不同微生物菌落特征范文

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關鍵詞：燒烤 微生物 大中型餐廳 小型攤位 污染

中圖分類號：R155 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）02-0016-02

“民以食為天，食以潔為先”，食品安全是關系到國計民生的大事[1]。隨著經濟社會不斷進步，人們生活水平的日益增長，人們的飲食種類也越來越多樣化，食品的安全問題也隨之而來。在食品安全問題中，由于微生物污染所造成的食源性疾病依舊是世界食品安全中最為突出和最為關注的問題，而食品微生物檢測是評價食品品質的重要方法之一[2]。按照我國食品衛生標準的規定，絕大多數食品均需要測定菌落總數、大腸菌群、致病菌等微生物指標以評價其衛生狀況[3-6]。菌落總數測定是用來判定食品被細菌污染的程度及衛生質量，它反映食品在生產過程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價。大腸菌群指的是需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，來自于人和溫血動物的腸道，直接或間接地來自人和溫血動物的糞便，是糞便污染的指示菌，在微生物檢測中常見菌落總數很高，但大腸菌數很低的情況。沙門氏菌廣泛存在于自然界中，是引起全球人類食物中毒的主要原因之一，在我國細菌性食物中毒的病原菌中約40%為沙門氏菌[7， 8]。近年來，金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒日益成為全球性的公共衛生問題，嚴重危害人類安全與健康[9]。

燒烤，這種人類最原始的烹調方式，逐漸成為受人歡迎的多人聚會休閑娛樂方式。然而燒烤這種食品存在著安全問題，燒烤食材在加工、貯藏、運輸等過程中很容易受到微生物污染。燒烤食品包括多種肉類、水產品類等。各類食材自身可能存在不同種類和不同程度的微生物，并且在食材的保存及制作過程中也可能由于操作不當容易造成交叉污染。畜禽在屠宰前若受到微生物感染，其病原微生物在體內可直接污染鮮肉，而在屠宰、加工等過程中鮮肉也可能受到微生物污染。在一般情況下，含水量高的水產類比肉類更容易受到微生物污染[10]，而且像生鮮肉類等食材在貯藏、銷售環節中，條件的不適宜也容易造成微生物的滋生；除原料自身的微生物污染以外，燒烤食品的加工處理過程是否規范、經營場所衛生條件是否符合標準、市場監管是否到位等對其衛生狀況及質量安全的影響也十分重要。本文通過對不同種類的燒烤食品的微生物污染狀況進行分析研究，分析主要的不合格原因，尋找防止燒烤食品微生物的關鍵環節，為加強食品衛生管理提供科學依據，以保障廣大消費者的身體健康。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來自長沙市燒烤餐廳及小型燒烤攤點，共購買采集樣品800份。其中，取自燒烤餐廳的樣品400份，小型燒烤攤點樣品400份，其中每份中都包括多種水產品類、多種鮮肉類。

1.2 采樣

用無菌采樣夾將樣品放入無菌采樣袋內，再將無菌袋放入到有冰袋的采樣箱中，2h內送回實驗室；部分室溫儲藏，部分放入冰箱冷藏，以保證與初始儲藏條件一致。

1.3 樣品檢測

分別按照GB/T 4789.2-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》測定、GB/T4789.3-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》、GB/T4789.10-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》、GB/T4789.4-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》和Filmplate測試片法對所采樣品進行檢測。

2 數據處理

實驗數據是通過sigmaplot11.0軟件進行統計分析，2種經營場所各種菌類合格率的比較用Duncan's methods單因素方法進行統計分析；*代表著兩種結果對比有顯著性差異，**表示兩種結果對比有極顯著性差異。通過使用Excel軟件對比較結果進行作圖。

3 結果與分析

3.1 菌落總數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌的檢測結果

按照GB2726-2005《熟肉制品衛生標準》，GB29921-2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》對燒烤食品進行比對分析[11-12]。2類經營場所中大中型燒烤餐廳中的食品合格率高些，菌落總數、大腸菌群、金黃色葡糖球菌的合格率分別為78.75%，89.75%，93.5%（表1）。而小型燒烤攤點出售的肉類和水產品類樣品合格率比較低，微生物污染狀況嚴重。此外，從小型燒烤攤點采集的樣品中，肉類和水產類的菌落總數、大腸菌群、金黃色葡糖球菌的合格率分別為69.5%，75.5%，82.5%（表2）。通過統計分析可知：小型燒烤攤位食品的微生物污染程度顯著高于大中型燒烤餐廳（圖1）。

3.2 沙門菌檢測結果

本實驗按照國標法分離出疑似沙門菌10株，接種到三糖鐵瓊脂得到疑似沙門菌9株，經過進一步生化及血清學實驗，結果不足以判定為沙門氏菌。用Filmplate測試片法將分離的疑似沙門菌在（36±1）℃培養15-24h后未發現紫紅色菌落。同種樣品沙門菌Filmplate測試片的檢測結果與國標方法一致。

4 討論

按照現行各類食品的國家衛生標準和國家安全標準，菌落總數、大腸菌群、致病菌3個指標中任何一個指標不合格均判定為不合格樣品。本實驗結果表明：大中型燒烤餐廳中的肉類和水產類食品，菌落總數的合格率為78.75%，并且通過檢測我們還發現大腸菌群、金黃色葡萄球菌存在超標現象。說明大中型燒烤餐廳的肉類食品存在著微生物污染問題。此外我們通過對小型燒烤攤位的燒烤食品進行檢測發現：小型燒烤攤位中肉類和水產類食品中大腸菌群、金黃色葡萄球菌的合格率均低于80%，而且其中的菌落總數合格率僅為69.5%。這表明小型燒烤攤位肉類和水產類食品存在嚴重的微生物超標。我們推測造成燒烤食品不合格的主要原因是：由于燒烤這類食品在生產加工后沒有包裝，食品暴露在污濁的空氣中，與外界直接接觸極易受到環境中微生物的污染[13]，尤其是一些小型燒烤攤位的攤點設在人流量較大的地方，因此受到的影響更為嚴重。其次燒烤食品的各類原料由于其性質和加工過程不一樣，所以在食品加工制造和儲運過程中也易造成微生物污染[14]，其次在制備不同種類的食材時，沒有注意及時的洗刷砧板，換工具等原因造成了二次污染。除此之外，燒烤食品中各種肉類和水產類由于其自身營養成分含量較高，也有利于微生物生長繁殖[15]。在本次檢測中小型燒烤攤點樣品大腸菌群超標率24.5%，故其存在腸道致病菌的可能性極大，其引起食源性疾病發生的潛在安全隱患不容忽視。

從菌落總數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌的檢測結果可以看出，大中型燒烤餐廳的微生物污染狀況整體好于小型燒烤攤點類。這可能是因為：大中型燒烤餐廳的肉類，水產類的食材來源可靠，食品質量衛生條件好；其次食材的貯藏，制作過程中條件有保障，還有就是大中型燒烤餐廳的環境衛生也優于小型燒烤攤位。表明正規經營場所、有力監管是食品質量安全的保障。大型經營燒烤餐廳的低溫冷藏設施條件基本完善，可以有效減緩細菌增值速度，且食具合格率高。但小型攤點類衛生狀況較差，食具、食材暴露在空氣中，大部分沒有冰柜冷藏食物，就餐者沒有安全感，應是監督管理、檢測的重點。

在對樣品進行沙門氏菌檢測時，每一批次樣品用國標法檢測大約需要7d，而用Filmplate測試片只需要1d，且測試片靈敏度高，在1.5 X 10-8稀釋時仍可計算出菌落；另外，Filmplate測試片的陽性檢出率高于分離培養法1.84‰，復查準確率提高12%。因此，用Filmplate測試片檢測沙門氏菌更準確、快捷。在本研究中沙門氏菌檢測結果為陰性，可能與單類食品的樣品數相對較少有關。如果增加取樣次數及取樣數量，可能更能夠顯示燒烤食品沙門氏菌污染的真實狀況。

5 結語

本實驗數據顯示，不論是大中型的燒烤餐廳還是小型燒烤攤點的燒烤食品均有部分樣品的微生物指標超出國家食品安全衛生標準。其中，菌落總數檢測顯示，在2種經營場所中，大中型燒烤餐廳的菌落總數的不合格率為78.75%；從小型燒烤攤點采集的肉類、水產類的樣品中，微生物污染均較為嚴重，菌落總數的合格率低于70%，小型攤點的經營方式使得燒烤食品無論菌落總數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌均比大中型餐廳的樣品污染更為嚴重。因此，在食用燒烤食品時最好選擇大中型經營餐廳，并且衛生條件要好的。同時，應對工作人員加強衛生知識教育，督促其規范操作，以減少污染，保障消費者健康。

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關鍵詞：微生物多糖；產多糖菌株；發酵條件優化

1 概述

多糖是一類天然大分子物質，由于具備優良的生物活性，大量的活性基團，因此在眾多研究領域有廣泛的應用[1][2][3]。微生物多糖是由微生物在發酵過程中產生，具備各種不同的生物活性，已經在抗腫瘤，抗感染以及石油化工等領域有了諸多的應用，并可以作為各種化學品，如絮凝劑，保鮮劑等在食品、醫藥、化工領域等發揮作用[4][5]。從海洋中篩選獲得產多糖微生物，目前也是產多糖微生物研究領域的研究熱點，在本課題中，以海水和秦皇島海域野生海藻進行取樣，篩選出產多糖的海洋微生物，并對該產多糖微生物的多糖發酵條件進行研究，獲得最佳的發酵條件，為多糖微生物的篩選及發酵研究提供了新的研究思路。

2 材料與方法

2.1 培養基

篩選固體培養基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L。

搖瓶液體培養基：蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，K2HPO3 2g/L。

2.2 試驗方法

2.2.1 產多糖菌的篩選

從海水及海藻取樣。各自稱量約10g海水和海藻塊，溶解于無菌水中，磁力攪拌作用得到菌懸液。分別標記為A和B。吸取稀釋液均勻涂布到已經滅菌的篩選固體培養基上，進行培養。觀察菌落形態，選擇粘稠菌落進行劃線分離純化保藏。將活化后的菌種接種到液體搖瓶培養基中，轉速為150r/min，震蕩培養48小時，選擇胞外多糖含量最大的菌種為后續研究菌種。

2.2.2 產多糖菌的發酵實驗

設定不同的發酵溫度，接種量，培養時間，確定最佳發酵條件。

2.2.3 胞外多糖含量的測定：

苯酚硫酸法[6]

2.2.4 菌株生理特征分析：

方法對照手冊。

3 結果與討論

3.1 產多糖菌的篩選

經過前期的培養實驗，挑選不同菌落并進行劃線分離培養后，本次試驗分離純化出6株菌落粘稠且不同形態的菌種。他們的培養基編號分別是A1號、B1號、B2號、A3號、B3號、B4號。并通過搖瓶發酵，取出發酵液進行觀察。經苯酚硫酸法測定后，B1的多糖產率最高，為后續研究菌種。

3.2 菌種生理特征

分析顯示B1為革蘭氏陽性菌，淀粉水解試驗陽性，V-P試驗陰性，檸檬酸鹽實驗陰性，油脂水解實驗陰性。

3.3 發酵條件優化

對產多糖菌B1的發酵條件進行優化，以期達到最佳的發酵效果和最大的多糖產量。

本課題中采用的是恒溫發酵過程，選擇不同的發酵溫度，并判斷其對產多糖效果的影響，20℃多糖產量為0.77g/L，25℃多糖產量為0.94g/L，30℃多糖產量為0.82g/L，35℃多糖產量為0.71g/L，40℃多糖產量為0.52g/L，多糖產量隨著發酵溫度的升高，先增加后減少，且當發酵溫度為25℃時，多糖產量達到最高，溫度高于30℃后，多糖產量明顯下降。在最佳的發酵溫度條件下，選擇不同的接種量，判斷海洋產多糖微生物發酵產量隨接種量的變化規律，2%接種量時，多糖產量為0.88g/L；5%接種量時，多糖產量為0.94g/L；8%接種量多糖產量為0.76g/L；10%接種量時，多糖產量為0.75g/L；15%接種量時，多糖產量為0.7g/L。接種量為5%時，多糖產率最高，接種量繼續增加，多糖的產量有所下降。在確定發酵溫度和發酵接種量的基礎之上，對發酵時間進行研究。24小時，產物濃度為0.47g/L，發酵產物的濃度隨在48小時達到最高為1.04g/L，而發酵36小時的產物濃度為0.94g/L，基本接近最高值，考慮到發酵時間的優化，最終確定發酵36小時為最佳的發酵時間。

4 結束語

本課題篩選一株能產生多糖的海洋微生物B1，對B1菌進行了生理生化特征分析，且對其發酵條件進行了研究，為進一步的應用研究提供了一定的理論基礎。

參考文獻

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微生物限度檢查法及其方法驗證的主要特點在于檢驗對象本身的特殊性。其特殊性為：（1）能繁殖的活細胞生物。該活細胞處于不穩定狀態，可隨存放時間延長而亡，也可在適宜條件下大量繁殖。而檢測條件的狀況不一可使其生長情況各異，因而常出現同批樣品在不同條件下檢測，有不同的結果。但在保存條件相對穩定時，微生物在一定時間內處于動態平衡，在標準化的條件下操作結果仍可予與正確評估。（2）不確定性。藥品受微生物的污染，其種類可以多樣，污染情況依生產、設備、原料、管理、劑型等條件而定，非藥品本身固有。被污染批次中的不合格品是一個隨機變量。（3）分布的不均勻性。這種不均勻性源于污染源的復雜性，如原輔料污染，工藝污染，空間污染和操作人員污染。再者，微生物具有簇團性，簇團大小，緊密程度是可遺傳的，簇團的分散性差異極大，該特點無疑強化了不均勻性。

除了上述檢驗對象本身的特殊性外，微生物限度檢查法及其方法驗證程序繁瑣，檢驗周期長，干擾因素多，容易造成檢驗結果誤差，現將主要原因分析如下。

1 標準菌株的選擇和保存不當引起的實驗誤差

實驗中的對照菌株必須為標準菌株，其生物學特性應典型穩定，其細胞群應具有相似性和合適的培養，儲存條件。如形態變異、菌落變異、耐藥性變異或受損等均可使平板中細菌呈叢集、分散不均或死亡。2005版藥典[1]要求所用標準菌株的傳代次數不得超過五代。

實驗中所用對照菌均為無芽孢桿菌，以菌液狀態存活的時間都不長。有研究表明[2]，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液和氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備的不同濃度菌液，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在3天內活菌數下降約40%，5天內下降約70%，用0.9%無菌氯化鈉溶液和氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液結果無明顯差異（冰箱4℃保藏）。建議采用新鮮培養物。

2 不同供試液制備方法造成的實驗誤差

應按供試品的理化特性與生物學特性采取適宜的方法制備供液，制備供試液時，力求均勻分散。測定結果與勻質方式及條件極為有關。如有菌，分散充分時菌落生長數多，反之則少。通常藥品都有一定的pH值，分散度不同導致供試液不同的pH值而影響微生物的生長，可得到不同的實驗結果。應按藥典首選勻漿儀法，并注意轉速和時間，確保制備均勻的供試液。轉速4000 r/min，時間2分鐘。試驗證明[3]，對8批水丸分別用勻漿儀和振蕩器處理后，測定細菌數，其結果后者比前者少一半，經統計學t檢驗分析，差異有顯著性（P

3 培養基的影響

培養基是培養檢測微生物的營養物，其質量的好壞，穩定與否直接影響檢驗結果。通過對電爐直火加熱融化培養基及用剩余培養基包扎冷藏后融化再使用的陽性對照實驗[5]，發現這兩種操作對實驗結果造成的誤差達21%和18%。多次反復加熱培養基，可使其中糖、微生物和氨基酸受破壞，影響質量。而pH值的改變影響更為嚴重，因各種微生物皆有其適宜生長繁殖的pH值。霉菌和酵母菌的培養基的pH是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養基的pH為中性或微堿性的注皿時溫度應控制在45℃，過高細菌易受損或致死。注皿量約15 ml，厚度約4 mm，薄水分易散失，不利于微生物生長，過厚需氧菌不利于生長。

一些選擇性培養基加入膽鹽作為抑菌劑，抑制革蘭陽性菌，使革蘭陰性菌能良好生長，但有試驗發現[6]，膽鹽用量過大對大腸埃希菌也有抑制作用，且當加菌量較大時，革蘭陽性菌也能生長。針對金黃葡萄球菌能耐高鹽而其他菌無此特性，對卵黃高鹽培養基中不同濃度的氯化鈉作了測試[7]。結果，試驗濃度均不能抑制大腸桿菌、枯草桿菌生長，其菌落數未見明顯差異。而一些對大腸桿菌抑制作用較強的藥品[8]，可將增菌液由膽鹽乳糖改為硫乙醇酸鹽，結果陽性檢出率為88%，大大高于膽鹽乳糖25%的檢出率。應注意大腸埃希菌MUG培養基其pH值滅菌后不得過7.4，否則pH值偏高，MUG自行分解，產生熒光。

一般情況下[9]，濕熱滅菌時，含有糖分的培養基溫度需控制在115 ℃ 15～20分鐘，不含糖分的培養基溫度需控制在121 ℃15～20分鐘?；⒓t培養基滅菌溫度在10℃以內的改變，可造成檢驗結果判斷錯誤[10]。

干粉培養基，易吸潮，如存放不當出現凝塊，則其凝固性較差，應避免使用。試驗用培養基，需經過質量鑒定，用已知典型反應菌株進行測試，其靈敏度及特征性反應應符合要求。新鮮配制的培養基應在2～20 ℃避光保存，但不得凍結，保存時間不得超過2周。分離平板在使用前應置36 ℃溫箱內倒置孵育1～2小時，使其表面溫暖濕潤，利于分離。培養基最好現用現配。

4 計數、觀察的誤差

當細菌生長小而密集時，極易發生計數誤差。菌落計數時應仔細觀察，必要時借助放大鏡或低倍顯微鏡觀察，以排除藥渣，培養基沉淀物和小氣泡等的干擾。如仍難區別，可適當延長培養時間。

菌落蔓延生長成片或發生重疊影響計數。藥典規定菌落如蔓延生長成片，不宜計數。這是由于平皿表面濕度過大，有利于動力菌泳動，促使菌落蔓延。某些劑型如密丸、水丸最易成片狀菌。防止的方法有: 0.001%TTC瓊脂法、開蓋干燥法或換陶瓦蓋法[11]。

不同的培養時間對計數結果的影響。樣品經24小時培養后，細小菌落容易漏掉，培養48小時后，菌落變大且有很多新生菌落，培養72小時后，菌落數增加不多，但菌落明顯變大。如細菌平皿有混雜的霉菌，因其生長旺盛，影響細菌的觀察計數。而霉菌在培養72小時后蔓延重疊生長嚴重，應于培養48小時后觀察標記，并且觀察時應輕拿輕放，忽反復翻轉，以免早期形成的孢子散落在平皿的其他部位，又萌生新的菌落，導致計數誤差。

控制菌生化反應均需按照規定的試驗要求進行，如大腸埃希菌、沙門菌的三糖鐵瓊脂斜面反應的時間應在（24±2）小時，時間過長過短，都可能出現錯誤結果判斷。所以應在規定的培養環境下，嚴格遵守培養時間，以便真實的反映計數結果。

5 設備及人員的影響

微生物的生長對溫度的要求也較為嚴格。在實際工作中盡管使用的都是恒溫培養箱，但大多數的培養腔內都沒有內置電扇，這樣便帶來溫度差異/分層，這種差異帶來的結果變化是顯著的。

玻璃儀器、容量儀器須效驗，保證取樣量的一致性，特別在陽性菌加入時顯得更為重要。

所用器械應洗滌干凈，不殘留酸堿及抑菌物質。對實驗所用器具根據材料的性質，采取相應的干熱滅菌、濕熱滅菌或消毒劑擦拭滅菌，且滅菌時間和溫度均有明確規定[1]。有實驗[12]對市售的12批75%酒精用薄膜過濾法進行微生物限度檢查，其中9批檢出微生物，經革蘭染色為陽性芽孢桿菌。經考證該濃度的乙醇均為供應商采用自制純化水稀釋高濃度醫用乙醇而成。由于75%乙醇本身含有細菌，作為消毒劑就會成為新的微生物污染源，建議采用0.2 μm的疏水濾膜過濾，棉球濕熱滅菌。

操作環境不合要求也會帶來誤差，應定期檢查無菌室的空氣是否符合規定。嚴格無菌操作，操作馬虎、隨便易造成供試品再污染及已污染微生物的繁殖或死亡，從而不能真實反映試驗結果。

6 抽樣、取樣誤差

微生物污染的不均勻性，勢必影響試驗結果[13]。遵循隨機原則的概率抽樣可以保證抽選出代表性較高的樣本，使樣品具有代表性，保證樣本推論總體的可靠性。

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關鍵詞：微生物學實驗課程；教學內容；教學方法；改革

Studies and practice for reforms of microbiological experiment in teaching contents and approaches

He Xiaoqing, Li Zhiru

Beijing forestry university, Beijing, 100083, China

Abstract: In this paper we briefly describe a series of reforms and tries in teaching contents and methods on the course of microbiological experiments for students in Beijing forestry university. The overview of reforms in experimental teaching, including course contents, teaching approaches, open experiments are introduced and discussed in details.

Key words: microbiological experiments; teaching contents; teaching approaches; reforms

微生物學實驗不僅是高等院校微生物學或生物技術專業的基礎課，也是生命科學、醫學、農學、林學等學科的基礎課程[1]。實驗教學是理論與實踐相結合的紐帶，是培養學生實驗操作技能和應用技術的場所，對整個教學質量起著舉足輕重的作用。一方面，學科高速發展需要現代技術；另一方面，即使基因水平的研究，也離不開微生物學的基礎實驗方法。自從列文虎克發現細菌以來，認識和研究微生物的方法與技術已經得到了很大發展，包括經典與現代的、個體水平與分子水平的、微生物體內與體外的等。微生物學實驗教學的目的之一是使學生在有限的教學時間內掌握和了解微生物學的基本技術與方法。不同的學科領域和院校所選擇的實驗內容不盡相同，作為一門基礎課程，其教學內容應該有一個基本的要求。我們在近幾年的微生物學實驗教學實踐中，創新實驗教學內容，并對微生物學實驗課程進行重組探索。

1 實驗內容的合理設置

微生物學實驗是基礎課程，實驗內容以微生物學基礎方法與技術為主。微生物實驗基礎內容包括：無菌操作(如接種、培養等)與無菌概念的建立，這是微生物學中最重要的基礎；幾大類微生物的形態特征與個體特征、微生物的基本染色方法、微生物的稀釋涂布技術及微生物的生理生化特性測定等。這些基礎的微生物學方法與技術作為學生必須掌握。在進行這些基礎教學過程中，教師也介紹各種方法與技術的發展與趨勢，啟發學生創新。只有了解基礎才知道“何為新”，只有掌握了基礎才明確“怎樣創”。近幾年的微生物學實驗教學內容主要包括以下幾個方面：

1.1 自然環境中微生物的檢測

盡管微生物的廣泛存在性作為相關專業的大學生已有一定的概念，但還不深刻。在微生物學實驗中，讓學生自己檢測實驗室、學生宿舍、人體表面與體內氣流、不同的水體、食品或飲用品中的微生物。一旦學生在平板上看到各種不同的菌落時，會大吃一驚，這樣會留下深刻的印象。

1.2 微生物的接種與培養技術

將微生物接種在不同的培養基中進行培養，是微生物學研究與應用的基礎，包括不同的接種工具、接種方法。液體、固體和半固體培養基的接種方法應掌握熟練，特別要強調嚴格的無菌操作與無菌概念。

1.3 微生物種類的識別

區分不同微生物的方法包括培養特征(液體與固體培養基)、生長特征(斜體、半固體等)、個體特征(顯微鏡下觀察)以及生理生化特性。通過菌落特征識別細菌、放線菌和霉菌三大類群，個體特征主要是選擇具有代表性的細菌(革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、桿菌、球菌、弧菌和螺旋菌、產鞭毛細菌等)、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及其相關的染色方法。例如革蘭氏染色法、美蘭染色法、死活菌染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法等，并能正確使用顯微鏡觀察微生物。生理生化特性的檢測，重在了解不同微生物在代謝上的差異，用以進行微生物的鑒定。

1.4 微生物的生長與測定

微生物生長曲線、數量與大小的測定。生長曲線測定中平板活菌計數和光電比色法是學生應掌握的方法。

1.5 環境因素對微生物的影響

這方面主要內容包括不同物理化學與生物因素對微生物的影響。

根據重基礎的原則，同時也考慮實驗內容或實驗方法與技術每年進行更新約25%，開放實驗和綜合實驗分別占學時的12.5 %左右，有利于學生創造性思維的發揮。

2 不斷更新實驗內容，建立新的實驗教學體系

2.1 更新實驗內容，實驗教學與理論學習有效結合

篇5

資料與方法

一般資料。本次研究所有菌種均采自某市微生物菌種保藏中心，共計15株。其中乳酸桿菌6株，雙歧桿菌7株，鏈球菌2株。

鑒定儀器：（1）API鑒定系統、API 50 CHL板條、API 20A 板條（生產廠家：法生物梅里埃公司）；（2）RP耗材樣品制備包（生產廠家：美國杜邦公司）；（3）生化管（生產廠家：杭州濱和微生物）；（4）Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定系統（生產廠家：美國Dupont公司）；（5）Quantity One紫外成像儀、電泳儀（生產廠家：美國BioRad公司）；（6）Veritii PCR擴增儀（生產廠家：美國ABI公司），體積為50μL[2]。

鑒定試劑：（1）細菌基因組DNA提取試劑盒（生產廠家：北京天根生物）；（2）DNA Marker、PCR緩沖體系（緩沖液5μL，含MgCl2）以及rTaqDNA聚合酶（生產廠家：大連寶生物工程有限公司）0.25μL；（3）正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、反向引物1492R（5’-TACGGCTACCTGTTACTT-3’）各200pmol/L。

鑒定方法。染色鏡檢：根據《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中乳酸菌的生化反應指標，篩選單菌落革蘭染色鏡檢。根據《食品安全國家標準食品微生物學檢驗雙歧桿菌的鑒定》檢驗雙歧桿菌。

API鑒定：乳酸桿菌由API 50 CHL板條進行鑒定，雙歧桿菌由API 20A 板條進行鑒定。

分析法鑒定：（1）16S rRNA基因序列分析法鑒定：由DNA提取試劑盒提取單菌落細菌基因組DNA，100℃熱蓋，95℃持續變性1min，56℃退火30s，72℃延伸90s，PCR循環共30個；72℃延伸10min；采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，利用紫外凝膠成像分析儀觀察電泳結果，然后通過Clustalw軟件對測序結果加以分析，并通過GenBank數據庫行BLAST對比。（2）RiboPrinter指紋圖譜分析法鑒定：將單菌落懸浮于緩沖液內，并作95℃處理，隨即加入裂解液A、B 5μL，然后采用Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定系統進行鑒定。

結果

染色鏡檢。鑒定結果顯示，1株乳酸桿菌和1株鏈球菌的生化反應不符合《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》標準，但5株乳酸桿菌和1株鏈球菌的生化反應符合標準。6株雙歧桿菌的生化反應不符合標準，僅1例完全符合。如圖所示，所有菌株均為革蘭陽性菌，無芽孢。

API鑒定。4株乳桿菌鑒定結果顯示“類干酪乳桿菌干酪亞種”，未達到“種”水平。2株雙歧桿菌鑒定結果顯示“內放線菌”，未達到“屬”水平；4株雙歧桿菌鑒定結果顯示“雙歧桿菌1”，未達到“種”水平。2株乳桿菌、2株鏈球菌以及1株雙歧桿菌鑒定結果均達到“種”水平。

分析法鑒定。16S rRNA基因序列分析法鑒定：15株中12株鑒定結果達到“種”或“亞種”水平，但3例未達到。RiboPrinter指紋圖譜分析法鑒定：15株中11株鑒定結果達到“種”或“亞種”水平，3例未達到，1例未能鑒定。

討論

《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》指出，菌株不同，其生理生化特征存在明顯差異，因此本文結果顯示6株雙歧桿菌的生化反應不符合標準，且API鑒定結果顯示15株中10株僅達到“屬”水平。

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【關鍵詞】職業教育；食品質量檢驗；崗位能力；課程體系；教學內容

為體現以就業為導向、以能力為本位的辦學方向，積極探索“食品質量檢驗專業與食品企業質檢崗位對接、專業課程內容與檢驗標準對接、教學過程與檢驗過程對接、學歷證書與食品檢驗工（中級）職業資格證書對接、職業教育與終身學習對接”五對接的模式，在“十二五”期間讓中職食品質量檢驗專業培養的人才能更好地服務區域、服務行業、服務企業，我們就食品質量檢驗職業崗位能力調研了廣西區內85家食品生產企業，食品種類涉及有：糖類（16家）、茶葉（21家）、飲料（12家）、酒（6家）、其他糧食加工品（11家）、糕點（6家）、肉制品（7家）、大米（6家）等8類，具有一定的代表性。

1. 調查結果與分析

食品質量檢驗職業崗位能力包括文化基礎知識和專業技能兩方面，其中專業技能指學生擁有感官檢驗基礎知識、理化檢驗基本操作、微生物檢測基本技術、某類食品出廠檢驗項目的檢驗技術、其他與食品相關的拓展知識等。

表1 畢業生具備文化基礎知識比率表 單位： %

高中初中小學無要求

語文801163

數學722602

英語3234331

化學752500

物理4346011

注 ：分析表中人為設定百分比< 6O%不是很重要，60%≤百分比

1.1 文化基礎知識與能力要求。

據統計，企業對檢驗崗位中檢驗員的語文、數學、英語、化學、物理等知識與能力須達到高中以上文化基礎的比例分別為80%、72%、32%、75%、43%。見表1 。

1.2 專業技能要求。

1.2.1 感官檢驗基礎知識。糖類、飲料、其他糧食加工品、肉制品、糕點、大米等食品生產企業檢驗崗位對感官檢驗基礎知識與技能要求不高；酒類、茶葉類食品生產企業檢驗崗位對感官檢驗基礎知識與技能要求較高，在90%以上。見表2。

表2 畢業生具備感官檢驗基礎知識能力表 單位： %

感官檢驗基礎知識感官敏感性（視、嗅、觸、味）感官評價方法感官評價描述能力合計

糖類16126438

飲料26286464

其他糧食加工品14225647

肉制品16163439

糕點26256461

大米28164351

酒類3338101091

茶葉3640101096

1.2.2 理化檢驗基本操作。主要是掌握分析化學原理及應用，如標準溶液的配制、滴定分析、重量分析法的運用；熟練掌握食品檢驗流程：采樣――制樣――檢驗數據處理――報告。除大米、茶葉類食品的出廠檢驗項目不涉及滴定分析外，其它類食品均涉及，特別是糖類、其他糧食加工品、肉制品類食品的檢驗崗位上應用廣泛，比例在76%以上。見表3。

表3 畢業生具備理化檢驗基本操作能力表 單位： %

分析化學原理及應用標液的配制滴定分析重量分析食品檢驗流程合計

糖類323081080

飲料203041064

其他糧食加工品283081076

肉制品303081078

糕點202481062

大米00101020

酒類302801068

茶葉040101060

1.2.3 微生物檢測基本技術。在食品檢驗崗位上，對微生物檢測基本技術的要求就是熟練掌握微生物學的基本實驗技能和食品微生物的檢驗方法，如滅菌技術、生物顯微鏡的使用、菌落總數的測定和大腸菌群的測定等，并能通過食品微生物學的基本原理對食品進行質量控制等。除糖類、茶葉、大米類食品出廠檢驗項目不需要進行微生物項目檢測外，其他食品均要進行微生物項目的檢測，而大多數需要進行菌落總數和大腸菌群的測定。見表4。

表4 需要微生物檢測基本技術的食品崗位表 單位： %

基本實驗技能無菌技術顯微鏡的使用培養基的配制測定項目菌落大腸合計

糖類000000

飲料201010252590

其他糧食加工品2020102525100

肉制品2020102525100

糕點2020102525100

大米000000

酒類（酒精度≤20%vol露酒）2020102525100

茶葉000000

1.2.4 某類食品出廠檢驗項目的檢驗技術。食品生產出來后需經檢驗合格才能出廠銷售，食品檢驗員必須具備相應檢驗能力和相關的資格證書，如食品檢驗工。各類食品出廠檢驗項目不同，對檢驗中實驗儀器的使用以及實驗室規則和安全防護、產品標準、檢驗方法、檢驗報告會有所不同，對檢驗人員綜合性檢驗能力要求高。如表5。

表5 部分食品出廠檢驗項目及檢驗能力合格率

大米腌臘肉制品醬鹵肉制品其他糧食加工品之谷物粉類制成品茶葉糕點其他酒（酒精度≤20%vol露酒）白砂糖蛋白飲料類

加工精度感官感官感官凈含量凈含量感官凈含量感官

水分酸價菌落總數水分感官品質感官酒精度蔗糖分凈含量

最大限度雜質總量過氧化值大腸菌群酸度水分水分（或果肉含水率）凈含量還原糖分蛋白質

糠粉凈含量凈含量菌落總數粉末、碎茶菌落總數菌落總數干燥失重可溶性固形物

礦物質大腸菌群茶梗大腸菌群大腸菌群電導灰分菌落總數

帶殼稗粒非茶類夾雜物餡料含量總糖色值大腸菌群

稻谷粒滴定酸粒度商業無菌

色澤、氣味、口味甲醇渾濁度

雜醇油不容于水雜質

合計檢驗項目844566997

檢驗能力合格率364340687860405246

1.2.5 其他與食品相關的拓展知識。食品質量管理原理及實踐在300人以上食品企業應用廣泛；食品添加劑應用基礎知識在100人左右食品企業應用廣泛；食品檢驗實驗室建設及管理知識在10人以下小型企業廣受歡迎；食品生產許可認證知識在各類型食品企業均需要。如表 6。

表6 畢業生具備與食品相關的拓展知識需求表 單位： %

企業規模食品質量管理原理及實踐食品添加劑應用基礎知識食品檢驗實驗室建設及管理食品生產許可認證（QS）知識合計

300人以上3412202591

100人左右2028162589

10人以下128302575

2. 小結

通過調查，初步掌握在食品生產企業中，食品質量檢驗這一職業崗位所需文化基礎知識與能力、專業技能基本情況。各類食品生產企業檢驗崗位要求檢驗員的文化素質學歷須中職畢業，其中語文、化學和數學知識與能力要求應達到高中程度，英語、物理知識與能力達到初中以上程度。食品質量檢驗專業技能方面，因食品種類不同，技能要求的側重點也不同。

2.1 同樣是執有食品檢驗工職業資格證的檢驗員，不同類別的食品專業技能偏重點不同。如茶葉需要更多的感官檢驗基礎知識，檢驗人員崗位技能主要有理化實驗室檢驗中常規實驗儀器使用與安全防護、茶葉水分的測定、毛茶或精茶中粉末與碎末的測定、茶葉審評室的設計與配備、茶葉感官審評技術“五項評茶法”（外形、湯色、香氣、滋味、葉底）等。對于茶葉檢驗崗位的人員需要執有二個方面的職業資格證書：食品檢驗工證、茶葉審評員證。

2.2 分析化學基礎知識在食品檢驗中得到廣泛的應用。如標準溶液的配制、常用儀器（分析天平、容量瓶、移液管、滴定管）的使用、滴定分析法和重量分析法的運用、實驗數據的處理等。

2.3 大部分食品都要測定微生物項目，食品微生物檢驗技術在食品檢驗中是不可缺的一部分。要求檢驗人員能夠合理規劃微生物實驗室，會微生物實驗室中常規實驗儀器的使用，具備微生物實驗安全防護知識，掌握滅菌技術，會配制培養基，掌握菌落總數與大腸菌群的測定技術。

2.4 某類食品出廠檢驗項目的檢驗技術是一個綜合能力的體現，具有很強的職業性。這是一個真實地來自于企業檢驗崗位的任務，要做好食品的出廠檢驗，必需明白出廠檢驗的項目有哪些，清楚產品標準、檢驗方法標準及標準的有效性，會配制標準溶液，儀器設備的合理布局與正確使用，原始數據記錄與處理（科學修約），如何出具出廠檢驗報告，并對所檢驗的食品做出評價。

3. 建議

堅持職業教育面向社會的實際發展需要，為企業一線培養技能型技術人才和高素質勞動者，從崗位能力需求入手，有必要及時調整食品質量檢驗專業課程體系、教學內容及授課方式。

3.1 構建以能力為本位的課程體系。

3.1.1 打破學科研究型體系，按模塊化教學模式開發食品質量檢驗專業的項目課程與綜合課程，構建以能力為本位、以專業技能實踐活動為主線、以學習者為中心、以項目課程為主體的模塊化食品質量檢驗專業課程體系。

3.1.2 按照“理論夠用”、“技能實用”原則，妥善處理文化課與專業課的關系， 強化文化課中的語文應用文寫作、數學邏輯推理及計算能力的教學；整合化學與分析化學相關內容，為食品檢驗專業課程打下牢靠的基礎；適當減少英語、物理教學課時，加大與食品檢驗專業相關的選修課比例，如質量管理、計量、標準化等方面的課程，提高綜合素質，增強學生就業競爭力。

3.1.3 積極推行“雙證融通” 的專業課程體系，以職業能力培養與中職學歷教育相互融通為根本，在課程開發的過程中，“教、學、做”一體化，使學歷證書與食品檢驗工職業資格證書對接、職業教育與終身學習對接，讓人才培養質量貼近企業需要。

3.2 根據食品質量檢驗崗位群的需求改革教學內容。

3.2.1 合理設計理論與實踐教學內容，與食品檢驗崗位實際緊密結合，從理論教學的“學科導向”內容模式向以職業活動內容為基礎的“職業導向”內容模式轉化，強化學生的動手能力、解決問題的能力。

3.2.2 根據食品檢驗崗位群的需求，在理論教學內容中可強化數據處理能力的培養，弱化對分析理論的推導論證；在實踐教學中將三大操作技能（滴定分析操作技能、重量分析操作技能和基礎儀器分析操作技能）分為基本操作、單項實驗、綜合實訓三個層次組織教學內容，在教學內容中體現出食品檢驗崗位群所要求的基本技能和綜合知識。

3.2.3 建立教學內容與行業發展同步、動態運行的理念。在組織教學內容時，及時注意本行業、本專業知識更新與應用，克服教材內容滯后、專業知識與企業需求脫節的現實問題，為實現學生上崗工作能力與崗位要求的零對接提供保障。

3.3 優化授課方式。

3.3.1 將授課場所有針對性地從課堂轉移到企業、檢驗機構的實驗室，采取崗位見習認識（職場體驗）――教學實訓――專項與綜合實訓（實境訓練）――頂崗實習階段式實踐授課方式，強化食品檢測機構及食品生產企業檢驗現場的介入和對接，檢驗標準有效性和學生的檢測能力、分析解決問題能力的對接。

3.3.2 以任務或項目為載體，學生為主體，設置企業崗位情景，項目任務與職業崗位完全對接，學生的職業能力也在項目實施過程中得到增長。從而體現出以職業導向內容模式的特征：能力為主，應用為本。

參考文獻

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篇7

關鍵詞：培養基質量控制微生物檢測

中圖分類號：R37文獻標識碼：A文章編號：1672-5085（2007）12-0098-03

培養基是液體、半固體或固體形式的，含天然或合成成分，用于保證微生物繁殖或保持其活力的物質。培養基的制備和使用是微生物實驗室檢測工作的重要環節，培養基自身質量的優劣、保存是否得當、配制使用是否正確等都直接影響到檢測結果的準確性。本文對微生物實驗室在培養基購置、貯存、制備、使用等方面應采取的質量控制措施進行討論，談一些觀點和看法。希望有助于微生物檢測工作的同行們更好的開展工作。

1培養基的購置與驗收

1.1購置

從培養基自身的質量來看，不同生產廠家的產品，甚至同一廠家不同批號的產品都會存在差異[1]。依據ISO/IEC17025《檢測和校準實驗室能力的通用要求》，對培養基的供應企業進行評價后選擇合格的供應商，這是培養基購買過程中重要的步驟。應選擇產品市場信譽度高、有質量保證能力和服務保證能力的企業；企業是否通過了質量管理體系的認證是較為客觀的評價指標。要求生產企業提供：培養基成分名稱及產品編號、批號、使用前的pH、儲藏信息和有效期、性能評價和所用測試菌株、技術數據清單、質控證書以及必要的安全/危害數據等材料[2]。

1.2驗收

購買的培養基到貨后，應有專人做好接受和驗收工作，應仔細核對生產企業提供的資料、培養基名稱、規格數量、外觀特征、批號、保質期是否符合要求。每批培養基到貨物后都應對培養基的質量進行檢測，滿足檢測方法規定的要求后方可投入使用。

2培養基的儲存

干粉培養基應保存在陰涼干燥處，要避免陽光直射；未開瓶的培養基在室溫下的最長保存2年，開瓶后的干粉培養基易吸濕，應注意防潮并在6個月內用完。應定期對儲存中的培養基進行常規檢查，如容器密閉性復查、首次開封日期、內容物的感官檢查，如果培養基發生結塊、顏色異常和其他變質跡象就不能再使用。

3培養基的制備

3.1培養基用水

培養基制備用水應使用電阻率不小于30萬Ωcm的蒸餾水或與其同質的水，最好不使用離子交換器生產的去離子水[2]。。

3.2稱量

稱量時要用專用的角匙，避免交叉污染而影響檢驗結果；干粉培養基易吸潮，如有條件，盡量在濕度較低的房間稱取培養基。

3.3復水

復水時不得用銅鍋或鐵鍋，以防有離子混入培養基中，影響微生物的生長；容器的大小需大于復水后培養基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養基溢出；含有瓊脂粉的培養基，在加熱溶解之前可以浸泡數分鐘；加熱培養基時一定要進行攪拌，特別是瓊脂類培養基。為避免燒焦和沸騰溢出，對于少量的培養基最好使用沸水浴進行加熱。燒糊的培養基營養物質被破壞，并可產生有毒物質，如發現焦化，或未溶解均勻前培養基有溢出，該培養基即不能使用，應重新制備。對于瓊脂類培養基進行再融化時應使用沸水浴或流動蒸汽進行加熱，最多只能加熱兩次，第二次再融化后仍未用完的培養基應棄去。

3.4滅菌

一般培養基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽滅菌，通常是121℃15min，含糖或特殊培養基，按照國家標準或生產商提供的說明滅菌。已配制好的培養基必須立即滅菌，避免微生物生長繁殖而消耗養分，改變培養基的酸堿度。高溫可破壞培養基的營養成分，還會使瓊脂的凝膠強度下降，因此必須嚴格控制滅菌溫度和時間，并且不可重復滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進行檢定，并定期采用生物指示菌法或化學變色紙片對滅菌效果進行驗證。

3.5pH測定

微生物必須在適宜的pH范圍內才能正常生長繁殖或體現其生物特性。培養基配方要求的pH為滅菌或消毒后的pH值，即培養基使用前的pH，并應在25℃溫度下采用精密酸度計進行測量，固體瓊脂培養基應以特殊的膠體表面測量電極進行測量。使用過程中，如果需要調整培養基的pH，應用1mol/LNa0H或lmol/LHCL調整，注意不可反復調pH，否則會影響培養基的滲透壓[3]。

3.6配制好的培養基保存

滅菌以后培養基應該迅速冷卻至所需溫度，避免長時間保存在滅菌鍋內，造成過度滅菌，影響培養基的營養成分或選擇性效果。所配制的培養基的量，應該是在最長保存期限內正好使用完。含染料的培養基應閉光保存；倒好的瓊脂平板如果配制的當天未使用完，應于冷藏保存，如果保存時間超過2天，應將其放入密封的塑料袋中保存；配好的肉湯類培養基如果保存時間超過2個星期，應將其放在帶有螺旋蓋的試管或其它密閉的試管或容器中防止蒸發[4]。

4培養基的性能測試

4.1外觀控制

制備好的培養基應有相應的顏色，一般的培養基應澄清、無渾濁、無沉淀。使用前應檢查培養基的顏色是否發生變化，是否蒸發/脫水。

4.2污染控制

從每批制備好的培養基中選取部分進行污染測試（無菌試驗），確定無微生物生長方可使用。

4.3性能測試

4.3.1測試菌株選擇測試菌株是具有其代表種的穩定特性并能有效證明實驗室特定培養基最佳性能的一套菌株，應來自國際/國家標準菌種保藏中心ATCC標準菌株[5]，菌株的選擇參考衛生行業標準WS/T232-2002《商業性微生物培養基質量檢驗規程》。

4.3.2定量測試方法改良Miles-Misra法測試菌株過夜培養物10倍遞增稀釋；測試平板和參照平板劃分為4個區域并標記；從最高稀釋度開始，分別滴一滴稀釋液于試驗平板和對照平板標記好的區域；將稀釋液涂滿整個1/4區域，37°C培養18小時；對易計數的區域計數，按公式計算生長率（生長率=待測培養基平板上得到的菌落總數/參考培養基平板上獲得的菌落總數）。非選擇性培養基上目標菌的生長率應不低于0.7，該類培養基應易于目標菌生長；選擇性培養基上目標菌的生長率應不低于0.1[6]。

4.3.3半定量測試方法改進的劃線法接種法平板分ABCD四區，共劃16條線，平行線大概相隔0.5cm，每條有菌落生長的劃線記作1分，每個僅一半的線有菌落生長記作0.5分，沒有菌落生長或生長量少于劃線的一半記作0分，分數加起來得到生長指數G。目標菌在培養基上應呈現典型的生長，而非目標菌的生長應部分或完全被抑制，目標菌的生長指數G大于6時，培養基可接受[6]。

4.3.4定性測試方法平板接種觀察法用接種環取測試菌培養物，在測試培養基表面劃平行直線。按標準中規定的培養時間和溫度對接種后的平板進行培養，目標菌應呈現良好生長，并有典型的菌落外觀、大小和形態，非目標菌應是微弱生長或無生長[6]。

5討論

培養基的質量是微生物實驗室檢測工作的基礎，事關檢測工作的準確性、可靠性，在微生物實驗室檢測工作中舉足輕重。如果在工作中忽視任何一個環節的質量問題，都將導致檢驗結果科學性、客觀性的偏離。因此，加強培養基的實驗室質量控制，認真地做好培養基的質控工作，不斷完善和提高培養基的質控水平，才能為微生物檢測實驗室提供高質量的培養基。

參考文獻

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[4]饒紅，陳廣全，馮騫，等.微生物實驗室培養基的質量保證措施[J].檢驗檢疫科學，2006，6（4）：31-33.

篇8

關鍵詞：雞肉；菌落總數；高光譜成像；圖像預處理；偏最小二乘法（PLSR）；無損檢測

Rapid Non-Destructive Detection of Total Bacterial Count in Chicken Using Hyperspectral Imaging

LI Wencai1， LIU Fei1， TIAN Hanyou1， ZOU Hao1， WANG Hui1， ZHANG Zhenqi1， ZHENG Xiaochun2， LI Yongyu2，

LI Jiapeng1， QIAO Xiaoling1，*

（1. Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing 100068， China；

2.College of Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： In order to develop a rapid and non-destructive method to predict total bacterial count in chicken breasts by using hyperspectral imaging technology， 83 chicken breast samples refrigerated at 4 ℃ were collected from local supermarket and 63 of these were used as calibration samples. The hyperspectral scattering image of each sample was collected by using hyperspectral imaging system in the wavelength range of 400?1 100 nm. Various algorithm combinations were used to preprocess the hyperspectral information of the samples to enhance the performance of the model developed by using partial least square regression （PLSR） algorithm. Based on the predictive accuracy and stability of the model， the efficiency of different algorithm combinations for spectral preprocessing were evaluated and discussed. The results showed that the optimal model performance was achieved by preprocessing of the hyperspectral information with standard normalized variate. The standard error of calibration （sEC） and standard error of prediction （SEP） of the model were 0.40 and 0.57， respectively. The correlation coefficients of calibration （RC） and prediction （RP） were 0.93 and 0.86， respectively. The optimal model allowed effective prediction of distribution maps of total bacterial count in chicken breasts.

Key words： chicken； total bacterial count； hyperspectral imaging； image processing； partial least square regression （PLSR）； non-destructive detection

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703007

中圖分類號：O657.33 文I標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）03-0035-05

引文格式：

李文采， 劉飛， 田寒友， 等. 基于高光譜成像技術的雞肉菌落總數快速無損檢測[J]. 肉類研究， 2017， 31（3）： 35-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703007. http：//rlyj.pub

LI Wencai， LIU Fei， TIAN Hanyou， et al. Rapid non-destructive detection of total bacterial count in chicken using hyperspectral imagingg[J]. Meat Research， 2017， 31（3）： 35-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703007. http：//rlyj.pub

由于養殖成本、周期等原因，豬、牛、羊肉價格長期高于雞肉價格，國家統計局數據顯示，2010―2016年，雞肉價格平均低于豬肉和牛羊肉價格約27%和63%，相對較低的價格使得雞肉消費量大幅增加，統計局數據顯示，2005―2012年，城鎮居民、農村居民人均豬、牛、羊肉消費分別增加了4.2%、-4.1%，而禽肉消費分別增加了20.0%、45.2%。同時，雞肉作為重要的禽肉產品之一，肉質細嫩，營養豐富且比例均衡，其食用安全性受到越來越多消費者的重視。雞肉的質量與安全主要取決于物理、化學和生物指標，其中生物指標最為重要。菌落總數是評判食品被微生物污染程度的一個重要指標[1-2]，可預測肉品的貨架期以及判斷是否腐敗變質，GB 16869―2005《鮮凍禽產品》[3]規定了鮮禽肉中菌落總數的最大值。菌落總數的傳統檢測方法包括平板計數法、阻抗法、伏安法、流式細胞法、微熱量計法、酶聯免疫法、多聚酶鏈式反應等[1，4]，這些方法過程繁瑣、檢測周期長、效率低、易受溫度、pH值等因素影響、肉品破損嚴重等問題，很難滿足肉品檢測過程中快速、無損、自動化的需求，嚴重制約我國肉品產業的發展。

在鮮肉貯藏過程中，隨著微生物的生長，葡萄糖和其他單糖以及蛋白質水解形成化學團，包括揮發性酯類、醇類、酮類以及含硫化合物，這些物質最終導致了鮮肉的腐敗味。針對鮮肉腐敗率較高的問題，找到一種較為先進的檢測技術來保證它的質量與安全很有必要。高光譜成像技術光譜分辨率高、波段連續，能夠在紫外、可見光近紅外、紅外等范圍內獲得多而窄、波段數達上百個的連續光譜，其融合了光學、計算機技術、信號處理學等多種學科于一體，是一種較為全面的檢測技術[5-7]。高光譜成像技術分析效率高、操作簡單、費用低廉，可在線監測，同時無需對樣品進行損傷和預處理，已廣泛應用于食品、醫藥、農業、環境、石化、生物技術等領域。近年來，國內外一些學者開始采用高光譜成像技術來研究肉品在流通、貯藏過程中微生物腐敗及品質變化的快速檢測，并取得了一定的研究成果[8-14]。Kamruzzaman等[15]基于高光譜成像技術，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）對豬肉、牛肉、羊肉進行識別和身份驗證，通過二次求導得到的特征波長用于模式識別算法中來對肉品進行分類，模型對校正集樣本的分類精度達98.67%。除此之外，該學者還利用高光譜成像技術對紅肉的持水力和色澤開展了研究[16-17]，報道了該方法用于在線檢測紅肉持水力和色澤的可行性。Barbin等[18]基于近紅外高光譜成像技術（900～1 700 nm）和偏最小二乘法（partial least squares regression，PLSR）對冷凍豬肉菌落總數和嗜冷菌平板計數進行檢測和建模，R2C分別達0.86和0.89。Peng等[19]以牛肉為研究對象，采用高光譜成像技術對其表面菌落總數進行檢測，通過不同預處理方法和不同建模方法對其菌落總數進行預測，取得了較好的預測結果。陶斐斐等[20]以冷卻豬肉為研究對象，利用高光譜成像系統（400～1 100 nm）對其表面菌落總數進行快速預測，研究其在1～14 d貯藏期間表面菌落總數與高光譜圖像的關系，結合多元線性回歸和偏最小二乘回歸法建立預測模型，模型相關系數為0.886和0.863。雞肉高光譜成像相關研究中，多集中在揮發性鹽基氮、嫩度、顏色、脂類氧化等[21-23]，微生物方面鮮有報道。本研究以雞胸肉為研究對象，依照GB 4789.2―2010[24]對其菌落總數進行測定，在400～1 100 nm波長范圍內，使用感興趣區域（range of interest，ROI）方法提取雞胸肉表面高光譜圖像的散射光譜，采用PLSR對其菌落總數高光譜信息建模，確立高光譜圖像信息與菌落總數之間的關系，實現雞胸肉菌落總數分布范圍的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉均購于中國農業大學附近超市，半小時內運至實驗室，采用統一的保鮮袋包裝方式。

氯化鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；平板計數瓊脂培養基 北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

高光譜成像系統、SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ME204型電子天平（精確度0.000 1 g）

瑞士梅特勒-托利多科學儀器（上海）有限公司；

DHP-9052型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；L28957E、P18156D移液槍 德國Eppendorf股份公司；WD3-1-9CM培養皿 浙江柏美特醫用塑料有限公司。

高光譜成像系統組成：Sensicam QE CCD（charge coupled device）數字照相機 德國Kelheim公司；ImSperctor V10E成像光V儀 芬蘭Spectral Imaging公司；

鹵鎢燈直流點光源（Oriel Instruments） 美國

Stratford公司；CD33-120N-422位置傳感器 日本Optex公司；Intel core i3-3240計算機 聯想有限公司。

該儀器采用的光譜范圍為400～1 100 nm，可以采集雞肉樣品表面的散射光譜，其光譜分辨率為2.8 nm。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

實驗時從冰箱隨機取樣，切成厚度大約為1 cm，質量大約為10 g的雞肉塊，每24 h測定1 次，每次測定3 個樣品。

1.3.2 樣品高光譜信息的采集

每隔24 h從4 ℃冰箱中隨機取出雞胸肉樣品，利用實驗室構建的高光譜成像系統，采集400～1 100 nm波長范圍內的雞肉樣品表面散射光譜，曝光時間為80 ms。由相機軟件（Camera control Kit V2.19）完成圖像采集過程，為確保樣本的一致性，掃描過程中所采集樣本的掃描線需與雞肉樣本纖維方向平行，每掃描4 次，自動平均得到一條掃描線。實驗過程中對每個樣本表面進行全掃描，得到160 個掃描圖像。

1.3.3 樣品菌落總數的測定

對高光譜圖像進行采集后，立即對雞胸肉樣品表面菌落總數進行檢測。本實驗參考GB 4789.2―2010[24]中的10 倍梯度稀釋法進行操作，選取合適的稀釋梯度，每個稀釋梯度倒3 塊平板，37 ℃條件下培養48 h后計數，取菌落總數的對數值作為分析數據，單位為lg（CFU/g）。

1.3.4 數據分析

高光譜圖像信息采集后，采用MATLAB2015b（美國Mathworks公司）對數據進行分析。依次提取冷卻雞肉樣本高光譜圖像感興趣區域（range of interest，ROI），計算其平均散射光譜值，將其作為雞肉樣本的原始光譜值。對光譜圖像特征進行分析后，應用PLSR對光譜數據和菌落總數測定值進行關聯，建立雞胸肉菌落總數預測模型。

1.3.5 模型預處理方法的篩選

選擇的預處理方法包括：歸一化方法（normalization method，NM）、Savitzky-Golay求導（Savitzky-Golay derivative，SGD）、標準變量變換（standard normalized variate，SNV）、附加散射校正（multiplication scatter correction，MSC）。

對樣品高光譜信息進行不同預處理，去除無關干擾信息、降低隨機噪聲和強化譜帶特征，采用PLSR統計方法建模，綜合校正標準誤差（standard error of calibration，sEC）、驗證標準誤差（standard error of prediction，sEP）、驗證標準差和校正標準誤差的比值（sEP/sEC）和差值（sEP-sEC）對模型性能進行評價[25]，篩選出最佳預處理方法。

1.3.6 模型評價原則

sEP 代表高光譜分析的總誤差，其中包括可靠性偏差、穩健性偏差和信息處理過程產生的誤差，因此可以直接用于評價模型的預測準確性。sEC代表模型在建模樣品范圍內的分析誤差，不包括穩健性偏差，因此sEP-sEC

應大于0。美國谷物化學組織的近紅外分析標準中將

sEP/sEC作為評價模型穩健性的參數，規定sEP/sEC應小于1.2，其值大于1.2時則表示模型的穩健性不夠[20]。

因此，在篩選性能最佳的模型時，首先模型應同時滿足sEP/sEC0，然后在剩余的模型中x取sEP最小的模型，此模型不僅穩健且預測準確性較好，這個模型所對應的算法或算法組合即為最佳預處理方法。

1.3.7 菌落總數分布地圖

用高光譜成像技術預測菌落總數，不僅可以提供光譜信息還可以提供菌落總數的空間分布[26-29]。高光譜圖像中每個像素點對應一個光譜，因此在每個像素點上可計算出樣品菌落總數的預測值，從而構成分布地圖。本實驗中，利用PLSR模型預測光譜圖像中每一個像素點對應的菌落總數，最終構成菌落總數預測值的分布地圖。

2 結果與分析

2.1 樣品菌落總數化學測量值的測定結果

本實驗所用的83 個雞胸肉樣品的菌落總數化學測量值的統計結果如表1所示，涵蓋新鮮雞肉菌落總數（約3.97（lg（CFU/g）））至腐敗雞肉菌落總數（約7.75（lg（CFU/g））），GB 16869―2005[3]對鮮禽產品中菌落總數含量所允許的最大值為6（lg（CFU/g）），3.97～7.75（lg（CFU/g））的范圍說明本實驗選用的樣品具有較強的代表性。從總樣品集中選取菌落總數化學測量值分布均勻的樣品63 個作為校正集，用于模型的建立；剩余的20 個樣品作為驗證集，用于驗證模型的預測準確性和穩健性，統計結果見表1。

2.2 雞肉高光譜圖像感興趣區域的確定

利用Matlab2015b分析軟件從高光譜圖像中提取ROI。圖1所示為不同掃描位置的光譜圖像，圖2所示雞肉樣品不同掃描位置處的光譜曲線，距離掃描線中心0、10、15、20 nm位置處整個波長范圍內的散射光譜。

由圖2可知，在波長方向上，低于470 nm和高于920 nm位置處形成較大噪音影響，信號較弱；在空間方向上，掃描線中心位置的散射強度最大，距離掃描線中心位置越遠，散射強度越弱，因此，將光譜軸[470 nm，920 nm]和空間軸[-20 nm，20 nm]所組成的矩形區域作為ROI。沿著光譜軸在470～920 nm區間計算ROI區域上點的平均散射光譜作為該樣本的散射光譜。對所有的圖像進行處理，共獲得83 條波長曲線如圖3所示。

2.3 最佳預處理算法的確定

應用不同算法組合對樣品的高光譜信息進行預處理后，菌落總數預測模型的性能評價參數如表2所示。

對光譜信息不進行任何預處理，與其他預處理方法相比，校正集相關系數（correlation coefficient of prediction set，RC）不變，但是驗證集相關系數（correlation coefficient of prediction set，RP）較低。對模型進行SNV單獨預處理時，由表2可知，各個模型的RC均保持不變，但是RP均有不同程度的增加；光譜數據經SNV單獨處理后再建模，與無預處理相比，RC不變，但是RP由0.80上升0.86，且sEP/sEC值為1.08，其值小于1.2，說明經SNV單獨處理后，模型的準確性和穩健性均有所增加，將SNV確定為最佳預處理方法。其他不同組合算法的準確性和穩健性均低于SNV算法，在表中未列出。不同預處理方法對模型預測的準確性和穩健性有很大的影響，恰當的預處理方法可以提高模型性能評價參數，但過度的預處理方法會使得模型性能降低，樣品光譜信息中大量有效信息丟失，這與鄒昊等[30]研究結果相一致。

2.4 最佳預處理算法條件下菌落總數的預測

以校正集和驗證集樣品的菌落總數化學測量值為橫坐標，模型的預測值為縱坐標作圖，結果如圖4所示。

由圖4可知，校正集中樣品的菌落總數化學測量值緊密地分布在回歸線兩側，模型的預測值與校正集樣品的菌落總數化學測量值吻合度較高，模型的sEC為0.40，RC為0.93，說明建模前對樣品光譜信息進行SNV預處理后，模型較好地擬合了光譜信息中反映樣品菌落總數含量的信息。驗證集中，樣品的菌落總數化學測量值和模型的預測值相關性較高，sEP為0.57，RP為0.86，說明模型對驗證集樣品中的菌落總數含量有較好的預測準確性。

2.5 雞肉菌落總數分布地圖的生成

圖5表示雞胸肉樣品菌落總數的分布圖，顏色條RGB值由0到7.75（由灰到白），表示菌落總數值由小到大。在預測分布地圖中，光譜性質相同的像素點擁有相同的預測值，用相同的顏色比例分配表示，所以，分布地圖中不同的顏色表示不同的菌落總數分布。

由圖5可知，A樣品和B樣品菌落總數預測對數值分別為4.00 （lg（CFU/g））和6.77 （lg（CFU/g）），依照GB 4789.2―2010所測值為3.99 （lg（CFU/g））和6.79 （lg（CFU/g））。不同菌落總數的雞胸肉，菌落總數含量和分布預測地圖存在明顯差異，白色越多，表示菌落總數預測值越大。與傳統技術相比，高光譜成像技術可用于更大的樣品，甚至整個動物胴體，生鮮肉微生物檢測已成為屠宰廠建立和實施危害分析和關鍵控制點（hazard analysis critical control point，HACCP）體系重要的信息來源。高光譜成像技術已成為肉類工業中微生物檢測的一個可行、簡單、快速有效的方法。

3 結 論

高光譜成像技術具有費用低、無損檢測等特點，它在肉類在線質量控制系統中實現了快速化、準確化和簡單化。為了快速檢測雞胸肉菌落總數，本實驗在400～1 100 nm波長范圍內，使用ROI方法提取雞胸肉表面高光譜圖像的散射光譜。其中，用于建立菌落總數預測模型校正集的樣品共63 個，用于驗證集的樣品共20 個。使用不同算法和算法組合對樣品的高光譜信息進行預處理后利用PLSR進行建模。通過模型評價參數對預處理方法進行篩選后發現，經SNV對樣品進行預處理后，模型性能較好，模型sEC和sEP分別為0.40和0.57，sC和RP分e為0.93和0.86，且sEP/sEC值為1.08，其值小于1.2，模型的準確性和穩健性為最佳。通過每個像素點對應的光譜可預測得到菌落總數分布地圖，通過分布地圖可看出，不同樣品菌落總數預測值的大小以及菌落總數在樣品中的分布情況。高光譜成像技術有望成為雞肉產業中微生物快速檢測的一個行之有效的方法。

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篇9

關鍵詞 食品；菌落總數；大腸菌群；基本要求

中圖分類號TS251 文獻標識碼A 文章編號 1674-6708（2013）85-0101-02

食品從生產到銷售需要經過各個環節，在這些環節中很可能受到微生物的污染，從而造成腐敗、產生毒性，為了能夠保證人們能夠吃到健康的食品，就需要對食品中菌落總數以及大腸菌群作為其主要的檢測項目。只有對其檢測進行嚴格的把控，才能保證食品的安全，才能確保消費者的健康，才能更好地促進經濟的發展。

1 質量控制的基本要求

要確保對菌落總數和大腸菌群的檢驗能夠更加準確，就需要對一些基本要求進行確保。

1.1 檢驗人員

為了能夠對食品的菌落總數和大腸菌群進行有效的檢驗，就需要檢驗人員具備相關的技術知識，這樣才能確保檢測結構更加準確。作為食品的檢驗，首先就要求檢驗人員能夠對食品微生物學理念以及相關的檢驗技術能夠有比較深入的了解，并且在其參加工作之前需要對其進行必要的考核。其次就是要了解相關的法律法規，我國的食品法對相關的標準有明確的規定，只有了解這些才能有更好地執行檢驗。最后就是要了解計量學的內容，因為檢驗工作十分精細，只有了解計量學的基本知識才能更好地進行實驗。

1.2 儀器設備

為了能夠保證檢驗能夠正常的進行，需要準備好必要的儀器和設備，這樣才能為檢驗的進行提供必要的基礎。

1.3 藥品與培養基

對菌落總數和大腸菌群的檢驗需要利用必要的培養基、染色體以及一些必備的試劑，并嚴格按照相關的標準進行相關的操作。

1.4 檢驗環境

由于空氣中本身就存在著細菌和微生物，為了能夠對菌落總數和大腸菌群進行有效的檢測，需要在無菌室進行檢驗。為了達到理想的檢測效果，工作人員應該進行良好的衛生處理，這樣才能達到很好的效果。

1.5 采樣

食品的量往往是非常大的，對所有的食品進行檢驗實行起來不太現實，成本也難以負擔，因此，在進行檢驗的時候就需要進行采樣。在采樣環節，要對衛生狀況、采集方法、檢驗標準、標簽等進行充分的認識，這樣才能使檢驗結構更加準確。

1.6 樣本預處理

相關部門在接到檢驗單據以及樣本后，要及時進行檢測前的預處理，一般將其放在冰箱進行儲存，并保證并向處于冷凍的狀態，這樣才能為檢驗做好基礎工作。

2 菌落總數檢驗的質量控制

根據國家標準方法，對菌落總數的檢驗實行標準平板培養法。

2.1 關于稀釋度的選擇

不同食品的檢測的稀釋度并不相同，一般都將稀釋度保持在2個～3個連續稀釋度上，但是這里需要的注意的是，為了能夠達到檢驗的有效性，需要至少保證其中一個的稀釋度中菌落的數量在30個～300個。對于那些細菌含量比較高的食品稀釋度可以適當的加大，諸如醬油、肉制品等。而對于那些細菌含量比較低的食品不需要很高稀釋度，這樣的食品可以選擇原樣，或是較低的稀釋度，諸如純凈水、糕點等。

2.2 接種和培養

取一毫升的稀釋液放入到培養皿中，并在盡可能快的時間內向其中倒入營養瓊脂，倒入之后隨即進行推旋操作，促進其混合。這里需要注意的是動作的幅度不能太大，否則將很難保證結果的準確。等到該混合液凝固的時候，需要將其放入培養箱進行培養，在這個過程中需要檢驗是否存在污染的情況，以確保檢驗的實效。

2.3 原始記錄

當樣品在36±1℃的培養箱中經過了48小時的培養之后，就可以進行計數操作。在這個過程中需要做好原始數據的記錄，對樣品的名稱、檢驗日期等相關信息要做好相關記錄，在計算菌量的時候，應嚴格按照相關標準，如果均量在100以內的話，那么就進行如實報告，如果菌量大于100，則需要利用科學技術法表示，諸如N×10n，一般來說保留兩位有效數字。

3 大腸菌群檢驗的質量控制

大腸菌群的檢驗主要可以分為以下三個步驟，首先進行乳糖膽鹽發酵試驗，其次進行分離培養，最后進行證實實驗，經過這三個步驟就能達到很好的質量控制。

3.1 乳糖膽鹽發酵試驗

檢測之前，需要依據產品的標準選擇所需要檢測樣品的量。在試驗結果的判定環節，如果其不產生酸也不產生氣體才可以被判定為達成菌群陰性，任何一個方面存在著差別，都不能將其當作陰性。在起初發酵的時候，不能草率的將顯示的陽性管判定為大腸菌群陽性，而需要進行一系列的分離和證實實驗，才能下結論。

3.2 分離培養和證實試驗

為了進行培養和證實實驗，需要利用伊紅美蘭平板，只有通過其進行必要的分離培養，才能得到需要的菌源，從而進行證實實驗。在培養的時候要控制好實踐，在24小時內要對菌落的特征進行很好的觀察，其主要可以有四種菌群，只有對這些菌群的可疑程度進行必要的檢測，這樣才能避免出現假陰性。

3.3 原始記錄

根據以上實驗的結果，根據MPN檢索表就可以指導大腸菌群的最可能的數量，在進行檢索的時候，應該注意該檢索表一欄的陽性管數下面所列出的mL（g）是原樣品的mL（g）。如果檢測量大于1 mL（g）的話，需要按照表內的數字降低10倍報告，如果檢測量小于1 mL（g）的話，則用表內數字報告。

3.4 結果質量控制

相關的檢驗人員要根據實驗的整個過程以及最后的記錄編制檢驗報告，并且在編制的時候對相關的內容進行復查，這樣才能達到理想的效果。并根據國家食品衛生的相關標準對食品菌落總數以及大腸菌群進行必要的評價和審定。待這些步驟都進行完畢之后，還需要送到相關主管人員進行核實，如通過核實，還需要主管人員簽字并蓋章，這樣報告才能生效。

參考文獻

[1]郭濤，孫香彬，侯君，曹鐵建，劉飛，張彩霞，姜明，盧行安.食品微生物檢驗中菌落總數測定的注意事項[J].微生物學雜志，2007（3）.

篇10

膜是處理系統發揮作用的主體，研究淹沒式除磷反應器中生物膜的特性和主要微生物組成、探討究竟是哪些微生物在生物膜除磷過程中起主要作用，是探明淹沒式生物膜除磷機理的重要課題。

1 序批式生物膜除磷反應器中生物量的測定

1．1　測定方法

(1) 從筆者穩態試驗運行的淹沒序批式生物膜法除磷反應器中[1]取出有代表性的填料，將填料放入容器中加入一定量的蒸餾水搓洗，把含洗脫膜的水轉入2000mL量筒中，將填料再重復搓洗3～5次，直至膜全部洗脫下來而填料變成白色為止，再往盛洗脫膜的量筒中加蒸餾水至滿刻度。

(2) 取混勻的洗脫液200mL，測定在103～105℃下烘干的總殘渣;取混勻的洗脫液200mL，用定量濾紙抽濾，然后取所得濾液，測定在103～105℃下烘干的總可濾殘渣，得懸浮固體m′s=總殘渣-總可濾殘渣。

(3) 把經過(2)測得的總殘渣和總可濾殘渣分別在550℃的馬福爐中灼燒30min，取出在干燥器內冷卻后稱量至恒重，得總殘渣和總可濾殘渣的灼燒殘渣，則揮發性懸浮固體m′vs=(總殘渣-總殘渣的灼燒殘渣)-(總可濾殘渣-總可濾殘渣的灼燒殘渣)。

(4) 在取走填料的反應器中立即取混合液200mL，同步驟(2)，(3)分別測出反應器中混合液的懸浮固體ms″和揮發性懸浮固體mvs″，則得反應器中懸浮固體ms和揮發性懸浮固體mvs的計算公式:

ms=10∑ni=1nim′si+1000vm〃s/200=10∑ni=1nim′si+5vm〃smvs=10∑ni=1nim′vsi+5vm〃vs

式中ms———反應器中懸浮固體總量，g;mvs———反應器中揮發性懸浮固體總量，g;m′si———第i種代表性填料的懸浮固體，g;m′vsi———第i種代表性填料的揮發性懸浮固體，g;ni———第i種代表性填料相同或相似的填料數;n———代表性填料的種類數;m〃s———混合液的懸浮固體，g;m〃vs———混合液揮發性懸浮固體，g;v———反應器容積，22L。反應器中mLss和mLvss的表達式:mLss=1000ms/v，mg/L;mLvss=1000mvs/v，mg/L。

1．2　測定過程及結果將所取代表性填料分成上下兩段，每段長度均為55cm，然后把每段作為單獨的有代表性的填料，按上述測定方法進行測定，反應器中有8根相同填料，結果見表1。

由表1知，sbr生物膜反應器中生物量非常大，超過淹沒式軟填料生物膜工藝、sbr除磷活性污泥系統和a/o活性污泥系統中的生物量，反應器中上部生物膜活性高于下部。

2 生物膜污泥產率及污泥含磷量

2．1 污泥產率

由于sbr生物膜除磷工藝的特殊性，可較方便地測出運行1個周期后的污泥產量。在進水負荷為1．00kgcod/(m·d)時，將1周期后脫落的污泥取出，過濾后在103～105℃下烘干，稱得1．0733g，產泥率為0．1996kgds/kgcod，介于傳統生物膜法和傳統活性污泥法的產泥率之間，與以消化為目的的延時曝氣活性污泥法的產泥率接近[4]。

2．2 污泥含磷量

準確稱取污泥風干樣品0．0744g，在樣品上下各鋪一層naoh于鎳坩堝中，將坩堝放在酒精噴燈上到樣品處于熔融狀態，用鐵夾將坩堝取出在水中急冷，用蒸餾水多次洗滌坩堝，用h2so4(1∶1)中和至ph

將上述溶液再稀釋20倍后取50mL于比色管中，加入5mL鉬酸銨溶液混勻，加入0．25mL氯化亞錫溶液，充分混勻，室溫放置15min后，于700nm波長處以零濃度空白為參比，測定吸光度，在標準曲線上查得相應的含磷量為0．2108mg/L，污泥中磷含量為5．67%。

3 生物膜沉降特性

計時進行靜止沉淀。把量筒中洗脫液混勻，然后靜置沉淀，分別記下靜沉時間及污泥沉淀層容積。結果見圖1。由圖1可見纖維填料的上、下部生物膜都具有良好的沉降性。

4 除磷微生物特性研究

4．1 試驗材料

生物膜樣品:生物膜混合液取自筆者試驗中穩態運行的淹沒式生物膜反應器中填料載體上的生物膜。檢樣1為生物膜反應器除磷試驗的前期(反應器運行第4個月)樣品，檢樣2為中期(反應器運行第6個月)樣品。

培養基:牛肉膏蛋白胨培養基(營養瓊脂)。

4．2 試驗方法

(1) 檢樣處理。

無菌操作取出生物膜，測量表面積。檢樣1為0．2217cm，檢樣2為0．2165cm。然后用滅菌剪刀將生物膜剪碎，放入裝有滅菌生理鹽水和玻璃珠的三角燒瓶中，充分振蕩，將生物膜上的細菌洗下，以此生理鹽水懸液作為菌落總數測定細菌計數按標準平板法進行。

(2) 菌落總數確定。

將上述生理鹽水懸液進行(2)菌落總數確定。將上述生理鹽水懸液進行適當的10倍遞增稀釋，然后取各稀釋度懸液0．1mL放入營養瓊脂平皿上，用滅菌“L”形玻璃棒將其涂布均勻，放入36℃恒溫箱中培養24h，然后連續觀察3d。

(3) 菌相分析。

取上述各稀釋度菌懸液0．1mL放入普通營養瓊脂平皿上，用“L”玻璃棒將涂布均勻的一組放在36℃溫箱培養，另一組放入厭氧罐中，36℃培養，連續培養72h后取出并觀察結果，選有30～300個菌落的平皿，進行菌相分析，選取菌落形態一致的菌為一組菌，然后進行革蘭氏染色，做抗酸染色、形態、芽孢試驗、動力、需氧生長、厭氧生長、接觸酶、氧化酶、葡萄糖利用試驗、of試驗以確定其為哪個菌屬的細菌。試驗結果根據《伯杰氏系統細菌鑒定手冊》所述的方法進行處理。

4．3 試驗結果

(1) 菌落總數。

由表1得知:檢樣1的菌落總數為2．52×108個/mL，檢樣2的菌落總數為1．56×10個/mL。

(2) 菌相分析結果。

普通營養瓊脂平板在36℃下培養24h。需氧培養:檢樣1在10-4稀釋度平板上長出210株菌落;檢樣2在10-5稀釋度平板上長出127株菌落。厭氧培養:檢樣1，檢樣2均無細菌生長。菌相分析結果見表2。由表2可見優勢菌屬為假單胞菌屬，其次依順序為氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、微球菌屬、硝化桿菌屬。

4．4 討論

4．4．1 淹沒式生物膜反應器不同運行期生物比較

(1) 細菌總數。

在除磷試驗的中期生物膜中細菌數量遠超過初期，約為初期的5倍，這是因為生物膜不斷馴化培養后，逐步成熟的原因。

(2) 菌相組成。

由表2知，在運行中期假單胞菌屬的構成比例超過初期。同時，氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬的構成比卻低于初期。這說明，假單胞菌屬為本系統的優勢菌屬，且隨著運行時間的延長而更加穩定。另外，硝化桿菌屬的比例在運行中期也高于初期。說明，隨著運行時間的延長，本系統的硝化功能趨于提高。

4．4．2 與除磷工藝中活性污泥混合液菌相構成比較

以往人們認為不動桿菌屬在活性污泥除磷過程中起著最主要的作用。但是，在本試驗中卻沒有發現不動桿菌屬。hascoet[8]發現，運行良好的間歇式生物除磷脫氮試驗裝置的污泥混合液中幾乎找不到不動桿菌，清華大學周溪岳[3]、華東師范大學朱懷蘭[9]的間歇式污泥除磷試驗裝置中，也沒有找到不動桿菌。此外，即使在一些裝置中，不動桿菌屬相當多，但它在除磷過程中所起的作用都不大。當然由于所采取工藝、原水水質、運行條件不同，活性污泥混合液內微生物組成和數量會有差異，但是這說明了以往的廢水生物除磷主要是由不動桿菌屬完成的觀點是不夠全面的。

另外，同樣是間歇式除磷工藝，本試驗采用的淹沒式生物膜與間歇式活性污泥的菌相構成有相似也有不同，其比較見表3。由表3知，兩者最大的不同是在淹沒式生物膜除磷系統中有硝化桿菌屬，而間歇式活性污泥系統中沒有。

4．4．3 主要菌群的功能

cLoete等人的研究認為，假單胞菌屬、氣單胞菌屬、不動桿菌屬等都不僅能有效地降解有機物，而且能過量攝取廢水中的磷以聚磷酸鹽顆粒的形式貯存于細胞內，同時還能還原硝酸鹽進行反硝化脫氮。另外芽孢桿菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬等，也具備上述功能，這與本試驗研究是基本一致的。氣單胞菌的另一主要功能是發酵產酸作用，即在厭氧段將合成廢水中的蛋白質之類的大分子物質發酵成小分子的揮發性脂肪酸，而一般硝化桿菌的作用是進行硝化。本試驗在穩定運行期有很好的硝化以及去除cod和氮、磷的效果[1，11]，從而進一步驗證了上述觀點。

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5 除磷生物膜生物相

5．1　原生動物和后生動物的特征淹沒式生物膜反應器從進水到出水，有機物濃度變化很大，然而其中的微生物相卻比較穩定，而且在數量上也沒有出現大起大落的情況。原生動物主要為纖毛蟲類，其中出現頻率最多的是固著型纖毛蟲類，有鐘蟲、累枝蟲和蓋蟲;其次是游泳型纖毛蟲，有草履蟲(主要在進水時出現)、腎形蟲和漫游蟲。另外，生物膜中也有少量的綠眼蟲和變形蟲。生物膜中出現的后生動物有線蟲類、輪蟲類、甲殼蟲類等。甲殼蟲動物主要為水蚤類。值得指出的是淹沒式反應器生物膜上的生物相并沒有象傳統的生物膜法那樣，隨著從進水到出水而改變，相反在整個處理過程中，鐘蟲、累枝蟲、線蟲等一直生長良好，而且在數量上沒有太大變化，這些適于在低污染度條件生活的微生物仍能存活，只是隨環境條件的改變，原生動物和后生動物的形態也隨之變化。因此，在同一周期內，淹沒式生物膜反應器中的原生動物和后生動物種屬不宜用來指示水質，而只能從原生動物的形態來指示水質。

5．2　原生動物和后生動物的作用原生動物可直接利用水中有機物質，對水中有機物的凈化起一定的積極作用，更主要的是原生動物是以吃細菌為主，而后生生物是以細菌、小的原生動物和有機顆粒等為食物，從而形成食物鏈和不同營養級的消費者生物，與反應器環境形成一個生態系統。細菌、原生動物和后生動物的活性在好氧條件下要比無氧條件下大大提高，所以淹沒式生物膜除磷反應器在從厭氧轉為好氧時，除磷菌的繁殖速度將大大加快，而原生動物、后生動物的捕食能力也逐漸增強，而這時被吞食的除磷菌大都是過量攝取了磷的細菌，因此，原生動物、后生動物在體內富集了磷，而這些磷將隨同其死亡尸體轉入污泥，從而有利于提高淹沒式生物膜反應器中脫落污泥的磷含量;其次，在好氧段由于原生動物、后生動物的活動可軟化生物膜，促使生物膜松動、脫落，并提高氧轉移率，從而能使生物膜經常保持活性和良好的凈化功能，既有利于去除有機物，也有利于除磷。

6　結論

(1) 淹沒式生物膜除磷反應器中，生物量大，mLvss達5531．7mg/L;細菌總數多，為1．56×109個/mL，從而為生物除磷在菌數上奠定了基礎。

(2) 脫落污泥沉降性好、含磷量高，污泥產率為0．1996kgds/kgcod。