題目的解題過程，甚至可以把解決此問題時的思路和爭論融會在講解中，這樣才會引出學生對知識的興趣，才會將所學的知識消化、理解。教學效果會好得多。如在講授兩種單基因病的致病基因位于同一對同源染色體上的傳遞規律這一章節時。課本常通過舉例計算子病風險情況。以往教師主要對著多媒體課件來進行講解，往往是老師已講述很多遍，而學生仍未理解。現在通過教師親自板書演示整個演算推理的過程使其生動的展現在學生面前，再附以講解，就迅速地拉近了多媒體課件與學生之間的距離，使他們有了身臨其境的感受，情緒被充分地調動起來，從而增強了學生對兩種單基因性狀的獨立與聯合傳遞規律及發病風險的認識，學習興趣和積極性也被激發起來。多媒體教學和傳統板書的聯合應用，使得課堂教學形象化、生動化，提高了學生的學習興趣，學生對課堂所授內容的掌握率也大大提高。

四、注重將遺傳學的基礎理論與疾病案例相聯系

醫學遺傳學授課始終強調以疾病為中心，以遺傳為基礎，深刻理解遺傳與疾病的內在聯系。[4]因此在各類遺傳病教學時，引入臨床真實病例，不僅激發了學生學習興趣，而且使學生在分析討論過程中理解和鞏固基本概念、基礎理論，加深對疾病本質的認識。例如，我們在講授常染色體以及性染色體遺傳病時選取大量的真實病例，在課堂上引導學生逐步分析家系信息，使學生理解和掌握典型遺傳方式和延遲顯性、遺傳印記、早現遺傳等特殊現象。結合本教研室老教師多年收集積累的病案多媒體素材，包括遺傳性震顫、遺傳性共濟失調、舞蹈病、進行性肌營養不良、結腸息肉、18三體、貓叫綜合征、唐氏綜合征等多媒體，圖文并用，加大了課堂信息量，增加了直觀性。通過這種方式的教學，課堂教學質量高，教學效果明顯，得到學生好評。

五、以教學帶科研，科研促教學，教學科研互進

“在教學中研究”，更應該“在研究中教學”。[5]作為醫學遺傳學的一線高校教師，面對教學與科研的雙重任務。應該明確其中教學是最主要的任務，科研是為教學服務的任務。如果把科研理解為簡簡單單寫幾篇論文那還是膚淺的，教師只有針對教學實際問題而有所選擇地學習教育理論，且將自己的領悟應用于教學實踐中，自己的科研才能表現出其價值。脫離教學的科研是沒有生命力的。為此我時時將自己的科研成果滲透在教學中，具體我是這樣做的：首先，我在課堂教學中既講述前人的論述，也介紹自己在科研中形成的觀點。這樣，縮短了教師、教材、學生之間的距離，有利于激發學生的學習興趣，啟發學生獨立思維、培養學生分析能力與創新精神。其次，從自己的研究體會出發，引導學生進行相關課題研究。訓練學生做一個有心人，懂得如何圍繞選定的專題系統地收集、整理資料。比如講到單基因與多基因遺傳病時，我就向學生詳細闡述了基因治療的研究思路，例如血友病系X連鎖隱性遺傳病，通過轉基因的方法使患者持續表達缺失的凝血因子，那么患者的癥狀就會明顯改善。又如，糖尿病屬于多基因遺傳病，通常是由于患者體內胰島素含量絕對或者相對不足，疾病發展到后期，最終常需要借助于胰島素治療，而目前的干細胞與基因治療的結合使得糖尿病的根治成為可能，盡管目前還處于臨床前期的研究階段。

醫學遺傳學發展很快，新內容不斷增加。因此，教師既要把握好教學大綱所要求的基礎知識、基本理論的教學，同時又要引導學生了解學科進展，培養醫學生能準確有效地分析、診斷遺傳病的能力和較強的遺傳優生咨詢能力，因此教學中滲透現代教學理念，把傳統的以教師為中心的指令性課堂向以學生為主體的非指令性課堂轉換，把教師從單純傳授知識向培養學生學習能力轉換，加強與臨床病例的聯系，提高學生的醫學遺傳學素養，培養出高質量的醫學生，以嶄新的知識體系適應分子醫學的時代。[6，7]

參考文獻：

[1]蔡麗瓊.淺談醫學遺傳學教學的體會[J].安徽醫藥，2007，11，（7）：671-672.

[2]姜澤群，趙鳳鳴，詹秀琴，等.醫學遺傳學教學改革探索[J].中華醫學教育探索雜志，2012，11，（9）：937-939.

[3]曾新.醫學遺傳學教學實踐與課程建設[J].中國高等醫學教育，2005，6：55-56.

[4]張成寧，俞萍，祁鳴，等.醫學遺傳學課程建設淺析[J].中國高等醫學教育，2007，1：18-19.

[5]彭翠英，劉俊，.醫學遺傳學課程教學的思考[J].西北醫學教育，2012，20，（4）：739-741.

[6]劉鵬，張責寅，高佩琦，等.醫學遺傳學理論教學改革探析[J].中華醫學教育雜志，2008，28，（5）：29-30.

篇4

表觀遺傳修飾(epigenetic modification)，如DNA甲基化、組蛋白乙酰化和甲基化、RNA相關性沉默與細胞生長、分化、凋亡、轉化及腫瘤進展相關基因的轉錄密切相關。白血病的發生和發展與表觀遺傳修飾異常直接相關。本文綜述細胞周期調節基因甲基化，組蛋白翻譯后修飾異常及siRNA對白血病細胞的作用，為白血病治療提供新策略。

【關鍵詞】 表觀遺傳修飾； 白血病； 表觀遺傳學

Epigenetic Modification in Human Leukemia ——Editorial

Abstract Epigenetic modification，which involve DNA methylation，RNA-associated silencing and histone modification，is implicated in cell proliferation，differentiation，survival，apoptosis and malignant transformation. Some leukemogenesis has been shown to be aberrance of epigenetic modification. This paper discussed the potential causes of some of leukemias correlating with the methylation of cell cycle regulation genes，small interference RNA and modification abnormality of histone after translation. The study on epigenetic modification abnormality of leukemia cells provides a new strategy for treatment of leukemia.

Key words epigenetic modification; leukemia; epigenetics

表觀遺傳學（epigenetics）是指非基因序列改變所致基因表達水平的變化。表觀遺傳學研究基因表達變化，這種變化可通過減數分裂或/和有絲分裂遺傳，不涉及編碼的DNA序列改變，卻能引起基因表達水平的異常［1］。表觀遺傳修飾（epigenetics modification）包括三種調節性機制：DNA甲基化，RNA相關性沉寂和組蛋白翻譯后修飾，這些機制常與啟動和維持表觀遺傳沉寂有關［2］，三者不是孤立而是相互作用的。研究表明，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白乙酰化和甲基化等影響細胞生長調節、分化、凋亡、轉化以及腫瘤發展相關基因的轉錄等。白血病的發生和發展與表觀遺傳修飾異常密切相關。

目前認為白血病的發生是復雜的多步驟的，涉及與細胞增殖、分化、存活、基因組整合有關的原癌基因、腫瘤抑制基因和其他細胞內的重要基因。在器官和細胞水平，機體對細胞的轉化有內在的抵抗或保護作用，所以腫瘤的發生是多因素積累的結果。白血病是一組異質性疾病，除了細胞遺傳學變化外，還發現它們都存在一種或多種基因的失活，腫瘤抑制基因不能表達。因此，白血病的發生是細胞遺傳和表觀遺傳改變的結果。

DNA甲基化與白血病

DNA甲基化是表觀遺傳學上研究最深入的一種機制，是一種酶介導的化學修飾過程。在人類和大多數哺乳動物，DNA甲基化轉移酶（DNMT）以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到DNA上胞嘧啶5碳位置，形成CpG位點，富含CpG區域稱為CpG島。在大約40%的哺乳動物這些CpG島延伸到DNA的啟動子區域，導致穩定的可遺傳的轉錄沉寂，對基因表達有明顯抑制作用［3］。啟動子區域的CpG島甲基化能沉寂基因轉錄，在正常細胞中是一種調節基因表達的手段。然而抑制腫瘤生長的基因發生異常甲基化是在腫瘤早期就發生而且一直進行的，導致惡性腫瘤表型的表達。抑癌基因能被這種表觀遺傳機制沉寂。98種不同原發性人類腫瘤的基因組篩查揭示，在每種腫瘤平均存在600個異常CpG島甲基化位點［4］，很多甲基化CpG島存在于尚未確定的基因組區域，也許在腫瘤發生中扮演重要角色。

腫瘤抑制基因啟動子區域過甲基化常常是白血病/淋巴瘤發生的一種重要機制。白血病細胞周期異常、增殖失控與細胞周期蛋白異常表達或缺失相關。有學者研究發現，在78%的急性髓系白血病（AML）、67%的漿細胞疾病、46%的骨髓增生異常綜合征（MDS）、40%的急性淋巴細胞白血病（ALL）、13%的非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）存在p15INK4B（p15）基因高甲基化，在B細胞NHL存在p16INK4A（p16）的高甲基化。追蹤MDS進展發現，7例p15基因正常的早期患者隨疾病進展有5例發生了甲基化［5］。另一項研究顯示，7例p15基因正常的MDS轉化為白血病后5例發生了甲基化［6］。還有學者報道，153例NHL中低惡性的41例p16表達正常，71例高惡性者中41例全部或部分喪失p16的表達，而發生由低惡性向高惡性轉化的41例在轉化前p16表達正常，轉化后35例全部或部分喪失p16的表達［7］。Reddy等［8］研究蛋白酪氨酸磷酸酶基因SHP1、蛋白激酶基因SYK、細胞因子信號抑制因子基因SOCS1發現，在93%（119/130）的白血病/淋巴瘤和多發性骨髓瘤至少存在一種基因的甲基化，在100%的NHL和94%的白血病細胞株存在SHP1甲基化，SOCS1甲基化率達30%。應用去甲基化處理后可見到SHP1重新表達，STAT3磷酸化水平降低，結果提示細胞因子信號紊亂與這些基因甲基化沉默有關。細胞周期蛋白基因甲基化與細胞因子信號抑制因子基因甲基化導致其表達異常，白血病/淋巴瘤細胞增殖失控，MDS細胞惡性轉化，導致血液惡性腫瘤的發生。

不僅細胞周期蛋白和細胞因子信號抑制因子基因發生甲基化，白血病/淋巴瘤細胞促凋亡基因同樣也存在過甲基化，而在抗凋亡基因有低甲基化現象。Murai等［7］發現，在15%的急性淋巴細胞白血病、17%的急性髓細胞白血病、21%的多發性骨髓瘤病人存在促凋亡基因BNIP3基因位點的高甲基化，并且使該區域組蛋白乙酰化時也能直接促使該基因表達，因此作者認為，BNIP3基因的沉寂是該基因組DNA異常甲基化和組蛋白去乙酰化作用的結果。van Doorn等［9］在T細胞淋巴瘤中發現腫瘤抑制基因P73和凋亡相關基因BCL7a啟動子區域過甲基化，與DNA修復有關的腫瘤抑制基因失活，凋亡信號傳導異常而使細胞增殖失控。Nakatsuka等［10］在對白血病/淋巴瘤的研究中發現，促凋亡蛋白激酶DAP（death-associated protein）啟動子基因在B細胞白血病/淋巴瘤甲基化率為79.4%（27/34例），在T細胞和NK細胞白血病/淋巴瘤甲基化率為47.4%（9/19例）和62.5%（15/24例），并發現DNA甲基化程度高的白血病/淋巴瘤細胞均耐受凋亡誘導作用，聯合應用去甲基化處理則恢復對凋亡誘導的敏感性。Chen等［11］應用DMBA誘導小鼠口腔鱗狀細胞癌的實驗中發現，DMBA處理組抗凋亡蛋白survivin明顯表達，mRNA合成增加，在藥物未處理組則未測到。同時發現在DMBA未處理組，survivin基因高甲基化，而DMBA處理組未發現survuvin基因甲基化，表明survivin的表達是通過表觀遺傳機制控制的。這些研究說明表觀遺傳修飾異常是白血病發生發展的一種重要機制。

組蛋白乙酰化轉移酶和去乙酰化酶與

白血病

一些證據表明組蛋白乙酰化轉移酶（HAT）具有腫瘤抑制功能。如果HAT活性缺失或失調可能導致癌癥的發生。在許多類型的癌癥中，編碼HAT的基因發生易位、擴增、過表達和突變。在已知的HAT中，P300和CBP認為是腫瘤抑制因子。P300和CBP基因分別位于16p13和22q13，在白血病或治療相關性MDS中表現染色體移位、重排。在80%的惡性角質瘤和急性白血病中發現P300的雜合性缺失。在急性髓細胞白血病（AML），因t（8；16）（p11；p13）染色體異常使CBP移位，并和乙酰化酶基因MOZ或同源盒基因MLL融合，在此兩種融合蛋白中，CBP的HAT結構域保持完整。在另一種AML中，t（11；22）（q23；q13）異常導致P300基因重排。MLL基因位于11q23，分別和P300、CBP形成t（11；22）（q23；q13）、t（11；16）（q23；p13）移位融合基因，產生MLL-P300和MLL-CBP融合蛋白。這些染色體異常證明，HAT錯誤靶向的乙酰化在白血病發生的原因方面起重要作用。在小鼠中發現MLL-CBP融合蛋白能形成MDS綜合征，并進展為髓性白血病［12］。CBP的嗅結構和乙酰化酶活性區域是致白血病必須的，認為MLL的N端部分直接被CBP乙酰化導致白血病的發生。MLL-CBP的潛在靶點是HOX基因家族，可能導致這些基因異常表達，引起白血病［13］。

組蛋白去乙酰化酶（HDAC）參與癌癥發展的證據來源于急性早幼粒細胞性白血病中的融合蛋白PML-RARα和PLZF-RARα，利用融合蛋白中的RARα部分，PML和PLZF募集組蛋白去乙酰化酶復合物至維甲酸（RA）受體α的靶基因阻抑轉錄和細胞分化。在t（8；21）M2b白血病中，AML1-ETO失去了AML1作為調控造血和細胞周期轉錄因子的功能，它們招募組蛋白去乙酰化酶復合體作用于AML1靶基因，抑制AML1介導的轉錄活性。AML1-ETO融合蛋白中ETO的CRD功能域介導的轉錄抑制活性占到50%左右，主要通過與mSin3A結合而起作用 ［14］。因此，AML1-ETO致髓系細胞分化受阻和白血病轉化作用可能是通過如下模式實現的：AML1-ETO仍與DNA上的AML1特異序列結合，但與野生型AML1不同，融合蛋白AML1-ETO不能啟動P300/CBP引導的組蛋白乙酰化和轉錄激活。相反，通過融合蛋白中ETO的鋅指結構域，AML1-ETO募集N-CoR和HDAC，使該復合物持久地固定于AML1反應基因的啟動子區，維持該區的組蛋白去乙酰化構象，DNA和轉錄復合體不能接近，主動阻抑分化基因轉錄［15］。

組蛋白修飾與白血病

組蛋白修飾是表觀遺傳學修飾的另一機制，包括組蛋白乙酰化修飾和甲基化修飾。組蛋白賴氨酸的N端乙酰化或去乙酰化修飾改變著核小體的結構，組蛋白中去乙酰化的賴氨酰帶正電荷，被吸引到帶負電荷的DNA中，產生一種緊密的染色質結構，抑制轉錄。另一方面，組蛋白乙酰化酶使賴氨酰乙酸化移走它們的正電荷，從而導致開放的染色質結構，加速基因轉錄。HDAC從賴氨酸移走乙酰基，可以逆轉這一過程從而抑制轉錄。核小體中組蛋白的異常去乙酰化可能與HDAC專一性的錯誤調節有關，也與腫瘤轉化相關。組蛋白中賴氨酸被特異性組蛋白甲基化轉移酶甲基化，一方面核小體中組蛋白 H3的賴氨酸 4甲基化與染色質開放構象和基因表達相關；另一方面，組蛋白 H3中賴氨酸 9的甲基化與染色質的濃縮和轉錄抑制相關。這種組蛋白甲基化修飾和組蛋白乙酰化及去乙酰化對基因表達的影響稱作組蛋白密碼［16］，與基因轉錄表達相關，異常時與腫瘤發生有關。

人類hDoT1L基因和AF10（一種與MLL和AML有關的融合蛋白）結合，通過AF10的OM-LZ區域介導MLL白血病的發生，MLL-hDoT1L和MLL-AF10介導的白血病細胞轉化，導致一系列白血病相關基因的上調，并伴有組蛋白H3 K79的高甲基化［17］。MLL蛋白具有組蛋白H3甲基化轉移酶活性，可以通過直接結合或使Hox基因甲基化而調節Hox表達，在白血病細胞轉化和發生中有重要作用［18］。Lukasova等［19］研究CML的表觀遺傳學發現，CML患者的粒細胞存在不同程度的組蛋白H3甲基化現象，在CML加速期和白血病期，組蛋白H3甲基化作用明顯增強。在CML慢性期，組蛋白甲基化水平、疾病進展和用藥方式沒有明顯相關性，甚至在“治愈”的患者仍可見到組蛋白H3甲基化現象，提示在這些患者粒細胞的染色質變構調節是不完全的。白血病細胞組蛋白H3甲基化現象提示其染色質濃縮的不完整性，可能與白血病細胞增殖、疾病預后和復發有重要相關性。

人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因在正常分化細胞是失活的，而在腫瘤細胞被再激活。研究在細胞分化過程中hTERT啟動子活性減低的機制，發現是由于hTERT啟動子基因進行性的組蛋白低乙酰化和甲基化積累的結果［20］，說明細胞進化過程中表觀遺產修飾的復雜性，低乙酰化和高甲基化對維持細胞正常功能也是必須的。在急性早幼粒細胞白血病細胞，PML-RARα移位基因產生的融合蛋白募集DNA甲基化轉移酶到分化基因啟動子靶點誘導該基因高甲基化和沉默。這種高甲基化作用與白血病發生直接相關，維甲酸處理后顯示啟動子基因去甲基化，分化基因在表達，白血病表型逆轉［21］。這個研究結果提示在白血病細胞轉化過程中，遺傳學異常和表觀遺傳學異常是互相聯系的，而表觀遺傳學的積累對白血病發生的早期階段是至關重要的。

RNA相關性沉默與白血病

RNA沉默（RNA silencing）是一種在真核生物體內普遍存在的、發生在RNA水平的、基于核酸序列特異性的相互作用來抑制基因表達的調控機制，在動物中稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。雙鏈（ds）RNA是RNA沉默起始的關鍵分子，dsRNA首先被降解為不同長度的小RNA，其中具有21-26個堿基的雙鏈小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）在介導對病毒、轉基因和轉座子等外來入侵核酸序列特異性的RNA降解，在防御病毒感染和監視外來核酸中起重要作用［22］。RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制，高效抑制基因表達，能封閉病毒生存和繁殖所必需的基因，產生抗病毒效應。RNAi與白血病發病關系的研究未見報道，推測在與病毒密切相關的白血病/淋巴瘤的發病中應存在RNAi機制缺陷，未能對入侵的核酸分子（如HTLV，EBV，C型病毒等）起到應有的作用，而使這些外來核酸分子復制整合導致惡性血液病的發生。

RNAi對白血病實驗性治療已有報道。Wohlbold等［23］應用bcr/abl斷裂融合點基因設計的siRNA能明顯減少bcr/abl蛋白表達，對抗bcr/abl蛋白的生化特性，能選擇性抑制依賴bcr/abl的細胞的生長，而且bcr/abl同源的siRNA能增加伊馬替尼對bcr/abl陽性細胞的敏感性。Cioca等［24］應用C-raf 和bcl-2基因設計的dsRNA轉染入HL-60，U937，THP-1和K562細胞，結果均可以降低C-raf 和Bcl-2蛋白表達，誘導這些細胞的凋亡和增加其對伊托泊甙及柔紅霉素化療的敏感性。Heidenreich等［25］應用靶向AML1-MTG8位點的siRNA，能明顯減低AML1-MTG8蛋白水平而不影響野生型AML1的活性。McCarthy等［26］設計IL-10的siRNA作用于CLL 的B-1細胞株LNC，顯示降低IL-10的表達，使LNC細胞阻滯在G2/M期，有效地誘導LNC細胞凋亡。siRNA作為一種使異常基因沉默的理想靶點，其有效性得到公認，但還需進一步深入研究。

盡管多數腫瘤是克隆性起源，但同種或同類腫瘤間巨大的異質性提示腫瘤的發生是遺傳因素、表觀遺傳因素和微環境的選擇性壓力聯合作用的結果。表觀遺傳修飾在腫瘤相關基因表達中的重要性逐漸被重視，對白血病細胞表觀遺傳學異常的研究將為白血病的治療提供新的策略。

【參考文獻】

Epigenetic Modification in Human Leukemia ——Editorial

CHEN Yan，LI Xin-Gang

Institute of Hematology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Abstract Epigenetic modification，which involve DNA methylation，RNA-associated silencing and histone modification，is implicated in cell proliferation，differentiation，survival，apoptosis and malignant transformation. Some leukemogenesis has been shown to be aberrance of epigenetic modification. This paper discussed the potential causes of some of leukemias correlating with the methylation of cell cycle regulation genes，small interference RNA and modification abnormality of histone after translation. The study on epigenetic modification abnormality of leukemia cells provides a new strategy for treatment of leukemia.

Key words epigenetic modification; leukemia; epigenetics

表觀遺傳學（epigenetics）是指非基因序列改變所致基因表達水平的變化。表觀遺傳學研究基因表達變化，這種變化可通過減數分裂或/和有絲分裂遺傳，不涉及編碼的DNA序列改變，卻能引起基因表達水平的異常［1］。表觀遺傳修飾（epigenetics modification）包括三種調節性機制：DNA甲基化，RNA相關性沉寂和組蛋白翻譯后修飾，這些機制常與啟動和維持表觀遺傳沉寂有關［2］，三者不是孤立而是相互作用的。研究表明，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白乙酰化和甲基化等影響細胞生長調節、分化、凋亡、轉化以及腫瘤發展相關基因的轉錄等。白血病的發生和發展與表觀遺傳修飾異常密切相關。

目前認為白血病的發生是復雜的多步驟的，涉及與細胞增殖、分化、存活、基因組整合有關的原癌基因、腫瘤抑制基因和其他細胞內的重要基因。在器官和細胞水平，機體對細胞的轉化有內在的抵抗或保護作用，所以腫瘤的發生是多因素積累的結果。白血病是一組異質性疾病，除了細胞遺傳學變化外，還發現它們都存在一種或多種基因的失活，腫瘤抑制基因不能表達。因此，白血病的發生是細胞遺傳和表觀遺傳改變的結果。

DNA甲基化與白血病

DNA甲基化是表觀遺傳學上研究最深入的一種機制，是一種酶介導的化學修飾過程。在人類和大多數哺乳動物，DNA甲基化轉移酶（DNMT）以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到DNA上胞嘧啶5碳位置，形成CpG位點，富含CpG區域稱為CpG島。在大約40%的哺乳動物這些CpG島延伸到DNA的啟動子區域，導致穩定的可遺傳的轉錄沉寂，對基因表達有明顯抑制作用［3］。啟動子區域的CpG島甲基化能沉寂基因轉錄，在正常細胞中是一種調節基因表達的手段。然而抑制腫瘤生長的基因發生異常甲基化是在腫瘤早期就發生而且一直進行的，導致惡性腫瘤表型的表達。抑癌基因能被這種表觀遺傳機制沉寂。98種不同原發性人類腫瘤的基因組篩查揭示，在每種腫瘤平均存在600個異常CpG島甲基化位點［4］，很多甲基化CpG島存在于尚未確定的基因組區域，也許在腫瘤發生中扮演重要角色。

腫瘤抑制基因啟動子區域過甲基化常常是白血病/淋巴瘤發生的一種重要機制。白血病細胞周期異常、增殖失控與細胞周期蛋白異常表達或缺失相關。有學者研究發現，在78%的急性髓系白血病（AML）、67%的漿細胞疾病、46%的骨髓增生異常綜合征（MDS）、40%的急性淋巴細胞白血病（ALL）、13%的非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）存在p15INK4B（p15）基因高甲基化，在B細胞NHL存在p16INK4A（p16）的高甲基化。追蹤MDS進展發現，7例p15基因正常的早期患者隨疾病進展有5例發生了甲基化［5］。另一項研究顯示，7例p15基因正常的MDS轉化為白血病后5例發生了甲基化［6］。還有學者報道，153例NHL中低惡性的41例p16表達正常，71例高惡性者中41例全部或部分喪失p16的表達，而發生由低惡性向高惡性轉化的41例在轉化前p16表達正常，轉化后35例全部或部分喪失p16的表達［7］。Reddy等［8］研究蛋白酪氨酸磷酸酶基因SHP1、蛋白激酶基因SYK、細胞因子信號抑制因子基因SOCS1發現，在93%（119/130）的白血病/淋巴瘤和多發性骨髓瘤至少存在一種基因的甲基化，在100%的NHL和94%的白血病細胞株存在SHP1甲基化，SOCS1甲基化率達30%。應用去甲基化處理后可見到SHP1重新表達，STAT3磷酸化水平降低，結果提示細胞因子信號紊亂與這些基因甲基化沉默有關。細胞周期蛋白基因甲基化與細胞因子信號抑制因子基因甲基化導致其表達異常，白血病/淋巴瘤細胞增殖失控，MDS細胞惡性轉化，導致血液惡性腫瘤的發生。

不僅細胞周期蛋白和細胞因子信號抑制因子基因發生甲基化，白血病/淋巴瘤細胞促凋亡基因同樣也存在過甲基化，而在抗凋亡基因有低甲基化現象。Murai等［7］發現，在15%的急性淋巴細胞白血病、17%的急性髓細胞白血病、21%的多發性骨髓瘤病人存在促凋亡基因BNIP3基因位點的高甲基化，并且使該區域組蛋白乙酰化時也能直接促使該基因表達，因此作者認為，BNIP3基因的沉寂是該基因組DNA異常甲基化和組蛋白去乙酰化作用的結果。van Doorn等［9］在T細胞淋巴瘤中發現腫瘤抑制基因P73和凋亡相關基因BCL7a啟動子區域過甲基化，與DNA修復有關的腫瘤抑制基因失活，凋亡信號傳導異常而使細胞增殖失控。Nakatsuka等［10］在對白血病/淋巴瘤的研究中發現，促凋亡蛋白激酶DAP（death-associated protein）啟動子基因在B細胞白血病/淋巴瘤甲基化率為79.4%（27/34例），在T細胞和NK細胞白血病/淋巴瘤甲基化率為47.4%（9/19例）和62.5%（15/24例），并發現DNA甲基化程度高的白血病/淋巴瘤細胞均耐受凋亡誘導作用，聯合應用去甲基化處理則恢復對凋亡誘導的敏感性。Chen等［11］應用DMBA誘導小鼠口腔鱗狀細胞癌的實驗中發現，DMBA處理組抗凋亡蛋白survivin明顯表達，mRNA合成增加，在藥物未處理組則未測到。同時發現在DMBA未處理組，survivin基因高甲基化，而DMBA處理組未發現survuvin基因甲基化，表明survivin的表達是通過表觀遺傳機制控制的。這些研究說明表觀遺傳修飾異常是白血病發生發展的一種重要機制。

組蛋白乙酰化轉移酶和去乙酰化酶與

白血病

一些證據表明組蛋白乙酰化轉移酶（HAT）具有腫瘤抑制功能。如果HAT活性缺失或失調可能導致癌癥的發生。在許多類型的癌癥中，編碼HAT的基因發生易位、擴增、過表達和突變。在已知的HAT中，P300和CBP認為是腫瘤抑制因子。P300和CBP基因分別位于16p13和22q13，在白血病或治療相關性MDS中表現染色體移位、重排。在80%的惡性角質瘤和急性白血病中發現P300的雜合性缺失。在急性髓細胞白血病（AML），因t（8；16）（p11；p13）染色體異常使CBP移位，并和乙酰化酶基因MOZ或同源盒基因MLL融合，在此兩種融合蛋白中，CBP的HAT結構域保持完整。在另一種AML中，t（11；22）（q23；q13）異常導致P300基因重排。MLL基因位于11q23，分別和P300、CBP形成t（11；22）（q23；q13）、t（11；16）（q23；p13）移位融合基因，產生MLL-P300和MLL-CBP融合蛋白。這些染色體異常證明，HAT錯誤靶向的乙酰化在白血病發生的原因方面起重要作用。在小鼠中發現MLL-CBP融合蛋白能形成MDS綜合征，并進展為髓性白血病［12］。CBP的嗅結構和乙酰化酶活性區域是致白血病必須的，認為MLL的N端部分直接被CBP乙酰化導致白血病的發生。MLL-CBP的潛在靶點是HOX基因家族，可能導致這些基因異常表達，引起白血病［13］。

組蛋白去乙酰化酶（HDAC）參與癌癥發展的證據來源于急性早幼粒細胞性白血病中的融合蛋白PML-RARα和PLZF-RARα，利用融合蛋白中的RARα部分，PML和PLZF募集組蛋白去乙酰化酶復合物至維甲酸（RA）受體α的靶基因阻抑轉錄和細胞分化。在t（8；21）M2b白血病中，AML1-ETO失去了AML1作為調控造血和細胞周期轉錄因子的功能，它們招募組蛋白去乙酰化酶復合體作用于AML1靶基因，抑制AML1介導的轉錄活性。AML1-ETO融合蛋白中ETO的CRD功能域介導的轉錄抑制活性占到50%左右，主要通過與mSin3A結合而起作用 ［14］。因此，AML1-ETO致髓系細胞分化受阻和白血病轉化作用可能是通過如下模式實現的：AML1-ETO仍與DNA上的AML1特異序列結合，但與野生型AML1不同，融合蛋白AML1-ETO不能啟動P300/CBP引導的組蛋白乙酰化和轉錄激活。相反，通過融合蛋白中ETO的鋅指結構域，AML1-ETO募集N-CoR和HDAC，使該復合物持久地固定于AML1反應基因的啟動子區，維持該區的組蛋白去乙酰化構象，DNA和轉錄復合體不能接近，主動阻抑分化基因轉錄［15］。

組蛋白修飾與白血病

組蛋白修飾是表觀遺傳學修飾的另一機制，包括組蛋白乙酰化修飾和甲基化修飾。組蛋白賴氨酸的N端乙酰化或去乙酰化修飾改變著核小體的結構，組蛋白中去乙酰化的賴氨酰帶正電荷，被吸引到帶負電荷的DNA中，產生一種緊密的染色質結構，抑制轉錄。另一方面，組蛋白乙酰化酶使賴氨酰乙酸化移走它們的正電荷，從而導致開放的染色質結構，加速基因轉錄。HDAC從賴氨酸移走乙酰基，可以逆轉這一過程從而抑制轉錄。核小體中組蛋白的異常去乙酰化可能與HDAC專一性的錯誤調節有關，也與腫瘤轉化相關。組蛋白中賴氨酸被特異性組蛋白甲基化轉移酶甲基化，一方面核小體中組蛋白 H3的賴氨酸 4甲基化與染色質開放構象和基因表達相關；另一方面，組蛋白 H3中賴氨酸 9的甲基化與染色質的濃縮和轉錄抑制相關。這種組蛋白甲基化修飾和組蛋白乙酰化及去乙酰化對基因表達的影響稱作組蛋白密碼［16］，與基因轉錄表達相關，異常時與腫瘤發生有關。

人類hDoT1L基因和AF10（一種與MLL和AML有關的融合蛋白）結合，通過AF10的OM-LZ區域介導MLL白血病的發生，MLL-hDoT1L和MLL-AF10介導的白血病細胞轉化，導致一系列白血病相關基因的上調，并伴有組蛋白H3 K79的高甲基化［17］。MLL蛋白具有組蛋白H3甲基化轉移酶活性，可以通過直接結合或使Hox基因甲基化而調節Hox表達，在白血病細胞轉化和發生中有重要作用［18］。Lukasova等［19］研究CML的表觀遺傳學發現，CML患者的粒細胞存在不同程度的組蛋白H3甲基化現象，在CML加速期和白血病期，組蛋白H3甲基化作用明顯增強。在CML慢性期，組蛋白甲基化水平、疾病進展和用藥方式沒有明顯相關性，甚至在“治愈”的患者仍可見到組蛋白H3甲基化現象，提示在這些患者粒細胞的染色質變構調節是不完全的。白血病細胞組蛋白H3甲基化現象提示其染色質濃縮的不完整性，可能與白血病細胞增殖、疾病預后和復發有重要相關性。

人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因在正常分化細胞是失活的，而在腫瘤細胞被再激活。研究在細胞分化過程中hTERT啟動子活性減低的機制，發現是由于hTERT啟動子基因進行性的組蛋白低乙酰化和甲基化積累的結果［20］，說明細胞進化過程中表觀遺產修飾的復雜性，低乙酰化和高甲基化對維持細胞正常功能也是必須的。在急性早幼粒細胞白血病細胞，PML-RARα移位基因產生的融合蛋白募集DNA甲基化轉移酶到分化基因啟動子靶點誘導該基因高甲基化和沉默。這種高甲基化作用與白血病發生直接相關，維甲酸處理后顯示啟動子基因去甲基化，分化基因在表達，白血病表型逆轉［21］。這個研究結果提示在白血病細胞轉化過程中，遺傳學異常和表觀遺傳學異常是互相聯系的，而表觀遺傳學的積累對白血病發生的早期階段是至關重要的。

RNA相關性沉默與白血病

RNA沉默（RNA silencing）是一種在真核生物體內普遍存在的、發生在RNA水平的、基于核酸序列特異性的相互作用來抑制基因表達的調控機制，在動物中稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。雙鏈（ds）RNA是RNA沉默起始的關鍵分子，dsRNA首先被降解為不同長度的小RNA，其中具有21-26個堿基的雙鏈小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）在介導對病毒、轉基因和轉座子等外來入侵核酸序列特異性的RNA降解，在防御病毒感染和監視外來核酸中起重要作用［22］。RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制，高效抑制基因表達，能封閉病毒生存和繁殖所必需的基因，產生抗病毒效應。RNAi與白血病發病關系的研究未見報道，推測在與病毒密切相關的白血病/淋巴瘤的發病中應存在RNAi機制缺陷，未能對入侵的核酸分子（如HTLV，EBV，C型病毒等）起到應有的作用，而使這些外來核酸分子復制整合導致惡性血液病的發生。

篇5

一般意義上的遺傳學指基于DNA序列改變導致基因表達水平的變化,如基因突變、基因雜合丟失和微星不穩定等,表觀遺傳學指非DNA序列改變,是細胞內除了遺傳信息以外的其它可遺傳物質發生的改變。表觀遺傳學研究主要包括染色體重塑、組蛋白修飾,DNA甲基化,非編碼RNA調控等。

真核細胞的特征是有細胞核,細胞核包含了真核生物幾乎所有的遺傳物質。真核生物基因組DNA儲存在細胞核內的染色質中,核小體( nucleosome) 是構成真核生物染色體的基本結構單位。各核小體串聯而成染色質纖維,核小體DNA長度約為165個堿基對,其中纏結在組蛋白八聚體周圍的核心DNA( core DNA) 約1. 65圈,約合147個堿基對,而相鄰的核小體之間的自由區域( linber DNA) 為20 - 50個堿基的長度,也就是基因組的75% ~ 90% 被核小體所占據。組蛋白八聚體由H2A、H2B、H3和H4各2個拷貝組成,每個核心組蛋白都有兩個結構域: 組蛋白的球形折疊區和氨基末端結構像一條尾巴( tail) 位于核小體的球形結構以外,可同其它調節蛋白和DNA發生相互作用,染色體的高級結構和基因的轉錄調控都與組蛋白密切相關。核小體組蛋白的尾巴可以發揮信號位點的作用。

上面已談到表觀遺傳學是指非DNA序列改變,而是改變染色質結構導致基因表達水平的變化。那么,染色質結構改變如何導致基因轉錄和表達水平改變的呢?

其一,在細胞里,DNA-染色質的形式存在,核小體是染色質的基本結構單位,75% ~ 90% 的基因組存在其中,核心組蛋白的尾巴的各種位點通過多種轉移酶的作用,發生共價修飾,組蛋白通過電荷相互作用( 組蛋白尾巴帶正電荷,DNA帶負電荷) 如組蛋白乙酰化修飾可以通過電荷中和方式削弱組蛋白-DNA或核小體 - 核小體的相互作用,或引起構象的變化,破壞核小體結構,使DNA接近轉導機構,激活轉錄。

其二,為保證染色質的DNA與蛋白質的動態結合,細胞內產生了一系列特定的染色體重塑復合物,也稱重塑子,它們利用水解ATP的能量通過滑動、重建、移除核小體等方式改變組蛋白與DNA結合狀態,使蛋白質易于接近目標DNA。依據重塑子包含的ATP酶中催化亞基結構域的不同,把重塑子分為SWI/SNF、ISWI、CHD、IN080四大家族。組蛋白修飾后如乙酰化的組蛋白可以募集轉錄復合物進入到一個基因位點,影響轉錄。

2 認知過程中的表觀遺傳學機制

通過新信息或經驗獲得的記憶可保持數月、數年,甚至終生,而長時間保持存活的蛋白質或mRNA的半衰期只有24 h,顯然,二者之間存在很大的矛盾,那么記憶的物質基礎到底是什么? 1984年,Crick提出了一個假設,即記憶編碼在染色體的DNA上,雖然當時他并不是十分確信,但現已澄清,染色體是信息的攜帶者,而且可以代代傳下去,染色體結構或化學上的改變與認知功能的關系可作如下的理解: 表觀遺傳學的改變是對來到大腦的信息、應激和神經元活性改變做出結構上的適應,最終將信息帶至并激活特異性基因表達程序。目前研究證明,在腦的一些區域發生的表觀遺傳學改變如組蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化可以穩定地改變動物的行為,包括學習、記憶、抑郁、藥物依賴、突觸可塑性等等,為長記憶的形成、鞏固和突觸可塑性的形成、維持提供解釋[5,6,7,8]。

閱讀近十幾年發表的有關表觀遺傳學文章后,解決了長期以來認知過程中令人費解的一些問題,本文著重介紹在腦的不同區域( 主要是海馬和腦皮層) 組蛋白修飾和DNA甲基化在認知過程中的作用及其可能的機制。

2. 1組蛋白乙酰化[9,10,11]一系列表觀遺傳學改變都能影響記憶過程,其中組蛋白乙酰化,具有明確、顯著地促進記憶的形成和鞏固。組 蛋白乙酰 化是通過 組蛋白乙 酰化酶( HATs) 催化完成的。HATs將帶正電荷的乙酰基轉移到組蛋白N末端尾區內賴氨酸側鏈的-氨基。組蛋白乙酰化酶被分成3個主要家族: GNAT超家族,MYST家族和P300 /CBP家族。將乙酰基從組蛋白移走,由組蛋白去乙酰化酶( HDACs) 催化完成,HDACs被分成4類: Ⅰ類,鋅依賴型HDACs,Ⅱ類和Ⅳ類HDACs,Ⅲ類NAD依賴性HDACs。在哺乳動物中,海馬在記憶形成中起重要作用。許多學者以海馬區域作為研究對象,研究了組蛋白乙酰化對條件性恐懼中的背景記憶( contextual memory) 和空間記憶的影響。研究證明組蛋白乙酰化或抑制HDACs活性都能增強條件性恐懼中的背景記憶和Morris水迷宮中的空間記憶以及增加突觸可塑性( synaptic plasticity) 。應當指出的是,腦中組蛋白乙酰化不是獨立于其它組蛋白修飾而存在,而是在組蛋白乙酰化的同時,也往往存在組蛋白磷酸化、甲基化。組蛋白乙酰化削弱了組蛋白與DNA之間的靜電親和力,從而促進染色體結構接近轉錄基因機構,引起基因持續性改變,增加神經元活動,乙酰化修 飾后的組 蛋白也可 以募集其 它相關因子[10,11,12,13],如轉錄復合物,進入到基因位點,影響轉錄。

2. 2 組蛋白乙酰化的調節機制[14,15,16]

2. 2. 1神經元活性與組蛋白乙酰化組蛋白乙酰化可由許多類型的神經元活性所調節,例如,KCl介導的神經元去極化引起海馬培養中的核心組蛋白H2B乙酰化的增加,再如,特異性受體激動劑可興奮多巴胺能、乙酰膽堿能、谷氨酸能途徑,增加小鼠海馬H3K14和H3S10的乙酰化,在所有這些情況下,組蛋白乙酰化都伴有細胞外調節激酶ERK( MAPK家族中的一員) 的激活,直接激活MAPK-ERK信號途徑可增加組蛋白乙酰化,而MAPK-ERK抑制劑則可阻斷組蛋白乙酰化[16,17,18],這些研究表明,神經元活性引起組蛋白乙酰化是通過MAPK依賴性途徑的激活,而且也可能是通過H3S10磷酸化之間的對話。后者常與在蛋白乙酰化同時存在,從染色體脫離的HPAC2引起的神經活性,也能改變組蛋白的乙酰化,用BDNF刺激皮層神經元,能引起HDAC2在胞嘧啶262和274位的硝基化及隨后組蛋白的高乙酰化及隨后組蛋白的乙酰化,并伴有神經營養因子依賴性基因表達的增強。已知MECP2可增加BDNF的表達,但被HDAC2負面調節。因此,神經活性參與了以HDAC2和BDNF為中心的正性反饋,該系統導致組蛋白乙酰化和基因自身的持續表達。

2. 2. 2突觸可塑性與組蛋白乙酰化長時程突觸可塑性涉及突觸維持和交流有關基因表達的改變,已有充分材料證明,組蛋白乙酰化促進這一改變,例如在海兔( Aplysia) 組蛋白乙酰化能誘導長期易化 ( LTF) 并伴有CREB結合蛋白CBP的增加[19],類似的改變也在突觸素( synapsin) 的啟動子區域觀察到,突觸素與LTF和LTD均有關。不過,伴有CREB乙酰化的減少,正常情況下,誘導LTF需施加強電刺激,但如果提前給予RNA干擾( RNAi) ,弱的電刺激也能誘導LTF。這一發現提示,組蛋白乙酰化程度與突觸可塑性程度密切相關,HDAC1能增加天然存在的突觸傳遞過程,在哺乳動物的LTP也與組蛋白乙酰化水平有關。LTP誘導可平行出現H3和H4組蛋白乙酰化的增加,從研究中還明顯看出LTP促進乙酰化,改變特異地存在于與突觸傳遞有關基因如Reelin和BDNF啟動子區域,這一結果與前述看法一致,即在組蛋白乙酰化過程中存在一個基因自身持續性改變的正性反饋系統。此外,有關HATCBP的研究表明,增加組蛋白乙酰化能促進LTP,部分或完全缺失CBP功能的小鼠出現組蛋白乙酰化水平的下降和LTP形成受阻。不過,不依賴轉錄的早期LTP不受影響。

2. 2. 3記憶形成與組蛋白乙酰化[20,21]在低等生物和哺乳動物進行的研究證明,不管哪種記憶類型或哪種記憶時相( 記憶獲得,鞏固和再現) 都能對組蛋白乙酰化進行調節,例如背景性和線索性恐懼記憶( fear memory contextual and fearmemory cued) 都能增加H3乙酰化,小鼠眨眼條件反射( eyeblink conditioning) 和大鼠潛伏抑制 ( latent inhibition) 能分別增加組蛋白H3和H4乙酰化,大小鼠物體識別記憶( Objectrecognition memory) 伴有H3和H4乙酰化的增加,此外優先食物轉換( social transmission of food preference) 和食物厭惡記憶( food aversion memory) 等均能增加H3乙酰化,空間記憶( spatial memory) 伴有H2B,H3和H4乙酰化。

從上述組蛋白乙酰化研究的論述可得出以下幾點結論:

( 1) 組蛋白乙酰化,不是脫離開其它組蛋白修飾而獨立存在,即在發生組蛋白乙酰化的同時,也有組蛋白磷酸化、甲基化等的發生,其它表觀遺傳學改變對組蛋白乙酰化起了協同作用。

( 2) 神經元活性可調節組蛋白乙酰化,神經元活性的啟動需要MAPK-ERK信號途徑的激活。

長記憶和突觸長時程增強均涉及許多基因的轉導和表達,最常見和最重要的基因包括即早基因Zif/268,Creb,Bdnf和Reelin等。

( 3) 許多種類的神經活性存在一個以BDNF和HDAC2為中心的正性反饋系統,該系統可導致組蛋白乙酰化和基因自身持續表達程序。

( 4) 在多種生物體和細胞研究中觀察到各種不同類型的記憶模式和不同記憶時相都能引起組蛋白乙酰化,進而促進記憶和有關基因的轉錄和表達。

( 5) 組蛋白乙酰化能引起長記憶的形成和鞏固,但對無須轉錄的短記憶和早期LTP沒有影響。

2. 3神經元活性是如何引起組蛋白乙酰化,它的作用機制是什么?[11]途徑之一,神經元活性包括LTP和學習激活G蛋白偶聯受體( GPCRs) ,然后依次激活腺苷環化酶( AC) 產生c AMP,后者激活PKA,PKA磷酸化MEK( MAPK家族中的一員) ,MAPK的家族成員能直接磷酸化組蛋白,隨后啟動組蛋白乙酰化。

途徑之二,神經元活性可通過鈣內流引起膜去極化,然后激活CAMKⅡ,后者磷酸 化甲基-CPG結合蛋白2( MECP2) ,使MECP2從染色體脫離出來,Calmodulin刺激BDNF啟動子區域的基因轉導。BDNF激活一氧化氮合酶導致組蛋白乙酰化酶2( HDAC2) 的硝基化,在硝基化作用下,HDAC2從染色體中脫離出來并強化硝基化,結果引起BDNF表達并參與正性反饋系統,進而促進記憶 - 持續性基因表達的改變( 見Fig 1) 。

其他一些學者的研究工作指出: 激動NMDA受體,抑制磷酸二酯酶( PDE) ,增加細胞內鈣等多種途徑均可激活PKA,PKA則可直接激活CBP,如前所述。含有乙酰轉移酶活性的CBP與CREB結合,是提高突觸可塑性形成長記憶的必備條件; NO啟動組蛋白影響記憶的機制有二,一是激活N0-cG MP-Ca MKII-CREB磷酸化的信號轉導途徑; 二是NO依賴性的HDAC的5-硝基化,可增加組蛋白乙酰化,而NO供體與5-硝基谷胱甘肽,可抑制HDAC活性,因而,也能增加組蛋白乙酰化。此外,神經元活動或突觸活動引起胞外鈣內流入神經細胞內,使Me CP2的S421磷酸化,S80去磷酸化,后者從染色質分離出來,發揮對神經可塑性和記憶的調控作用。

2. 4 RNA干擾 ( RNA interference,RNAi)指內源性或外源性雙鏈RNA( dsRAN) 介導細胞內mRNA發生特異性降解,導致靶基因表達沉默,產生相應功能表型缺失,RNA干擾下的基因沉默是表觀遺傳學的重要內容,人工合成的小RNA( SiRNA) 包括miRNA和SiRNA。小RNA序列較短,能指導Argonaute蛋白識別的靶分子并導致基因沉默。

已證明,組蛋白去乙酰化酶HDAC阻遏學習記憶,并在細胞內有廣泛分布,人工合成HDACi顯然有重要的治療價值,HDAC2的結構很接近HPAC1,盡管如此,科學家們還是合成許多類型的HDACi,上述各種類型學習記憶和突觸可塑性模型證明使用HDAC2i可促進記憶,增強LTP,阻遏記憶下降。

3 組蛋白和 DNA 甲基化[20,21]

甲基化可發生在組蛋白,也可發生DNA上。盡管這二種甲基化產生的方式、調節機制和涉及的酶與蛋白等有所區別,但二者甲基化的結果是一致的,即他們都能激活基因的轉錄與表達,從而促進長記憶的形成和提高突觸可塑性。這點學術界的看法一致,沒有任何異議。下面將重點介紹組蛋白和DNA甲基化是如何形成,又如何影響基因轉錄及長記憶和突觸可塑性的?

真核細胞中,甲基化只發生在胞嘧啶第五位碳原子上,是由甲基轉移酶所催化,以S-腺苷甲硫氨酸( S-adnosylmethionine,SAM) 作為甲基供體,將甲基轉移到胞嘧啶上,DNA甲基化主要發生在Cp G雙核苷酸序列的胞嘧啶上,哺乳動物異染色質的DNA約有80% 的CPG被甲基化,根據作用方式和反應酶不同,DNA甲基化分為兩種: 維持甲基化( maintenance methylation) 和從頭甲基化 ( de novo methylation) ,前者與DNA復制相關聯。當甲基化的雙鏈DNA被復制生成兩條的新的雙鏈DNA后,只有親代鏈是甲基化的,甲基轉移酶是DNMT1,后者則是DNA上甲基化狀態的重新構建,它不依據DNA復制在完全非甲基化的DNA堿基位點上引入甲基,是甲基化的建立機制。甲基轉移酶依賴于DNMT3a和DNMT3b的活性。

對基因轉錄的影響: 目前研究發現,組蛋白精氨酸甲基化常伴隨轉錄的激活,賴氨酸殘基上的甲基化則因賴氨酸所在的位置不同而有差別,賴氨酸甲基化發生在組蛋白H3的第4,第9,第27,第36,第79( K4,K9,K27,K36,K79) 位及H4K20位上,其中,在酵母和哺乳動物細胞中H3K4和H336位點被甲基化可以激活轉錄,而H3K9 K27 K79和H420的賴氨酸甲基化則可抑制轉錄。

DNA甲基化對基因表達的調節主要表現為抑制轉錄活性,一種可能的機制是由于DNA甲基化直接抑制了轉錄因子的結合,不能形成轉錄復合體,從而也就抑制了基因轉錄活性[16,18,20]。

對記憶的調節作用: Swati Gupta及其同事[21]研究了組蛋白甲基化對成年動物海馬部位記憶形成的影響,他們的研究得出如下主要結果: 恐懼記憶能觸發海馬CA1區H3K4三甲基化( 轉錄激活標志) 和H3K9二甲基化( 轉錄抑制標志)的變化; H3K4特異的甲基化轉移酶MⅡ缺失的小鼠出現長記憶形成障礙; 改變組蛋白甲基化與去乙酰化酶( HDAC) 抑制相偶聯; H3K4三甲基化明顯增加兩種基因 ( Zif/268和Bdnf) 的啟動子,這一事件出現在記憶鞏固期間,已知這兩種基因在記憶形成和神經可塑性中起重要作用。這些發現支持組蛋白甲基化在長記憶鞏固中扮演重要作用,其他許多學者也都證明DNA甲基化與記憶形成和儲存有關,如甲基化CpG結合蛋白1( methyl-Cp G-binding protein1) 基因缺失出現空間記憶能力喪失,甲基化CpG結合蛋白2 ( methyl-Cp Gbinding protein 2) 基因缺失的突變小鼠出現恐懼記憶、空間記憶和物體識別記憶的障礙。

海馬DNA甲基化,對記憶形成起重要作用,但海馬的改變是短暫的,訓練后1 d之內便恢復到基礎水平,長記憶以及記憶的鞏固和儲存依賴于腦的不同區域,據信長記憶的形成和鞏固主要依賴于背側前額葉前扣帶皮層( dm DFC) ,為此探討皮層組蛋白甲基化是否能促進長記憶的形成和鞏固十分必要。Miller等采用背景性恐懼記憶試驗探查皮層DNA甲基化對長記憶的影響,報道認為大鼠恐懼條件化環境中的背景記憶可維持數月,在這期間,近期( recent) 記憶會轉變成遠期( remote) 記憶,也即記憶從海馬( HPC) 轉變成依賴于dmP FC的記憶。首先,采用Me DIP即甲基化DNA免疫沉淀法測定皮層三種基因Zif/268,reln和Ca N的甲基化水平。動物試驗則觀察訓練后7 d的背景記憶,將動物分為背景組( C) 、休克組( S) 和背景加休克組( CS) 。結果表明,在所有組和所有測定時間點,即早基因Zif/268均為去甲基化,說明環境刺激能廣泛地改變dm PFC Zif/268的甲基化狀態,相反的,一個記憶正性調節基因Reln僅在受訓練的動物即CS組動物訓練后1 h內出現高甲基化,隨后即回歸對照水平,訓練后短時間內Ca N( 一種記憶抑制基因) 的甲基化無改變,但在訓練后1 d,這一基因出現持久的甲基化,隨后用BSP描繪訓練后7 d Ca B甲基化的改變,發現僅CS組動物有顯著的Ca N甲基化。為了解皮層DNA甲基化是否能反映聯合學習,動物在訓練前注射NMDA受體拮抗劑MK-801,證明MK-801干擾了訓練后7 d動物恐懼記憶的獲得( acquisition) ,也阻斷了訓練后2 d dmP FC Ca N和Reln的高甲基化,但不影響Zif/268的甲基化,進一步支持Ca N和Reln高甲基化是一種對聯合性環境信號的特異性反應。Frankland等前期研究觀察了訓練后不同時間對ACC( anterior cingulate) 恐懼記憶再現( retrieval) 的干擾。結果證明ACC在18 ~ 36 d( 近期記憶) 經干擾失去記憶再現,但不是訓練后1 d或3 d( 近期記憶) ,從這一結果估計記憶的鞏固出現在訓練后3 ~18 d,研究還證明皮層DNA甲基化可能在訓練后1周內出現,該時段也是皮層留下記憶痕跡的時間,隨后的實驗證明訓練后立即向背側HPC( CA1) 注射NMDA受體選擇性抑制劑AVP,證明APV不但能干擾學習,也能阻止訓練后7 ddmP FC Ca N和Reln甲基化,表明一次性海馬 - 依賴性學習經驗就足以驅動皮層長時間、基因特異性甲基化改變,為了進一步探討皮層DNA甲基化是否伴隨長記憶的形成,觀察了訓練后30 d的皮層甲基化及記憶鞏固的情況,結果證明在CS動物皮層的Ca N甲基化仍十分明顯,而且與長記憶的出現和維持的時間段相吻合,此外還觀察到在HPC有快速甲基化,而在dm PFC有持久的甲基化,以上研究闡明了以下幾個問題: 第一,海馬HPC可啟動學習記憶,產出過渡性短記憶,第二,長記憶的形成和鞏固依賴于dm PFC,第三,海馬和皮層記憶的形成均緣于海馬和皮層DNA的甲基化,或甲基化與其它組蛋白修飾的協同作用,第四,重要的記憶相關基因和受體包括Zif/268,Reln,Bdnf和NMDA受體。組蛋白甲基化是如何調整認知過程,它的生物學機制是什么?Day和Sweatt提出了闡明組蛋白甲基化是表觀遺傳學標志的假說[20],如在細胞內轉變成功能性后果,出現三種可能性: 第一、DNA甲基化驅使神經細胞的反應狀態發生了改變,即它允許、容納其它機制參與進來產生協同效應和維持更加長遠的改變; 第二、甲基化事件積極參與和改變基因的讀出,促進記憶的進行,例如增加突觸強度和突觸可塑性; 第三、表觀遺傳學機制幫助神經細胞無增殖( aplastic) ,在神經元無增殖的情況下可以以穩定突觸數量( synaptic weight) 的分布,后者是穩定記憶的必需條件,這一假設強調了突觸可塑性在記憶過程中的重要性,事實上,國際上近年的研究表明老年癡呆認知功能的衰減與老年斑、A腦內沉積及神經纖維纏結無明顯相關,由于突觸在信息傳遞、信息加工中的重要作用,許多學者都支持突觸功能降低( 包括突觸效能下降和突觸丟失) 是造成認知功能障礙乃至老年癡呆的主要原因,當前治療老年癡呆和各種認知障礙的治療方向都在尋找加強突觸效能,防止突觸丟失、增加突觸新生的新藥。

3. 1組蛋白磷酸化[25,26,27]組蛋白磷酸化修飾跟乙酰化和甲基化修飾一樣具有調節認知功能的作用,這一修飾發生在組蛋白的H3、S1和S10絲氨酸殘基上,由一組蛋白激酶包括絲裂原和應激激酶( MSKI) 和Aurora激酶家族催化完成。組蛋白磷酸化可被蛋白磷酸酶PP1和PP2a所逆轉,這兩種脫磷酸化酶又可被其它分子級聯包括多巴胺和c AMP調節的磷酸蛋白32( DARPP32) 所抑制。最具特色的磷酸化標志存在于H3第10位( H3K10) 絲氨酸上,這一修飾招募了含有HAT活性的GCN5,因而能增加鄰近組蛋白賴氨酸殘基K9和K14的乙酰化,這解釋了為什么組蛋白乙酰化和磷酸化常常同時存在。另外,H3S10磷酸化通過改變DNA和組蛋白尾部間的交互作用增加轉錄因子的結合。

許多研究工作已揭示組蛋白的磷酸化具有調節記憶形成的作用,編碼RSK2的基因突變能產生低咖啡攝入綜合癥( coffin-lowry) ,有精神遲緩、精神異常等表現。在動物模型上的研究,背景性恐懼條件反射形成后,H3S10磷酸化和H3S10 / K14磷酸乙酰化迅速增加,但ERK抑制后可阻斷其增加。同樣的,缺失MSKI的小鼠出現恐懼記憶和空間記憶障礙,這一缺陷卻不因給予HDAC抑制劑所逆轉,提示組蛋白磷酸化途徑與組蛋白乙酰化并行而不是位于乙酰化的下游,與此相協調的是,組蛋白磷酸化酶PPI受抑制,能改善長時程物體識別記憶和空間記憶而不影響短記憶,從這些發現推測: 通過抑制PPI來增加組蛋白磷酸化對治療學習記憶障礙可能是一個有明顯特色甚至是互補的治療策略。

除學習記憶外,H3S10磷酸化也與藥物成癮行為學反應有關聯。可卡因可引起紋狀體H3S10磷酸化的增加,敲除MSKI的小鼠出現對服用可卡因行為反應的障礙。核內積累的DARPP-32能影響對可卡因和蔗糖獎勵的行為反應。組蛋白磷酸化也已被證實是抗精神病和抗巴金森氏癥下游的一個重要靶標,針對表觀遺傳學這一組蛋白磷酸化修飾設計和開發有治療潛能的化合物是很有意義的。一項有意義的研究指出,MSKI主要存在于神經元和紋狀體、杏仁核、海馬等腦區,MSKI這一選擇性分布是治療干擾藥物成癮的一個很好的候選者。

哺乳動物細胞Aurora激酶家族成員的結構和功能在進化上保守,根據該家族成員在細胞內的定位可分為3種: Aurora-A,Aurora-B和Aurora-C。Aurora-B是有絲分裂中組蛋白H3的第四位絲氨酸磷酸化所必需的激酶。組蛋白H3磷酸化主要由Aurora-B激酶控制,除MSK和Aurora外,IB激酶( nuclear,IKK) 復合物中的異構體( IKK) 也可以調控海馬區域組蛋白的磷酸化修飾,IKK是核因子B的一種去抑制調控子,抑制IKK可以阻止背景性環境下長期記憶的再鞏固( reconsolidation)[24]。

組蛋白磷酸化促進長記憶形成和鞏固的機制主要是磷酸基因攜帶的負電荷中和了組蛋白上的正電荷,造成組蛋白與DNA親和力的下降,使DNA容易接近轉錄機構,激活基因轉錄,這是長記憶形成所必需的,也解釋了為什么組蛋白磷酸化不影響短記憶。

在正常生理和表觀遺傳學的生化反應中,磷酸化使蛋白質和基因活化,隨后的生化和生物學反應才能繼續進行,所以在細胞繁殖、分化、細胞存活、DNA復制、轉導和重組、細胞凋亡以及信號轉導中發揮重要作用。

3. 2 其它組蛋白修飾與認知功能[27,28,29]

組蛋白泛素修飾涉及三類催化酶: 泛素激活酶( ubiquitin activating enzyme,E1 ) ,泛素接合酶 ( ubiquitin conjugatingenzyme,E2) 和泛素連接酶 ( ubiquitin protein ligase,E3 ) 。依賴這三種酶分三步進行泛素化修飾,第一步E1利用ATP形式存在的能量與泛素結合成高能硫酯鍵,構成泛素 - E1偶聯物將泛素激活; 第二步,通過轉酯作用將活化的泛素轉移到泛素結合酶E2的活性半胱氨酸殘基上; 隨后,E2將活化的泛素轉移至泛素連接酶E3上,形成高能量E3 - 泛素偶聯物,最后E3可直接或間接地促使泛素轉移到特異靶蛋白上,使泛素的羧基末端與靶蛋白的賴氨酸的-氨基形成肽鏈或轉移到已與靶蛋白相連的泛素形成多聚泛素鏈,有一個去泛素酶大家族,從賴氨酸殘基上移去泛素。

組蛋白泛素化有廣泛的細胞功能,最著名的是控制轉錄的啟動和延長,泛素酶/去泛素酶與其它組蛋白修飾,特別是與組蛋白甲基化有牽連,組蛋白泛素化與神經退性病變之間的關聯來自亨廷氏病,Huntington與泛素連接酶h PRC12存在交互作用。在多個亨廷氏病動物模型上觀察到泛素化的H2A的增加和泛素化的H2B減少,導致組蛋白甲基化模式的改變和基因轉錄下調,故以泛素連接酶為靶標設計藥物對亨廷氏病可能有潛在的治療價值。

多聚( ADP-核糖) 聚合酶[poly( ADP ribose) polymerases,PARPS]在與記憶行為有關的組蛋白修飾中起一定作用,PARPs可催化ADP核糖單位從NAD+轉移到組蛋白靶位點上,不僅可影響染色質的局部結構,還可影響轉錄因子及染色質重塑復合體的結合,在操作性條件反射和位置回避實驗中均證明PARP1可增加長記憶的形成。

3. 3衰老和神經退行性疾病的表觀遺傳學[27,28,29,30]衰老和年齡相關性神經退行性疾病是一個非常復雜的過程,過去有大量報道衰老與神經退行性疾病沒有太多差異,如老年癡呆出現各種病理改變也在衰老過程中出現,但從未從表觀遺傳學方面去尋找原因,現有的研究揭示,表觀遺傳學的異常修飾是衰老和神經退行性疾病的主要機制,其主要病理特征表現在兩個方面:

其一,組蛋白和基因組DNA甲基化的減少,在衰老和神經退化性疾病中表現突出,如神經細胞和基因組DNA亞甲基化( hypomethylation) 和甲基轉移酶( HAT) 活性缺失,在AD患者的病理性神經元和基因組DNA的亞甲基化水平更低。Mastroeni等用免疫組化方法檢測了死后AD和非AD( ND) 病人眶內皮層Ⅱ神經元的DNA甲基化和8種甲基化維持因子的免疫反應性,發現ND和AD神經細胞核具有甲基化胞嘧啶免疫反應陽性的神經細胞數分別為91. 7% 1. 3% 和39. 9% 3. 4% ,甲基化胞苷呈陽性的細胞數分別為91. 1% 1. 3% 和51. 8% 6. 1% ,即AD病人的兩種甲基化模式比ND病人明顯降低,DNMT,MOD2和P662均系甲基化維持因子,在ND病人神經元呈免疫反應陽性,而AD病人神經元免疫呈陰性,此外,RPL26和5. 8 SrRNA也有量的減少。

其二,HDAC2表達增加,研究證明神經退行性改變、衰老和長期應激都能引起HDAC2表達增加,如在神經退行性疾病和衰老時,神經毒性因子如A,氧化應激( H2O2) 和細胞內D25和CDK5激活,糖皮質激素受體( GR) 與臨近組蛋白HDAC2啟動子區的GR反應元件( CRE) 結合,增加腦內HDAC2水平,HDAC2優先與學習、記憶、神經可塑性有關的基因如BDNF結合,同時降低組蛋白乙酰化和基因的表達,破壞BDNF介導的正性反饋系統,從而降低神經可塑性和記憶的形成與鞏固。

篇6

【關鍵詞】 生殖技術；輔助；不育

廣義的輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）包括人工授精（artificial insemination，AI）、體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技術。目前，由IVF-ET及其衍生的新的輔助生殖技術形成人類生殖技術發展的新態勢。卵母細胞漿內單注射術(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)可以幫助許多男性不育患者，甚至是無癥患者獲得生育機會；胚胎著床前遺傳學診斷技術（preimplantation genetic diagnosis，PGD）使得許多遺傳性疾病在胚胎植入前得以診斷，達到優生的目的；冷凍胚胎和配子復蘇技術可以增加一次取卵多次移植的機會，減少移植胚胎的數目，減少多胎妊娠率；囊胚培養技術跨越了胚胎基因激活的階段，與子宮內膜發育同步，種植率高；細胞核移植技術重建卵子，給卵子儲備量少而產生卵子數少的患者帶來了福音，但是對重構卵的遺傳作用存在爭議；人類未成熟卵母細胞體外培養成熟技術（in vitro maturation，IVM）適用于卵子成熟障礙的患者，避免了促性腺藥物的副作用，創傷性小，減少醫患負擔。

1 體外受精-胚胎移植

19世紀末至20世紀中期，是IVF-ET的動物試驗階段，正是這些動物實驗奠定了人類IVF-ET成功的基礎。1976年，英國的Steptoe等［1］報道了人類首次IVF-ET妊娠，但不幸的是妊娠結局為異位妊娠；隨后經過不懈的努力，于1978年獲得了Louise Brown的出生。IVF-ET是指在自然周期或刺激周期，于卵泡成熟時將卵子從卵巢中取出，在體外與共培養形成胚胎并移植入子宮的一項技術。適用于輸卵管性不育、免疫性不育、不明原因性不育等。IVF-ET治療程序包括：

1.1 控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）與監測卵泡發育 目的是誘導婦女產生同步發育的多個卵泡。COH是IVF-ET的關鍵，良好的COH方案可以獲得高質量的成熟卵母細胞，從而提高受精率和妊娠率。近20年來，COH策略已經發生了許多變化。這些變化涉及到藥物的使用，從克羅米芬，到人絕經期促性腺激素（human menopause gonadotropin，HMG），再到高純度卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和基因重組FSH。在20世紀90年代初，促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）降調節被廣泛采用。使用GnRH-a的COH方案可以避免過早的內源性黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰，防止卵泡過早黃素化，提高卵子質量，增加妊娠率。但是同時也增加了促性腺激素（gonadotropin，Gn）的用量，延長治療周期，未能有效地抑制卵巢過度刺激綜合征(ovary hyperstimulation syndrome，OHSS)的發生。近年來，GnRH拮抗劑（GnRH-A）的第三代制劑投入臨床使用，GnRH-A的作用特點是：①與垂體GnRH受體競爭性結合；②即時產生抑制效應，降低Gn和性激素水平；③抑制效果劑量依賴性；④保留垂體反應性［2］。由于GnRH-A的作用機制與GnRH-a存在區別，它具有GnRH-a所沒有的優點，減少了Gn的用量和用藥時間，降低了OHSS的發生率及過早LH峰發生率，但是因為缺乏足夠的臨床資料驗證，GnRH-A的安全性有待進一步研究。生長激素（growth hormone，GH）的使用：對卵巢功能、卵泡生長、類固醇激素的分泌作用是已知的，可能直接作用于卵巢，刺激卵泡生長、卵母細胞的成熟及卵巢雌激素的產生［3］。故往往與Gn聯合應用以獲得較好的超排卵反應，增加可移植胚胎的數目。

1.2 取卵 于注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）后的36 h左右，卵泡成熟但未破裂時，抽取卵泡液找出卵母細胞。在IVF-ET的應用初期曾采取腹部切口或腹腔鏡進行取卵手術，現在基本已被B超引導下經陰道穿刺取卵所替代。

1.3 體外受精-胚胎移植 將取出的卵母細胞放入培養液中培養，使卵子進一步成熟，并與經過處理的混合受精培養。鏡下觀察到受精后，繼續培養至細胞分裂至4~8個細胞時將胚胎移植入母體子宮內。

1.4 黃體支持 應用黃體酮或者HCG支持至妊娠3個月。IVF-ET在臨床上已經應用了20余年，有足夠的資料證實其安全性，Anthony等［4］對4224例IVF-ET和314605例自然受孕的先天畸形率作對比，結果無明顯差異。Hahn等［5］對IVF子代進行調查，認為其行為、精神神經、運動、社會適應等方面與自然受孕兒無差異。

2 卵母細胞漿內單注射術

2.1 適應證 ICSI技術是幫助直接穿過卵母細胞而發生受精，使那些曾經被認為喪失生育功能的夫婦獲得自己的后代。近年來被成功應用于男性不育癥的治療。ICSI的主要適應證是：中前向運動＜1×109/L；未成熟，如取自或附睪的，常規IVF反復受精失敗，不明原因不孕，卵子冷凍后受精等。

2.2 ICSI的安全性 1992年，Palermo等［6］將ICSI技術應用于臨床并獲得成功，成為輔助生殖技術發展的里程碑。隨后相繼出現附睪、甚至精細胞ICSI治療技術，使得無癥不育的治療有了新的突破。ICSI技術治療的有效性是肯定的，Tourmaye［7］進行了一項針對男性為中等程度的少弱癥不育夫婦的實驗：用同一批卵子隨機采用IVF和ICSI，發現ICSI受精率比IVF高3.9倍。但是，因為ICSI所使用的越過了自然受精的屏障，并且在操作中可能損傷到細胞骨架或減數分裂中的紡錘體，它的安全性受到普遍關注。Causi等［8］針對2949例ICSI和10785例IVF臨床妊娠結局分析，表明ICSI未增加妊娠失敗或出生缺陷的概率。Bonduelle等［9］也報道ICSI后出生缺陷與一般人群的發病率相似。但是，這些證據并不能否定ICSI存在一定的遺傳風險。

2.3 ICSI潛在的風險

2.3.1 使用遺傳異常的風險 ①染色體異常。②囊性纖維化跨膜傳導調節基因(CFTR)突變：先天性雙側輸精管缺失的不育癥患者有75%~80%至少可以檢測出一個CFTR突變［10］。③Y染色體的微缺失：Y染色體長臂的無因子（azoospermia factor，AZF）分為3個功能區：AZFa、AZFb、AZFc。其中AZFa缺失常與精原細胞完全缺失有關；AZFb缺失通常與生殖細胞成熟停滯有關；AZFc缺失較常見，與多種無和嚴重少弱癥有關。在存在AZF缺失的情況下進行ICSI治療，會將AZF缺失遺傳給男性子代，故應該考慮通過PGD進行性別選擇。④雄激素受體（AR）基因三核苷酸重復：AR基因CAG片斷的重復在ICSI應用過程中可以被遺傳甚至于被擴增。過度擴增的CAG重復序列增加神經元變性疾病的發病風險，如延髓脊髓性肌萎縮超過50%表現為嚴重少弱癥或無精癥導致不育。

2.3.2 線粒體DNA(mtDNA)遺傳風險 mtDNA突變率較高，可以引起人類功能障礙。但目前還沒有證據表明ICSI會增加父親mtDNA傳遞導致mtDNA疾病的風險［11］。

2.3.3 顯微注射過程中以及外源性物質導入卵子的風險 如聚乙烯一氯五環酮（PVP）液、病原體等。

2.3.4 機械損害的風險 損傷細胞骨架或減數分裂中的紡錘體。

2.3.5 印跡基因改變的風險 Lucifero等［12］報道ICSI技術有可能干擾卵母細胞或早期胚胎中母系基因印跡的建立和維持。故為了減少ICSI的遺傳風險，應進行嚴格的遺傳學檢測。

3 胚胎著床前遺傳學

診斷技術PGD是輔助生殖技術與分子生物學技術相結合發展的產前診斷技術。通過顯微操作獲得來自卵裂球、囊胚或者胚泡滋養外胚層的單細胞，應用PCR和FISH技術進行遺傳學診斷。PGD主要應用于性連鎖隱性遺傳病、單基因疾病、染色體數目與結構異常及與高齡相關的非整倍體檢測等，以減少畸形胎兒的發生率。1990年，Handyside等［13］報道第1例植入前性別診斷嬰兒出生。發展至今，應用FISH技術行PGD可針對性連鎖遺傳、胚胎非整倍體的篩選、染色體結構異常等做出診斷。Abdelhadi等［14］報道用適宜的探針與要求進行PGD監測染色體非整倍體的患者的活檢細胞經歷3個連續的熒光原位雜交過程，可同時檢測13對染色體的異常。Munne［15］報道經PGD檢測后的妊娠自發流產率從23%降至11%。理論上講，只要有足夠的序列信息，PGD能夠針對任何遺傳條件進行分析，即凡是能夠被診斷的遺傳病都可以通過PGD來防止患兒出生。但是，目前PGD在技術上尚存在難點，其細胞遺傳學分析診斷的準確率和可靠性尚難達到100%。目前，PGD取材的主要來源有三：極體、卵裂球或滋養層細胞的活檢以及單個或數個細胞。卵裂球活檢是目前常用的方法，這種方法的缺點是卵裂階段的胚胎嵌合體的發生率很高，卵裂階段單個卵裂球的檢測結果并不能代表整個胚胎的狀態，可能造成誤診或者漏診［16］。囊胚是胚胎進行活檢的最后階段，囊胚期滋養細胞可以獲得充足的樣本量，提高PGD的準確性。但是，胚胎必須在受精后5~6天移植，使得診斷時間受到嚴格限制。極體活檢的優點是不影響卵子的正常發育與受精，而且取材較早，有更多的時間分析；缺點是不能分析父源性染色體異常。已經有學者應用極體和卵裂球胚胎聯合活檢進行PGD，提高診斷率［17］。目前尚無足夠的資料證明PGD對子代安全性的影響，但在優生優育方面蘊含著巨大的潛力。隨著人類對疾病基因認識的深化及診斷技術的提高，將某些遺傳病從人群中篩選出來的希望仍然存在。

4 冷凍技術

在生殖領域中，冷凍技術應用廣泛，包括：冷凍、胚胎凍存、成熟卵子凍存、幼稚卵細胞及卵巢組織凍存等。凍融胚胎移植的臨床意義：冷凍胚胎和配子復蘇技術可以增加一次取卵多次移植的機會，減少移植胚胎的數目，減少多胎妊娠率；在治療中出現嚴重的OHSS時，可以推遲移植時間；發生治療意外時，如移植困難等。凍融胚胎移植周期的妊娠率雖然低于新鮮移植周期，但累計妊娠率增加。尤其現在對移植胚胎的數目的限制及單胚胎移植的趨勢，使得冷凍技術有了更大的潛力。胚胎凍存可在原核期、卵裂早期和囊胚期進行。胚胎冷凍的方法有程序冷凍、超快速凍融法和玻璃化法等。目前大多數采用玻璃化法技術。1986年，Chen［18］首次報道了人類卵子冷凍經體外受精后獲得妊娠。卵母細胞的凍存處于排卵時，卵母細胞處于減數分裂的中期Ⅱ，含有23條染色體，每個染色體有2條染色單體組成，排列在赤道面上，與減數分裂紡錘體的微管相連，這個時期的結構對溫度極為敏感，故卵母細胞的凍存難題至今尚未攻克。而未成熟卵母細胞具有相對靜止、體積小、缺乏透明帶及皮質顆粒的特性，比成熟卵子更易耐受冷凍和復蘇過程中所造成的損傷。近年來，隨著IVM技術的發展，已經可以采用幼稚的卵細胞甚至卵巢組織薄片凍存。

5 囊胚培養技術

囊胚期胚胎經過了人類胚胎發育阻滯階段（8細胞期）的篩選，可以獲得最具有活力的胚胎進行移植；囊胚期移植更符合生理狀況，有利于增加子宮內膜與胚胎發育的同步性［19］；為PGD的實施提供了時間，使得胚胎在活檢后有更長的時間恢復再進行移植［20］。囊胚期胚胎培養的發展經歷了3個階段：單一培養、共培養和序貫培養。近年來，序貫培養已經基本取代了前兩者。1998年，Gardner等［21］在哺乳類胚胎生理學基礎上，根據人類生殖道液糖類的含量和胚胎進入宮腔時宮腔液的成分，設計配置了不含血清的G1、G2序貫培養液，新近又推出G3系列培養基，培養時間可以延長至5天，使得胚胎在體外發育至囊胚期成為現實。囊胚移植的適宜人群尚無定論，目前臨床上將第3天8細胞胚胎數目作為決定的一個關鍵條件。第3天8細胞胚胎數＜3個在第3天移植，≥3個可繼續培養至第5天移植。Racowsky等［22］經過回顧性分析發現，第3天8細胞胚胎數≥3者第5天移植較第3天移植的妊娠率明顯提高，第3天8細胞胚胎數＜3者第5天移植較第3天移植妊娠率無明顯差異。研究證明，選用高質量的囊胚移植不但顯著提高胚胎著床率，還可以減少多胎妊娠發生的風險［23］。隨著人們對胚胎發育認識的不斷深入及實驗室技術的不斷發展，囊胚期移植的優勢導致它有可能會取代現行的胚胎培養體系成為IVF治療的常規方法。

6 卵子重建

細胞核移植技術是近幾年來發展起來的新技術，為卵子的重建提供了新的方法。女性到37~38歲，卵母細胞減少的速度增快，不僅卵母細胞存儲數量減少，而且質量也隨著年齡的增長而下降。目前沒有辦法能夠修復或挽救這些卵子。設想它的部分細胞結構能被正常卵子所替代，可提高卵子質量。途徑之一是胞質置換，但是這種胞質置換發生在成熟卵子，并不能解除減數分裂過程中可能發生的染色體失衡。這一問題可通過轉移生發泡（GV）期卵子核到一去核年輕婦女的未成熟卵子內來解決，即核移植。然后通過體外培養使這些卵子成熟，以排出第一極體作為核成熟的標志。核移植技術的應用，將會使制造卵子成為可能，給那些由于卵子儲備量少而產生卵子數少的患者帶來福音。但是，因為線粒體具備一種特性——擁有獨立于核DNA的線粒體DNA（mtDNA）、Barritt等［24］報道移植后供者的mtDNA持續存在；大部分學者對這項技術持謹慎態度：胞質內含有遺傳物質，重構卵的遺傳物質已經發生變化！

7 人類未成熟卵母細胞體外培養

成熟技術自1991年Cha等［25］從因為良性病變而被切除的卵巢中獲取不成熟卵母細胞，在體外培養成熟并成功妊娠以來，IVM技術無論在實驗室還是臨床方面的研究都取得了一定的進展。2004年Chain等［26］報道世界上已有300多例采用IVM技術妊娠的嬰兒分娩。IVM技術主要是針對一些卵子成熟障礙的不育癥患者，尤其是對于多囊卵巢綜合征（PCOS）無排卵者已經有較多的研究并獲得了較高的臨床妊娠率(25%)［27］。IVM技術是指在不經過超促排卵或少量應用促性腺激素后從卵巢中獲取未成熟卵，在體外經過適宜的條件進行體外成熟培養，使卵母細胞成熟并具有受精能力。在IVM過程中，培養環境對卵母細胞的成熟至關重要，在培養系統添加促性腺激素、表皮生長因子、葡萄糖和丙酮酸、卵泡液等有助于卵子成熟，另外，卵泡的直徑大小、取卵時間、年齡等因素也會影響卵母細胞的成熟。IVM盡管取得了很大的進步，但仍然存在許多問題和不足：卵子成熟率低、成熟后卵子受精率低、種植率低、IVM卵子質量不能保證。經IVM妊娠分娩的子代尚缺乏足夠的臨床資料驗證其安全性。但是，IVM具有顯而易見的臨床意義，在于：與IVF/ ICSI技術結合治療多囊卵巢綜合征即卵巢發育不良等疾病；避免患者接受超促排卵導致的卵巢過度刺激綜合征的發生；節省醫療費用和就醫時間；解決卵巢組織冷凍保存后卵細胞的成熟問題及未成熟卵冷凍保存后的應用問題，將會對癌癥患者在化療或者放療之前拯救其遺傳物質，為高齡婦女建立卵母細胞庫具有重大意義；為卵母細胞成熟機制的研究建立體外模式。由此可見，IVM技術的研究對治療人類不育、推動輔助生殖技術的發展有著深遠的影響。經過近20年的發展，我國的輔助生殖技術已經取得了驚人的進步，許多新技術對不育癥的治療產生了很大的作用。在掌握社會和醫學倫理以及本領域相關規范的保障下，相信輔助生殖技術會得到健康可持續發展。

參考文獻

［1］ Steptoe PC， Edwards RG. Reimplantation of a human embryo with subsequent tubal pregnancy［J］. Lancet，1976，1（7965）:880-882 ［2］ Felverbaum R， Diedrich K. Ovarian stimulation in ART use of GnRH-antagonists. Fertil Reprod Med. Proceedings of the ⅩⅥ World Congress on Fertility and sterility［M］. San Francisco，1998：113-124.

［3］ Hull KL， Harvey S. Growth hormone: roles in female reproduction ［J］J Endocrinol，2001，168(1):1-23

［4］ Anthony S， Buitendijk SE， Dorrepaal CA， et al. Congenital malformations in 4224 children conceived after IVF［J］. Hum Reprod，2002，17(8):2089-2095.

［5］ Hahn CS， Dipietro JA. In vitro fertilization and the family: quality of parenting， family functioning， and child psychosocial adjustment［J］. Dev Psychol，2001，37(1):37-48.

［6］ Palermo G， Joris H， Devroey P， et al. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte［J］. Lancet，1992，340(8810):17-18.

［7］ Tournaye H. Management of male infertility by assisted reproductive technologies［J］. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab， 2000，14（3）:423-435.

［8］ Causio F， Fisthetto R， Sarcina E， et al. Chromosome analysis of spontaneous abortions after in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI)［J］. Eur J Obstet Gynecol Biol， 2002，105(1):44-48.

［9］ Bonduelle M， Liebaers I， Deketelaere V， et al. Neonatal data on a cohort of 2889 infants born after ICSI (1991-1999) and of 2995 infants born after IVF (1983-1999)［J］. Human Reprod，2002，17(3):671-694.

［10］ Stuppia L， Antonucci I， Binni F， et al. Screening of mutations in the CFTR gene in 1195 couples entering assisted reproduction technique programs［J］. Eur J Hum Genet，2005，13(8):959-964.

［11］ Marchington DR， Scott Brown MS， Lamb VK， et al. No evidence for paternal mtDNA transmission to offspring or extra-embryonic tissues after ICSI［J］. Mol Hum Reprod，2002，8(11):1046-1049.

［12］ Lucifero D， Chaillet JR， Trasler JM. Potential significance of genomic imprinting defects for reproduction and assisted reproductive technology［J］. Human Reprod Update， 2004，10(1):3-18.

［13］ Handyside AH， Kontogianni EH， Hardy K， et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification［J］. Nature，1990，334（4）:768-770.

［14］ Abdelhadi I， Colls P， Sandalinas M， et al. Preimplantation genetic diagnosis of numerical abnormalities for 13 chromosomes［J］. Reprod Biomed Online，2003，6(2):226-231.

［15］ Munne S.Preimplantation genetic diagnosis of numerical and structural chromosome abnormalities［J］. Reprod Biomed Online，2002， 4(2): 183-196.

［16］ Los FJ， Van Opstal D， van den Berg C. The development of cytogenetically normal， abnormal and mosaic: a theoretical model ［J］. Hum Reprod Update，2004，10(1):79-94.

［17］ Kuliev A， Verlinsky Y. Meiotic and mitotic nondisjunction: lessons from preimplantation genetic dignosis［J］. Hum Reprod Update，2004，10(5):401-407.

［18］ Chen C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation［J］. Lancet， 1986，1(8486):884-886.

［19］ Gardner DK， Lane M， Calderon I， et al. Environment of the preimplantation human embryo in vivo: metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells［J］. Fertil Steril， 1996，65（2）:349-353.

［20］ Palmer R， Traeger-Synodinos J， Davies S， et al. Pregnancies following blastocyst stage transfer in PGD cycles at risk of beta-thalassaemic haemoglobinopathies［J］. Human Reprod， 2002，17（1）:25-31.

［21］ Gardner DK， Vella P， Lane M， et al. Culture and transfer of human blastocysts increases implantation rates and reduces the need for multiple embryo transfers［J］. Fertil Steril，1998，69（1）:84-88.

［22］ Racowsky C， Jackson KV， Cekleniak NA， et al. The numbler of eight-cell embryos is a key determinant for selecting day 3 or day 5 transfer［J］. Fertil Steril， 2000，73（3）:558-564

［23］ Gardner DK， Surrey E， Minjarez D， et al. Single blastocyst transfer: a prospective randomized trial［J］. Fertil Steril， 2004，81（3）:551-555.

［24］ Barritt JA， Brenner CA， Willadsen S， et al. Spontaneous and artificial changes in human ooplasmic mitochondria［J］. Hum Reprod， 2000，15(Suppl):207-217.

［25］ Cha KY， Koo JJ， Choi DH， et al. Pregnancy after in vitro fertilization of human follicular oocytes collected from nonstimulated cycles， their culture in vitro and their transfer in a donor oocyte program［J］. Fertil Steril， 1991，55(1):109-113.

篇7

關鍵詞：基因組編輯；CRISPR-Cas9；豬；基因功能；網絡調控

中圖分類號：R34；S828 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6510-07

最新的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）分類表將其描述為三大類型和多個亞型，結合生物化學與分子遺傳學方法揭示了不同CRISPR-Cas（CRISPR associated protein）類型的特征[1]，其中II型系統Cas9比其他更為簡便。基于CRISPR-Cas9系統的作用原理，研究人員模擬細菌的成熟crRNA和tracrRNA，在體外人工合成gRNA（guide RNA），同樣可以達到特異地切割靶標DNA，從而將該系統簡化成核酸酶Cas9和人工合成的sgRNA兩個組分，在靶標位點導致所期望的插入、刪除或替換，由此開創了新型基因編輯技術，這是該系統的“基因工程功能”。更進一步地，通過點突變得到缺乏核酸酶活性的Cas9突變體，命名為dCas9。突變的dCas9可在gRNA的引導下，實現與DNA結合，但不能切割DNA。而dCas9具有融合異源模塊的結構域，利用dCas9這3點特性，將其與一系列具有功能的異源模塊融合，實現不同研究目的：轉錄激活與抑制、探索未知基因及其調控元件的功能、全基因組掃描等，這是該系統的“基因調控功能”。不論是基因工程/基因調控，其工作過程是相同的：gRNA通過序列互補原則將核酸酶帶到基因組特定位點，使其與靶標結合。不過，基因工程與基因調控是利用Cas9蛋白的不同形式，包括野生型Cas9與人工突變的dCas9蛋白，以實現各自目的[2，3]。該技術能夠快速地構建遺傳改造的動物，使得在過去要花費數月或數年的工作現在只需幾周完成。CRISPR技術與PCR技術類似，正在給生物工程研究帶來革命性的改變，從各個方面影響著生命科學的發展[4]。目前基因組編輯CRISPR-Cas中也主要是應用Cas9系統，下面簡稱“Cas9系統”。

2013年初以來，Cas9系統的快速創新及其拓展應用，使其成為可替代ZFN和TALEN的第三代基因組編輯工具。2013年Science雜志將Cas9系統選為年度十大突破之一（亞軍）；2014年美國加州大學伯克利分校生物化學家Doudna博士和德國的Charpentier博士因此共同獲得了美國硅谷“科技突破獎”與“阿爾珀特獎”；2015年被Science雜志評選為年度十大突破之首；2016年具有小諾貝爾獎之稱的蓋爾德納國際獎授予了三位科學家：Doudna，Charpentier和麻省理工學院的張鋒三位博士。幾大公司看好Cas9系統的成果商業化前景。Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics等公司已經收到數億美元的投資。例如，2015年比爾?蓋茨等大佬宣布為促進基因編輯技術的蓬勃發展，共投資1.2億美元參與基因編輯公司 Editas Medicine的B輪融資，Cas9先驅之一張鋒是該公司的聯合創始人。Editas Medicine計劃于2017年采用基因編輯療法對先天性黑蒙癥進行臨床試驗，這是一種罕見的視網膜疾病，基因突變可能導致眼睛中的感光細胞逐漸消失。據麻省理工W院Broad研究所網站最新報道，農業生物技術巨頭杜邦（DuPont）公司宣布對Caribou Sciences公司進行投資，且將獲得其專利在農作物使用的獨家授權。而Caribou Sciences是Cas9技術首創之一Doudna博士實驗室的附屬公司。目前，杜邦公司正在溫室中種植Cas9編輯的玉米、大豆、水稻和小麥，期望在5～10年內出售Cas9技術的產品。位于明尼蘇達州圣保羅的動物生物科技公司Recombinetics正在開發同類動物，包括無須抑制牛角生長的牛和不需要被的豬。2016年6月底，美國國立衛生研究院（NIH）顧問委員會批準了一項申請：利用Cas9系統強化依賴于患者T細胞（一種免疫細胞）的癌癥療法。由于其易用性和通用性，Cas9已經被世界各地的實驗室用來改寫基因組和重塑細胞，其在醫學和農業領域的潛在應用是無窮無盡的，它將開啟該行業新一波的產品浪潮和利益追逐。根據瑞士洛桑附近的咨詢機構IPStudies介紹，全球已有超過860項CRISPR專利，平均每天新增加一項專利。世界許多遺傳學家和生化學家普遍認為，Cas9系統可對所有的生物進行改造，這是一項可改變生命未來的偉大技術，當然，該技術也面臨許多倫理挑戰。

1 CRISPR-Cas9系統的拓展性應用研究

最初的Cas9只能實現剪切的基因工程功能（CRISPR1.0版本）。每次只能執行一種功能的dCas9是CRISPR2.0。現在研究人員將突變dCas9蛋白與一系列具有功能的異源模塊融合，成為能夠執行多重功能的CRISPR3.0。這種平臺能夠執行復雜的程序，適用于研究基因網絡機理和更深入探討復雜性狀/疾病[5]。

1.1 同時激活多基因表達/同時抑制多基因

Chavez等[2]設計了三方轉錄激活子（VP64-p65-Rta）融入dCas9，可探討一連串基因回路對生物過程（比如組織發育或疾病發生）的影響，也可以精確指導干細胞分化，生成再生醫學所需的移植器官。Konermann等[6]應用改造后的Cas9系統成功激活了十個基因，包括長非編碼RNA（LncRNA）。這些基因轉錄效率得到了兩倍以上的增長，該研究的意義在于，人們可以用這一技術在活細胞中有效啟動任何基因表達[7]。Cas9系統已被成功地用于同時干擾小鼠2個基因和敲除猴與蠶的兩個基因[8，9]。多位點編輯將促進多方面研究，包括上位效應的檢測和基因組中物理距離非常接近的多基因操作。Ma等[10]同時靶向基因家族的多成員（多至8個位點），突變率平均為85.4%。Zalatan等[11]應用架RNA（scaffold RNA，scRNA），成功在酵母中重新定向了一個復雜的多分支的代謝通路，其中一些基因被激活，另一些基因被抑制（CRISPRa/i）。多基因的組合控制可以幫助人們靈活操縱細胞中的通路，例如，改寫細胞命運或者設計代謝通路。Cheng等[5] 報道其CRISPR 3.0版本是Casilio，該系統可結合多個蛋白模塊，包括基因激活、基因抑制、染色體熒光標記、組蛋白乙酰轉移酶等，以實現不同的目的。

1.2 運用Cas9實施表觀遺傳學編輯

Kearns等[12]報道dCas9-組蛋白脫甲基酶LSD1 在鼠胚胎干細胞中靶向轉錄因子Oct4的遠端增強子，抑制Oct4轉錄并失去多能性。許多酶能以不同的機制催化DNA去甲基化，其中，TET（Ten-Eleven Translocation dioxygenase）雙加氧酶家族有3個成員：TET1、TET2和TET3，催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可啟動DNA的去甲基化。Xu等[13]首先向傳統sgRNAs中插入兩個拷貝的噬菌體MS2 RNA元件，構建了修飾后的sgRNA2.0，這有利于Tet1催化結構域（TET-CD），與dCas9或MS2外殼蛋白融合，以靶向基因位點。結果證明，dCas9/sgRNA2.0指導的去甲基化系統能有效地將靶基因去甲基化，可顯著上調靶基因的轉錄，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，而且這結果與它們啟動子中相鄰的CpG島的DNA去甲基化密切相關。類似的工作與結果也由Choudhury等[14]報道于模式抑癌基因BRCA1啟動子。這些結果不僅可以幫助我們理解在特定背景中DNA甲基化如何調節基因表達的機制，而且也使我們能夠控制基因表達與功能，并帶來潛在的臨床效益。表觀遺傳效應模塊的匯總詳見文獻[15]。

1.3 運用Cas9開展高通量全基因組遺傳學篩選

全基因組 CRISPR 篩選克服了傳統遺傳篩選的缺點，可應用于幾乎任何細胞系和任何遺傳背景下的篩選[16]。應用其進行遺傳篩選的基礎是蛋白Cas9修飾后的多種形式融合和sgRNA文庫。構建Cas9高通量篩選的文庫有兩種：陣列文庫和混合文庫。（1）細胞系中開展遺傳學篩選。Wong等[17]創建了Cas9與CombiGEM結合的平臺技術，可展望，該平臺有著廣泛的應用前景，加速系統鑒定控制人類疾病表型的遺傳組合，并轉化到新藥物組合的發現。（2）體內開展遺傳學篩選。Ma等[18]將活化誘導胞嘧啶核苷脫氨酶（AID）與dCas9融合成為dCas9-AIDx，在慢性粒細胞中靶標BCR-ABL，鑒定了賦予細胞伊馬替尼抗性的已知突變和新突變。Zhu等[19]開發了配對的gRNAs（pgRNAs），產生大片段缺失，應用這種高通量方法確定了51條功能性的lncRNAs，并驗證了其中的9個。該方法使科學家們能夠快速識別哺乳動物非編碼元件的功能。

1.4 光遺傳學加CRISPR調控基因表達與靶DNA切割

東京大學和杜克大學基于光誘導的CRY2（色素）和CIB1（蛋白），開發出相似的光遺傳學+CRISPR系統，其目的是利用光來開啟和關閉基因表達，同時賦予時空控制和可逆性[20-22]。

1.5 通過熒光標記的dCas9對DNA實施標記

Deng等[23]w外構建“dCas9/熒光素”復合物作為探針，可視化基因組位點完全沒有引起DNA變性，稱為Cas9介導的熒光原位雜交（CASFISH）。dCas9/sgRNA能夠在近著絲粒區、著絲粒、G富集端粒和編碼基因等位點快速而有效地進行重復DNA元件標記，也適用于初生組織切片的檢測。這種技術具有快速、有效、破壞性較少與成本低的特征，為基礎研究和遺傳學診斷增加了一種非常有潛力的工具。

1.6 CRISPR-Cas9系統同時實現基因工程和基因調控的雙重功能

Kiani等[24]開發了Cas9系統一個新策略，能夠同時實現基因組工程和基因調控的雙重功能。其使用經過改造的gRNA和Cas9蛋白，在切割特定基因的同時調控其他基因的表達。這一技術大大增強了基因組編輯和基因調控的功能性，幫助我們進一步操縱細胞，以揭示重要生命過程背后的復雜機理，比如，癌癥耐藥性和干細胞分化，或者幫我們設計更高級的人工基因回路。更進一步地，雙重功能Cas9可以促進基因工程菌株（例如大腸桿菌）大規模生產化合物和燃料。

1.7 多順反子基因

Xie等[25]將tRNA與gRNA結合起來，開發合成了一個多順反子基因，以提高Cas9系統的靶向能力和多重編輯效率，能夠在水稻中高效實現多重基因組編輯和染色體片段刪除（可達到100%）。Qi等[26]設計多個tRNA-gRNA單元，在玉米中的研究表明，該系統不僅增加靶向位點數目，也能更有效和準確地缺失染色體片段，這對基因功能的完全消除特別是lncRNAs的研究很重要。同時還表明，在一個表達盒中可容納多達四個tRNA-gRNA單元，用來修飾同一基因家族中的不同成員或同一代謝途徑中的不同調控基因。

1.8 Cas9系統應用于多能干細胞

誘導型多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）可無限地自我更新，而不會喪失分化成所有細胞類型的能力，且繞過了免疫排斥的障礙。iPSCs在再生醫學中具有良好的前景，是用于致病突變原位校正的一種理想細胞群。將CRISPR應用到iPSCs中為糾正遺傳缺陷疾病開辟了一條新途徑，因為iPSCs很難采用傳統的基因打靶策略進行操作，尤其是蛋白質介導的基因組編輯方法[27-30]。

1.9 染色體大片段和lncRNA編輯

Shechner等[31]介紹了以CRISPR-Cas9為基礎的基因組靶向技術展示：CRISPR-Display（CRISP-Disp），將gRNA-ncRNA融合，能將大片段非編碼RNA帶到特定DNA位點，同時不影響dCas9的功能。CRISP-Disp系統可容納約4.8 kb的RNA結構域，這相當于天然lncRNA的長度。除了lncRNA以外，研究人員還對各種天然和人工非編碼RNA進行了測試，表明gRNA可以偶聯多個非編碼RNA結構域，這些結構域可同時且獨立起作用。CRISP-Disp可用來解決如下問題：一個lncRN段是如何調控基因表達的？是這個片段的轉錄本在起作用，還是它本身的序列在起作用？揭示lncRNA在表觀遺傳學修飾、染色質重塑或者轉錄調控中做出的貢獻。該系統除了研究非編碼RNA機理外，對合成生物學來說，CRISP-Disp的靈活性、模塊化和多重化特性是很有吸引力的。用CRISP-Disp招募RNA-蛋白復合體到特定位點，可以設計出復雜的基因調控回路。Yoshimi等[32]開發出了兩種基因改造新技術：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP（Two-hit two-oligo with plasmid）），來完成相對較長的DN段，如GFP（Green fluorescent protein）序列的靶向基因敲入，提高基因編輯的效率。第一種方法是利用lsODNs作為靶向供體。第二種方法是共同注射兩個gRNAs作為“剪刀”切割基因組DNA和供體質粒DNA中的靶位點，兩個短ssODNs作為“漿糊”連接切割位點的末端。利用開發出的兩種基因改造方法，該研究小組成功實現了高效、精確敲入GFP基因，導入了近200 kb的大片段基因組區域，這是采取傳統方法不可能做到的。并用人源基因替代了大鼠基因，構建出了基因人源化的動物。這兩種基因敲入方法將會提高遺傳工程改造的效率。研究人員高度期待這些遺傳工程生物將用于藥物研發、轉化和再生醫學等廣泛的研究領域。

1.10 研究蛋白質工程

Hess等[33]開發了一種稱為重利用體細胞超突變的原位蛋白質工程新技術，命名為CRISPR-X。研究人員利用dCas9召集胞嘧啶氨酶（AID）變異體，其攜帶有經過MS2修飾的sgRNAs，能特異地誘變內源靶標，限制脫靶傷害。它能產生不同點突變的多樣文庫，同時靶向多個基因組位點，結果從中找到了引發Bortezomib耐藥性的已知和新突變。還利用超活化AID變異體，同時誘變了轉錄起始位點上游和下游的位點。這些結果均表明 CRISPR-X是一種強大的工具，能幫助科學家們創建復雜的原始遺傳突變文庫，分析完善蛋白質工程。

2 CRISPR-Cas9系統在豬中的研究進展

Cas9系統出現之前，已經有文獻報道了其他技術的基因組編輯豬[34]，現在利用Cas9系統的報道層出不窮。這里重點綜述Cas9系統在豬研究中的進展，因為豬不僅提供肉食，同時其在生理學、免疫學和基因組學上與人高度相似，器官大小也比嚙齒動物有優勢。

2.1 功能基因研究

Su等[35]合成sgRNA時用豬U6啟動子代替人U6啟動子，獲得更佳的打靶效率；Wang等[36]顯微注射Cas9 mRNA和sgRNA至豬原核期胚胎，篩選出打靶效率最高的sgRNA；He等[37]將攜帶GFP和紅色熒光蛋白（RFP）的Cas9質粒先后轉染豬胎兒成纖維細胞，通過雙重熒光篩選提高打靶成功效率；吳金青等[38]應用SSA（Single-strand annealing）報告載體，使Cas9系統對豬胎兒成纖維細胞的打靶效率提高5倍左右。八聚體結合轉錄因子4（OCT4）是參與調控胚胎干細胞自我更新和維持其全能性的重要轉錄因子之一。Kwon等[39]研究表明Cas9系統可針對孤雌胚胎實現基因OCT4的敲除和敲入。Lai等[40]構建了一個豬OCT4的報告系統，其內源性OCT4啟動子可直接控制RFP，因此熒光能準確地顯示內源性OCT4的激活，并獲得了在內源性OCT4基因啟動子下游具有tdTomato基因敲入的豬胎兒成纖維細胞（PFF）系。Cas9系統編輯的PFFs被用作體細胞核移植（SCNT）的供體細胞，在SCNT胎兒的囊胚和生殖嵴中檢測到了強大的RFP表達，并制備了兩頭有生命力的基因編輯豬。

2.2 提高生產性能

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）基因對肌肉生長發育具有重要調控作用。Crispo等[41]、Cyranoski[42]、Wang等[43]和張冬杰等[44]利用Cas9系統獲得了MSTN基因的雙等位基因敲除豬。湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所Bi等[45]應用Cas9系統制備了無選擇標記的MSTN基因敲除克隆豬。首先，利用Cas9系統介導的同源重組敲除豬初生細胞中MSTN的一個等位基因。然后，用Cre重組酶來切除選擇標記基因，有效率為82.7%。免疫印跡顯示，克隆豬MSTN大約有50%的降低，同時肌原性基因在肌肉中的表達有所增加。組織學顯示，肌纖維數量增加，但是肌纖維大小保持不變。超聲波檢測顯示，最長肌大小增加，背部脂肪厚度降低。該研究提供了一種可靠的途徑用于家畜良種生產，也提出了一種策略來減少潛在的生物學風險。中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所的李奎教授領導研究團隊，首次利用Cas9系統獲得了位點特異性的基因敲入豬模型[46]，得到一個新的基因組“安全港”位點：pH11位點，通過Cas9系統分別在細胞、胚胎和動物體內的該位點插入了大于9 kb的基因片段，實現了穩定高效的基因表達。

分化簇 163（Cluster of differentiation 163，CD163）被認為是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的受體基因，分化簇1D（CD1D）是一類抗原遞呈因子。Whitworth等[47]利用Cas9系統分別敲除CD163和CD1D的基因編輯豬；經過藍耳病毒株攻毒后CD163雙等位基因敲除豬未表現出臨床癥狀，具有良好的抗藍耳病能力。中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所利用Cas9系統進行抗PRRSV和抗豬傳染性胃腸炎（PEDV）的CD163和CD13雙基因編輯豬的制備，正在開展相關驗證鑒定工作。這些研究在養豬業引起了高度關注。

2.3 研究人類疾病的動物模型

豬是人類醫學研究極佳的動物模型。vWF（von Willebrand factor）的基因是引起人血管性血友病的主因。Hai等[48]應用Cas9系統靶向豬vWF外顯子，目的基因插入/缺失突變效率達到 68.8%（11/16）；單等位基因突變和雙等位基因突變的vWF抗原水平均極顯著低于野生型個體（P

再如，去除所有主要淋巴細胞的豬是研究人X-染色體連鎖的嚴重聯合免疫缺陷（SCID）患者病毒感染和免疫受損發病機理的理想動物模型。破壞IL2RG的豬比嚙齒動物敲除IL2RG模型更接近于SCID表型。Lei等[50]利用Cas9系統快速生成雙基因RAG2/IL2RG敲除豬，成功建立了人諾如病毒（HuNoV）感染的免疫缺陷的豬模型，因為RAG2/IL2RG缺陷豬缺乏B細胞、T細胞和自然殺傷細胞。Yu等[51]成功地通過Cas9系統在滇南小型豬產生人類DMD疾病動物模型。

2.4 醫學生物反應器

豬除了作為人類疾病模型外，也可作為生產人類需要的產品反應器。例如，賴良學課題組利用精確Cas9系統對豬胰島素基因進行了無痕定點修飾，3頭可以分泌人胰島素的克隆豬，其中2頭完全分泌人胰島素，而不含豬胰島素；另一頭既分泌人胰島素也分泌豬胰島素。牛泌乳量大、乳汁活性蛋白的產量高，因此其乳腺是理想的生物反應器，Peng等[52]通過CRISPR技術建立了人血清白蛋白的生物生產器。人成纖維細胞生長因子2（hFGF2）是一種多功能生長因子，在促進組織生長發育、新血管形成和參與組織修復過程中起著重要的作用，但其在人體內的表達量較低。Jeong等[53]借助Cas9系統將該基因導入到牛成纖維細胞的β-casein基因內含子中，為獲得表達hFGF2蛋白的基因編輯牛奠定了基礎。谷氨酸棒桿菌是工程化應用傳統方法（同源重組）批量生產氨基酸的重要生物機體。Cleto等[54]采用CRISPRi降低該菌的基因PGI和PCK的表達高達98%，降低基因PYK高達97%，從而大大增強了L-賴氨酸和L-谷氨酸產品滴度的比率。這種新谷氨酸代謝工程方法只需要3 d時間，表明CRISPRi可用于快速且有效地代謝途徑改造，而不需要對基因缺失或突變。

2.5 異種器官移植

據不完全統計，全世界大概有200萬人需要器官移植，而器官捐獻的數量遠遠低于需求數量[55]。尤其是老齡化和慢性疾病的多發，更加導致供體器官嚴重不足。豬被認為是人體異種器官來源的首選動物，因為豬與其他哺乳動物比較，無論從器官大小、生理結構和基因組相似度都更接近于人，因此，上世紀90年代應用豬生產人類器官項目一度在全球受到追捧，但受阻于豬內源性逆轉錄病毒（Porcine endogenous retrovi-ruses，PERVs）造成的重大醫療風險。哈佛大學利用Cas9系統對豬腎細胞系PK15中所有62個拷貝的PERV pol（多聚酶）基因敲除，使內源性病毒傳遞給人的風險降低了1 000倍以上[56]。該研究掃除了豬器官用于人體移植的安全障礙，為全世界亟需器官移植的上百萬病人帶來希望，也重新燃起了大家對異種器官移植的信心。

免疫排斥反應是豬器官移植另一障礙。α-1，3-半乳糖基轉移酶（GGTA1）基因與異種器官移植后的超急性免疫排斥反應顯著相關，Sato等[57]在豬胎兒成纖維細胞中通過Cas9系統獲得了GGTA1雙等位基因敲除的細胞系。Li等[58]針對3個與免疫排斥相關的基因GGTA1、胞苷單磷酸N-乙酰神經氨酸羥化酶（CMAH）和異紅細胞糖苷酯合成酶（iGb3S）基因，共轉染靶向這2個或3個基因的CRISPR/Cas9-PX330構質粒，最終獲得了敲除單個基因及同時敲除2個或3個基因的胎兒或仔豬。利用類似的方法，Estrada等[59]對豬肝臟細胞分別敲除GGTA1、GGTA1/CMAH和GGTA1/CMAH/β4GalNT2（β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶2）基因。

3 CRISPR-Cas9系統的前景

CRISPR-Cas9系統在如此短的時間內極大地推動了生物學的各個方面研究，例如基因功能解析、基因治療、人類疾病動物模型、生物生產反應器和農業動植物優質遺傳育種。該技術生成的產品，定向改變但不含外源基因/片段，在驗證其安全性的基礎上，這種經過“基因組編輯”的產品更容易被消費者接受。理論上它不會帶來健康或環境方面的風險，但是否應該受到轉基因相關法律的約束，美國和歐盟的態度不一致。作為新興的基因組編輯技術，有必要進一步完善其特異性、脫靶效應和輸送方法，以及如何更好地激活細胞自身的同源重組，并探索新型基因組編輯技術及其應用，例如，新CRISPR-Cpfl系統[60]、新型NgAgo系統[61]；無序列限制的DNA編輯新工具[62]、納米顆粒技術[63]等等。

r業動植物改良從來都是一個漫長而繁瑣的過程，而如今，科學家因為有了CRISPR技術能夠快速而輕松地實現。近兩年，許多實驗室將這種工具應用在動植物和微生物中，以期獲得更高產、更適應環境和更優質的品種。有理由相信，CRISPR-Cas9系統將更好的服務于人類，包括動植物育種。

參考文獻：

[1] MOHANRAJU P，MAKAROVA KS， ZETSCHE B，et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems[J].Science，2016，353（6299）：5147.

[2] CHAVEZ A， SCHEIMAN J，VORA S，et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J].Nat Methods， 2015，12（4）：326-328.

[3] DIDOVYK A，BOREK B，TSIMRING L，et al. Transcriptional regulation with CRISPR-Cas9：Principles，advances， and applications[J].Curr Opin Biotechnol，2016，40：177-184.

[4] WRIGHT A，NUNEZ J，DOUDNA J. Biology and applications of CRISPR systems：Harnessing nature's toolbox for genome engineering[J].Cell，2016，164：29-44.

[5] CHENG A，JILLETTE N，LEE P，et al.Casilio：A versatile CRISPR- Cas9-Pumilio hybrid for gene regulation and genomic labeling[J].Cell Research，2016，26：254-257.

[6] KONERMANN S，BRIGHAM M，TREVINO A，et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex[J].Nature，2015，517（7536）：583-588.

[7] CHAVEZ A，TUTTLE M，PRUITT B，et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species[J].Nature Methods，2016，13：563-567

[8] DAIMON T，KIUCHI T，TAKASU Y.Recent progress in genome engineering techniques in the silkworm，Bombyx mori[J].Dev Growth Differ，2014，56：14-25.

[9] NIU Y，SHEN B，CUI Y，et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos[J].Cell，2014， 156： 836-843.

[10] MA H，TU L，NASERI A，et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow[J].Nat Biotechnol，2016，34（5）：28-30.

[11] ZALATAN J，LEE M，ALMEIDA R，et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds[J].Cell，2015，60：339-350.

[12] KEARNS NA，PHAM H，TABAK B， et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion[J].Nat Methods，2015，12（5）：401-403.

[13] XU X，TAO Y，GAO X，et al. A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation[J].Cell Discov，2016，2：16009.

[14] CHOUDHURY S，CUI Y，LUBECKA K，et al. CRISPR-dCas9 mediated TET1 targeting for selective DNA demethylation at BRCA1 promoter[J].Oncotarget，2016，DOI：10.18632/oncotarget.10234.

[15] LAUFER B，SINGH S. Strategies for precision modulation of gene expression by epigenome editing： An overview[J].Epigenetics Chromatin，2015，8（1）：1-12.

[16] SHALEM O，SANJANA N，ZHANG F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9[J].Nat Rev Genet，2015， 16（5）：299-311.

[17] WONG A， CHOI G， CUI C， et al. Multiplexed barcoded CRISPR-Cas9 screening enabled by CombiGEM[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（9）：2544-2549.

[18] MA Y，ZHANG J，YIN W，et al. Targeted AID-mediated mutagenesis（TAM） enables efficient genomic diversification in mammalian cells[J].Nat Methods， 2016， DOI：10.1038/nmeth.4027.

[19] ZHU S，LI W，LIU J，et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library[J].Nat Biotechnol，2016.DOI：10.1038/nbt.3715.

[20] NIHONGAKI Y，KAWANO F，NAKAJIMA T，et al. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing[J].Nat Biotechnol，2015，33（7）：755-760.

[21] POLSTEIN L，PEREZ-PINERA P，KOCAK D，et al. Genome-wide specificity of DNA binding， gene regulation，and chromatin remodeling by TALE- and CRISPR/Cas9-based transcriptional activators[J].Genome Res，2015，25（8）：1158-1169.

[22] HEMPHILL J，BORCHARDT E K，BROWN K，et al. Optical Control of CRISPR/Cas9 Gene Editing[J].J Am Chem Soc，2015，137（17）：5642-5645.

[23] DENG W，SHI X，TJIAN R，et al. CASFISH：CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（38）：11870-11875.

[24] KIANI S，CHAVEZ A，TUTTLE M， et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing， activation and repression[J].Nature Methods，2015，12（11）：1051-1054.

[25] XIE K，MINKENBERG B， YANG Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（11）：3570-3575.

[26] QI W，ZHU T，TIAN Z，et al. High-efficiency CRISPR/Cas9 multiplex gene editing using the glycine tRNA-processing system-based strategy in maize[J].BMC Biotechnol，2016， 16（1）：58.

[27] LI H， FUJIMOTO N， SASAKAWA N， et al. Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9[J]. Stem Cell Reports，2015，4：1-12.

[28] NIU X， HE W， SONG B， et al. Combining single-strand oligodeoxynucleotides and CRISPR/Cas9 to correct gene mutations in β-thalassemia-induced pluripotent stem cells[J].J Biol Chem，2016，291（32）：16576-16585.

[29] OU Z，NIU X，HE W，et al. The combination of CRISPR/Cas9 and iPSC technologies in the gene therapy of human β-thalassemia in mice[J]. Sci Rep，2016，6：32463.

[30] SONG B， FAN Y， HE W， et al. Improved hematopoietic differentiation efficiency of gene-corrected beta-thalassemia induced pluripotent stem cells by CRISPR/Cas9 system[J]. Stem Cells Dev，2015，24（9）：1053-1065.

[31] SHECHNER D， HACISULEYMAN E， YOUNGER S， et al. Multiplexable， locus-specific targeting of long RNAs with CRISPR-Display[J]. Nat Methods，2015，12（7）：664-670.

[32] YOSHIMI K， KUNIHIRO Y， KANEKO T， et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes[J]. Nat Commun，2016，7：10431.

[33] HESS G， FRéSARD L， HAN K， et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells[J]. Nat Methods，2016，DOI：10.1038/nmeth.4038.

[34] WEST J， GILL W. Genome Editing in Large Animals[J]. J Equine Vet Sci，2016，41：1-6.

[35] SU Y， LIN T， Huang C， et al. Construction of a CRISPR-Cas9 system for pig genome targeting[J].Anim Biotechnol，2015， 26（4）：279-288.

[36] WANG X， ZHOU J， CAO C， et al. Efficient CRISPR/Cas9-mediated biallelic gene disruption and site-specific knockin after rapid selection of highly active sgRNAs in pigs[J]. Sci Rep，2015，5：13348.

[37] HE Z， SHI X， DU B. Highly efficient enrichment of porcine cells with deletions induced by CRISPR/Cas9 using dual fluorescence selection[J]. J Biotechnol，2015，214：69-74.

[38] 墻鵯啵梅 瑰，劉志國，等.應用SSA 報告載體提高ZFN和 CRISPR/Cas9對豬IGF2基因的打靶效率[J].遺傳，2015，37（1）： 55-62.

[39] KWON J， NAMGOONG S， KIM N. CRISPR/Cas9 as tool for functional study of genes involved in preimplantation embryo development [J]. PLoS One，2015，10（3）：e0120501.

[40] LAI S， S WEI， B ZHAO， et al. Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering[J]. PLoS One，2016，11（1）：e0146562.

[41] CRISPO M， MULET A， TESSON L， et al. Efficient generation of myostatin knock-out sheep using CRISPR/Cas9 technology and microinjection into zygotes[J]. PLoS One，2015， 10（8）： e0136690.

[42] CYRANOSKI D. Super-muscly pigs created by small genetic tweak[J]. Nature，2015，523：13-14.

[43] WANG K， OUYANG H， XIE Z， et al. Efficient generation of myostatin mutations in pigs using the CRISPR/Cas9 system[J]. Sci Rep，2015，5：16623..

[44] 張冬杰，劉 娣，張 旭，等.利用CRISPR-Cas9系統定點突變豬MSTN基因的研究[J].畜牧獸醫學報，2016，47（1）：207-212.

[45] BI Y， HUA Z， LIU X， et al. Isozygous and selectable marker-free MSTN knockout cloned pigs generated by the combined use of CRISPR/Cas9 and Cre/LoxP[J]. Sci Rep，2016， 6：31729.

[46] RUAN J， LI H， XU K， et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs[J]. Sci Rep，2015，5：14253.

[47] WHITWORTH K， ROWLAND R， EWEN C， et al. Gene-edited pigs are protected from porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Nat Biotechnol，2014，34（1）：20-22.

[48] HAI T， TENG F， GUO R， et al. One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system[J]. Cell Res，2014，24：372-375.

[49] ZHOU X， XIN J， FAN N， et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated gene-targeted pigs via somatic cell nuclear transfer[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2015，72（6）：1175-1184.

[50] LEI S， RYU J， WEN K， Increased and prolonged human norovirus infection in RAG2/IL2RG deficient gnotobiotic pigs with severe combined immunodeficiency[J]. Sci Rep，2016，6： 25222.

[51] YU H， ZHAO H， QING Y， et al. Porcine zygote injection with Cas9/sgRNA results in DMD-modified pig with muscle dystrophy[J]. Int J Mol Sci，2016，17（10）：1668.

[52] PENG J， WANG Y， JIANG J， et al. Production of human albumin in pigs through CRISPR/Cas9-mediated knockin of human cDNA into swine albumin locus in the zygotes[J]. Sci Rep，2015，5：16705.

[53] JEONG Y， KIM Y， KIM E， et al. Knock-in fibroblasts and transgenic blastocysts for expression of human FGF2 in the bovine β-casein gene locus using CRISPR/Cas9 nuclease-mediated homologous recombination[J]. Zygote，2015，22：1-15.

[54] CLETO S，JENSEN J V，WENDISCH V F， et al. Corynebacterium glutamicum metabolic engineering with CRISPR interference （CRISPRi）[J]. ACS Synth Biol，2016，5（5）：375-385.

[55] COOPER D，EKSER B， RAMSOONDAR J， et al. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research[J]. J Pathol，2016，238（2）：288-299.

[56] YANG L， G？BELL M， NIU D， et al. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses （PERVs）[J]. Science， 2015，350（6264）：1101-1104.

[57] SATO M， MIYOSHI K， NAGAO Y， et al. The combinational use of CRISPR/Cas9-based gene editing and targeted toxin technology enables efficient biallelic knockout of the a-1，3-galactosyltransferase gene in porcine embryonic fibroblasts[J]. Xenotransplantation，2014，21：291-300.

[58] LI P， ESTRADA J， BURLAK C， et al. Efficient generation of genetically distinct pigs in a single pregnancy using multiplexed single-guide RNA and carbohydrate selection[J]. Xenotransplantation，2015，22（1）：20-31.

[59] ESTRADA J， MARTENS G， LI P. Evaluation of human and non-human primate antibody binding to pig cells lacking GGTA1/CMAH/β4GalNT2 genes[J].Xenotransplantation，2015， 22（3）：194-202.

[60] ZETSCHE B， GOOTENBERG J S， ABUDAYYEH O O ，et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-cas system[J]. Cell，2015，163（3）：759-771.

[61] GAO F， SHEN X， JIANG F， et al. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute[J]. Nat Biotechnol，2016，34（7）：768-773.

篇8

一、 微生物培養中的篩選問題

對于微生物來說，不同的微生物需要不同的培養基。培養基就是根據不同微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。從物理性質來講，常用固體培養基通過平板劃線分離法或稀釋涂布分離法進行分離篩選目的菌種，如在以尿素為唯一氮源的固體培養基中，采用稀釋涂布分離法可篩選出以尿素為唯一氮源的微生物；從目的用途上講，常用選擇培養基進行篩選目的菌種。選擇培養基就是在培養基中加入某種化學物質，抑制不需要的微生物生長，以獲得人們所需的微生物。如培養基中缺乏碳源可篩選出自養型微生物，培養基中缺乏氮源可篩選出自生固氮菌，培養基中加入高濃度食鹽可篩選出金黃色葡萄球菌。利用微生物進行現酵生產，其首要任務就是通過上述方法從自然界中分離篩選出符合生產要求的單一優良野生菌種，然后再經過誘變育種、基因工程或細胞工程獲得優良菌種。

二、基因工程中的篩選問題

基因工程的核心步驟是形成重組DNA，即用同一種限制酶處理目的基因和質粒，使其露出相同的粘性末端，然后在適量的DNA連接酶作用下，形成一個封閉式的環狀DNA。這些環狀DNA有兩種是由一個DN段形成的，即目的基因環狀物和質粒環狀物；有三種是由兩個DN段形成的，即質粒自連的環狀物（即普通質粒）、目的基因自連的環狀物、質粒與目的基因相連的環狀物（即重組質粒或重組DNA）。

如何從這五種環狀物中篩選出重組質粒，并將其導入到受體細胞呢？首先要選擇質粒，選擇的質粒應具備兩種或兩種以上抗生素抗性基因，如圖1所示。然后將目的基因插入到其中的一個抗生素抗性基因，如將目的基因插入到四環素抗性基因（Tetr），導致Tetr結構破壞而無法表達。

在進行導入操作時，普通質粒和重組質粒都可能導入受體細胞，而目的基因自連的環狀物無法導入，因此在導入操作后存在三種受體細胞的混合物：多數沒有導入任何質粒的受體細胞（普通受體細胞）、很少導入普通質粒的受體細胞（不含目的基因）和導入重組質粒的受體細胞（獲得目的基因）。

第一次篩選：將含有三種受體細胞的混合物接種到含氨芐青霉素的選擇培養基中培養，普通受體細胞不含氨芐青霉素抗性基因（Ampr）無法生存，而導入普通質粒和重組質粒的受體細胞都具有Ampr，所以都能生存和增殖，長成菌落。從而篩選出導入普通質粒和重組質粒的受體細胞。

第二次篩選：采用影印接種法，即用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板略小的圓柱形木塊上，構成印章（即接種工具，圖2和圖3A所示）；然后把前述經過第一次篩選長出菌落的母平板倒置在絲絨的印章上，輕輕印一下（圖3B）；再把此印章在另一個含四環素抗性基因的選擇培養基（圖3D）的平板上印一下。這樣，由于重組質粒的Tetr被目的基因破壞，不能形成菌落的即為含有重組質粒的受體細胞，根據對比（如圖3C和3D所示），就能在母平板的培養基上篩選出含有目的基因的受體細胞。

三、細胞工程中的篩選問題

1. 植物體細胞雜交

在植物體細胞雜交過程中，將A和B兩細胞去細胞壁后人工誘導原生質體融合形成融合體（AB），還有未融合體（A、B）、多元融合體（AA、BB）和嵌合體。但只有AB型細胞是植物體細胞雜交所需的雜種細胞。因此在雜種細胞形成后還應有一個篩選過程。篩選的方法有：（1）突變細胞系互補選擇法：包括葉綠體缺失互補、營養缺陷互補、抗性互補和遺傳互補等，前兩種為隱性性狀，其實施的關鍵是作為遺傳標記的有關突變體的利用。遺傳互補是一種很好的篩選方法， 即兩個突變的細胞融合后才能正常生長，但由于受到突變體不易獲得的限制，且有些突變體不易再生，該法應用并不廣泛；（2）物理特異性差異選擇法：利用兩個原生質體親本的物理特異性差異的選擇，例如根據愈傷組織的顏色、熒光特性等在顯微鏡下機械分離雜種細胞。當以熒光特性作為依據時，可采用流式細胞光度儀來分離雜種細胞，該法不但準確、效率高，而且用熒光化合物標記原生質體并不影響細胞再生植株的能力，但價格昂貴；（3）生長特異性差異選擇法：根據兩種原生質體親本的生長特異性（如形態、色澤）來選擇；（4）不對稱融合法：不對稱融合指一方親本的全部原生質體與另一方親本的部分核物質及胞質重組，產生不對稱雜種。一般用碘乙酰胺處理受體使其酶失活，單獨培養不能生長和分裂；而供體由于受到射線輻射，大部分染色體受到損傷，細胞不能生長；只有融合體發生互補作用才能生長，從而篩選出雜種細胞。

融合后的原生質體，在適當的培養條件下，可以再生出新的細胞壁，進而進行細胞分裂及分化，形成再生植株。獲得再生植株后， 還必須對其進行嚴格的鑒定，可以從基因組DNA和基因表達兩方面來進一步確認。前者主要是利用各種已知的分子標記如限制性片段長度多態性、隨機擴增多態性DNA、簡單重復序列、擴增片段長度多態性等進行雜種鑒定， 后者主要是通過同工酶、次生代謝產物的分析來確定雜種植株。例如Austin等通過對再生植株蘋果酸脫氫酶、磷酸葡糖異構酶等酶的同工酶進行分析獲得了雜種植株。 此外，形態學（植株表現型）及細胞學（染色體的形態和數目）的觀察和比較也是常用手段。

2. 單克隆抗體的制備

在單克隆抗體的制備過程中，首先用相應抗原刺激小鼠，當從小鼠脾臟中分離出能產生抗體的效應B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合時，將會形成多種細胞的混合體，包括B淋巴細胞、骨髓瘤細胞、B－B融合細胞、骨髓瘤－骨髓瘤融合細胞、B－骨髓瘤融合細胞（即雜交瘤細胞）和細胞多聚體（容易死亡，無需篩選），如何從混合細胞中提取到雜交瘤細胞呢？

第一次篩選：目的是獲得代謝缺陷型骨髓瘤細胞。通過突變誘導次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞，并經過毒性培養基篩選出的HGPRT-或TK-骨髓瘤細胞。具體方法是將誘導突變的骨髓瘤細胞放入含氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤的培養基上，含HGPRT的骨髓瘤細胞會將氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤轉變成相應的核苷酸形式參與DNA合成而發生毒性作用，使細胞致死。而HGPRT-骨髓瘤細胞由于HGPRT活性喪失，不能使用含氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤，能生活在高濃度的含氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤的培養基上。同理，在培養基中加入5－溴尿嘧啶脫氧核苷（BudR），可篩選出TK-骨髓瘤細胞。

第二次篩選（圖4中A過程）：目的是從5種細胞中篩選出雜交瘤細胞（用HAT選擇培養基）。HAT選擇培養基是在普通培養液中加入次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質配制而成。而細胞的DNA合成途徑有兩條：主要合成途徑（D途徑）是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為輔酶參與，而氨基蝶呤是葉酸的抑制物，可阻斷細胞合成DNA。輔助途徑（S途徑）可直接利用外源核苷酸合成DNA，在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在情況下，經次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用下合成DNA。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞和融合的骨髓瘤－骨髓瘤細胞由于培養基中氨基蝶呤存在無法利用D途徑合成DNA；又因缺乏HGPRT或TK，不能利用S途徑合成DNA而死亡。未融合的B淋巴細胞和融合的B-B淋巴細胞雖具有HGPRT和TK，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有雜交瘤細胞從B淋巴細胞獲得了HGPRT和TK，并具有骨髓瘤細胞無限增殖的特性，所以能在HAT培養基中存活和增殖，從而最終篩選出雜交瘤細胞。

第三次篩選（圖4中B過程）：目的是獲得產生特異性抗體的雜交瘤細胞。在實際免疫中，由于實驗小鼠在注射目標抗原前，其體內已有大量病原體，會存在大量的針對不同類型抗原的效應B細胞，因此不同的雜交瘤細胞產生的抗體也不同。目前從雜交瘤細胞群中篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞最常用的方法是有限稀釋法，將處于對數生長期的雜交瘤細胞用培養液充分稀釋后，接種在多孔的細胞培養板上，使每一孔含一個雜交瘤細胞，再由這些單細胞克隆生長，當細胞培養形成群落到覆蓋10%～20%孔底時，吸取培養液的上清液用酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）測定，其原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在聚苯乙烯等固相載體上的可溶性抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應。利用上述方法可篩選出針對目標抗原的抗體的陽性雜交瘤細胞，并使其擴大培養或冷凍保存。

四、胚胎工程中的篩選問題

篇9

關鍵詞：肝炎病毒，乙型；基因；變異(遺傳學)

乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)的基因組由長度為3200個堿基對、部分雙鏈的環狀DNA分子構成，含有4個部分重疊的開放讀碼框架(OpenReadingFrame，ORF)，即SORF、CORF、PORF和XORF。HBV的聚合酶(Polymease，Pol)/逆轉錄酶(ReverseTranscriptase，RT)缺乏糾錯功能，允許復制錯誤發生。復制錯誤將導致多種不同的HBV準種的出現。

1、SORF變異

HBVDNA的SORF包括前-S1區、前-S2區(兩者合稱前-S區)和S區，編碼產物最基本的功能是構成HBVDane顆粒的包膜蛋白。目前的研究認為，SORF編碼的大蛋白具有反式激活功能，與HBV的復制密切相關，而且血清大蛋白的檢測對評估慢性乙型肝炎患者的病毒感染狀況和隱匿性HBV感染患者的檢出具有重要意義[1-2]。

前-S1區和前-S2區與P基因的空白區重疊，這兩個區域都具有B細胞和T細胞的識別位點。一些前-S1區的變異可以導致被截斷的大蛋白在胞漿內的積聚，這會抑制病毒的分泌并具有細胞毒效應。但是，Gao等[3]研究發現，在有的肝癌患者體內，大蛋白完全缺失的HBV也可以成為優勢種群，他們認為，是患者體內的野生型前-S蛋白修復了這種缺陷，即體內的野生株HBV幫助了這種缺陷病毒株，確保了其在體內的存活。前-S2區變異包括前-S2ATG的缺失或錯配，引起蛋白合成終止以及B細胞和T細胞表位的缺失或改變。前-S變異經常出現在應用干擾素治療的患者中[4]。前-S區的缺失變異會影響大蛋白對小蛋白的比例，導致與肝病惡化相關的內質網壓力過大，進而引發大蛋白或中蛋白與宿主染色體整合，增加了肝細胞癌變的可能[5]。Mun等[6]研究發現，前-S區缺失的頻率隨肝臟疾病的臨床嚴重程度逐漸增加，但前-S1和前-S2的缺失頻率是有差別的，前-S1缺失在肝細胞癌患者中發生率最高，而前-S2缺失在肝硬化患者中發生率最高。

S區點變異可導致逃逸變異株的出現，變異通常發生在HBsAga抗原決定簇區域，目前報道較多的變異形式多為sG145R[7]。此外，基因分析表明，sP120A變異與HBsAg血清抗體轉換有關，這種變異降低了抗-HBs的結合作用，使HBsAg的檢測失敗[8]。文獻報道，有10個S基因變異與疫苗免疫逃逸相關，分別是sP120T、sI/T126N/A、sQ129H、sM133L、sK141E、sP142S、sD144A、sG145R、sF158Y和sF161Y[9]，但這些變異的臨床意義還有待進一步研究。

2、CORF與XORF變異

HBVDNA的CORF包括前核心區和核心區，有各自的翻譯起始密碼子ATG，分別編碼前核心蛋白和核心蛋白。

前核心蛋白經過修飾最終形成可溶性抗原HBeAg。核心啟動子變異和前核心變異均會影響HBeAg的表達。HBVDNA的XORF編碼HBx蛋白。HBx蛋白是一種多功能病毒蛋白，具反式激活作用。

在從HBeAg-/抗-HBe+的患者體內分離到的病毒株中，A1762T和G1764A雙重變異是最常見的BCP變異形式。

這種變異會引起HBx蛋白結構中兩個氨基酸的變化進而影響HBx蛋白的活性以及改變病毒增強子的反轉錄作用[10]，與肝細胞癌的發生關系密切[11]。Fang等[12]通過3年的縱向病例分析得出，A1762T和G1764A雙重變異與HBeAg+患者體內較低的病毒載量有關，但對HBeAg-患者體內的病毒載量沒有影響。T1766/A1768變異與暴發性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的發生有關聯。Ren等[13]的研究表明，慢加急性肝衰竭(無肝硬化基礎)的患者與慢性乙型肝炎患者相比，A1762T/G1764A檢出率顯著增高。

前核心變異株則通過干擾前核心讀碼框架而完全終止HBeAg的表達，有時還伴隨著起始密碼子錯配變異和前核心區的框架移位變異。最常見的前核心變異是前核心區28位密碼子(Codon28)由TGG變為TAG(G1896A)。核心區發生變異會終止HBeAg的表達，引起HBeAg陰性肝炎。由于HBeAg與HBcAg有共同的抗原決定簇，缺少HBeAg有可能使表達HBcAg的肝細胞更容易受到免疫細胞的攻擊，臨床上表現為HBeAg陰性肝炎病情容易出現反復，發生暴發性肝炎(肝衰竭)的幾率增高。有研究發現，慢加急性肝衰竭患者的G1896A變異率顯著高于慢性乙型肝炎患者[13]。

A1762T/G1764A和G1896A檢測有助于區分臨床上慢性乙型肝炎急性發作和急性乙型肝炎[14]。

與以上研究相反，有研究者認為，核心啟動子變異和前核心變異不會引起肝臟功能失代償，而是對肝臟功能失代償起保護性的影響，HBV基因型與肝臟功能失代償也沒有明顯的關系[15]。Poustchi等[16]通過研究認為，在慢性乙型肝炎D基因型患者中，BCPA1762T和G1764A雙重變異與肝臟疾病惡化相關，而G1757A變異卻對宿主有一定的保護作用。

核心區編碼基因相對保守，其編碼的核心蛋白是宿主免疫反應攻擊的主要靶抗原，它的變異可直接影響到宿主對HBV的免疫應答。有研究顯示，核心區變異株(G87、V60)與野生株比較，前者可使宿主細胞內HLA-ⅠmRNA及其蛋白的表達水平降低[17]。Sugiyama等[18]研究認為，核心區A2339G(codon147)變異在體外會增強HBV的復制；而且發生此變異的患有慢性乙型肝炎的兒童和沒有此變異的患有慢性乙型肝炎的兒童相比，在血清HBeAg抗體轉換之前，前者的ALT峰值較高。

3、PORF變異

從HBVDNAPORF的N-末端到C-末端，共涉及4個功能區，即末端蛋白區、間隔區、Pol/RT區、核糖核酸酶H區。RT區又包括7個功能亞區，從RT區上游第1個氨基酸起依次為A、B、C、D、E、F、G亞區。當前所有耐核苷(酸)類藥物的基因變異位點都位于RT區。

拉米夫定為胞嘧啶左旋核苷類似物，其耐藥變異位于RT區C亞區的YMDD基因序列，最常見的變異為rtM204I/V/S，而A亞區L80I變異以及B亞區rtV173L變異和rtL180M變異為其補償突變，以維持病毒的復制力[19]。文獻報道，拉米夫定也可誘導B亞區rtA181T/S變異[20]。替比夫定為胸腺嘧啶左旋核苷類似物，與LAM均為左旋核苷類藥物，分子結構和作用目標位點相似，因此二者存在交叉耐藥，常見變異為rtM204I。阿德福韋酯為無環腺苷類似物，RT區D亞區rtN236T變異與B亞區rtA181V變異是ADV的常見耐藥變異形式。有文獻將rtA181T變異也歸為阿德福韋耐藥變異，但還尚存爭論[20]。恩替卡韋為鳥嘌呤核苷類似物，其耐藥特點是發生在拉米夫定耐藥的背景上，耐藥位點是在LAM耐藥位點基礎上另加B亞區T184、S202和/或M250變異。

此外，在未應用過核苷(酸)類藥物治療的慢性乙型肝炎患者中，YMDD基因序列變異的發生率從1%-27%不等[21]。

因此，有必要在應用核苷(酸)類藥物治療前對患者進行HBV耐藥變異檢測[22]。

4、小結

HBV是一種高變異的嗜肝DNA病毒。HBV基因變異可以在宿主自身免疫應答、病毒復制適應性等內因的影響下發生，也可以發生于核苷(酸)類藥物或疫苗接種等外因作用之后。HBV變異是影響其感染發生、發展和轉歸的重要因素。HBV基因變異常常引起病毒生物學特性的改變，在引發疾病的臨床表現、診斷、預后和預防等方面帶來很多新的問題。

5、參考文獻

篇10

7月11日下午5點左右，愛爾蘭都柏林的物理學家尚恩·伯爾金及其同事捕捉到了科學史上最激動人心的一滴液滴滴落—瀝青。這個實驗開始于1944年，目的是為了展現瀝青的高黏度和低流動性。澳大利亞布里斯班昆士蘭大學更是早在1927年就開始進行這項實驗，目前已滴下8滴瀝青，遺憾的是一次都沒有拍到。

植入記憶或成真

美國麻省理工學院腦與認知科學系利根川進教授的研究團隊7月25日宣布，他們已成功給小鼠的大腦植入虛假記憶，從實驗上證實了人為改造記憶的可能性。研究者通過光遺傳學手段標記并激活與一個特定記憶相關的腦細胞，從而人為激活某個記憶過程。下一步，這個研究團隊計劃通過選擇性地標記并關閉與某一個記憶有關的腦細胞，研究是否可弱化甚至抹除記憶。

實驗室牛肉就要走上餐桌？

8月5日，澳大利亞和美國的兩位美食家在倫敦受邀試吃了一個實驗室培育的牛肉漢堡。這種牛肉由荷蘭馬斯特里赫特大學教授馬克·珀斯特領銜的實驗室培育，利用牛肉肌肉干細胞創造出了更多的肉類纖維。兩位美食作家品嘗完漢堡后評價道：有肉味，但質地比較干，味道也有些淡而無味。不過馬克·珀斯特認為，該項目將為畜牧業找到一種可持續的替代行業。

最大病毒被發現

法國埃克斯-馬賽大學的研究者在智利沿海和澳大利亞一處池塘發現了一種巨大的病毒，該種病毒有1微米（百萬分之一米）大，是一般病毒尺寸的10倍。而且，它的基因與地球上其他生物的基因的相似度僅為6%。科學家認為它起源于一種已滅亡的古老的細胞形態，甚至有可能來自外星球。雖然這種病毒的個子很大，不過研究者認為，它只存在于水下，應該不會對人類構成嚴重威脅。

光速為零

光速每秒30萬公里，但德國達姆施塔特工業大學物理學教授哈夫曼、胡布利克與博士生海恩斯讓光停了下來。他們利用“電磁感應透明”效應技術，讓光停留在水晶里長達60秒，打破了今年年初剛創造的16秒的世界紀錄。這項研究也為專家把光加速到超越宇宙限制提供了線索，也許有一天人類可以把數據存在光里傳到很遠的地方。

木衛二或適合人類居住

火星上是否有生命跡象的探索尚未得出結論，美國科學家又將目標鎖定到木星的衛星木衛二身上。加州理工學院的天文學家邁克·布朗教授和美國航天局噴氣推進實驗室的凱文·漢德共同編寫的報告認為，木衛二海洋的構成可能與地球海洋非常接近，這對生命存在的可能性非常重要。而美國宇航局已經委派一個科學家小組考慮發射航天器在木衛二著陸后的具體目標。

如果孩子也可以“定制”

一個叫做康納·列維的健康男嬰近日在媒體曝光，他于5月18日出生在美國賓夕法尼亞州，是世界上首例基因篩查試管嬰兒。列維的父母曾將胚胎細胞寄給了牛津大學的醫學專家，后者對細胞進行了基因篩查，以查看是否存在染色體異常或缺失。根據篩查結果，美國的醫生將染色體正常的胚胎移入母親的子宮中，這名男嬰因而誕生。這項技術的初衷是為了盡可能減少懷孕失敗的概率，但是基因篩查技術的成熟和成本的下降，更多符合父母預期的“定制嬰兒”或將出現。