細胞生物學研究范文

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【關鍵詞】細胞生物學 拓展 實驗操作

【中圖分類號】G642 【文獻標識碼】A 【文章編號】1006－9682（2011）07－0057－01

【Abstract】Cell biology is a basic subject of life science, which is very important in the teaching of postgraduate. This paper enhences the higher level in the teaching cell biology for postgraduste by the definite reform measures of teaching with combining the requirement teaching program, and adopt the development and progress of science and technology.

【Key words】Cell biology Expand The exprement operation

目前，隨著科學和技術的快速發展，細胞生物學作為生命科學和生物技術領域的一門專業基礎課，在當前該方向的研究生教學中十分重要。那么，如何使研究生的細胞生物學教學跟上時代的步伐，如何培養和提高研究生的實踐創新能力，是從事研究生細胞生物學教學的教師必須認真思考的問題。根據近年來研究生細胞生物學教學的教學體會，作者認為應從以下幾個方面著手進行教學改革，旨在為研究生的細胞生物學教學提供參考：

一、教學改革實踐的措施

1．建立一支高水平的教師隊伍

細胞生物學是一門實踐性比較強的學科，要建立細胞生物學教學與實驗相結合的機制，就必須選擇具有扎實基本功和教學經驗豐富的教師作為該課程的主講教師。［1］必須配備一定的實驗技能教師進行研究生教學實踐的實驗教學，培養學生的動手和創新能力，同時要求課題組形成以教師講解與實驗教學相結合的教學機制，輔以博士研究生和碩士研究生親自動手參與實驗和教學的新的教學方式。同時要注意課題組的教師經常進行教學經驗和教學技能的教改研究，熟悉學科的前沿發展趨向和研究動態。［2］教師能夠把最前沿的知識傳授給學生，擴展視野，激發研究生進行科學實驗的興趣十分重要。同時，也為高水平的教師隊伍的建設提出了更新、更高的要求。

2．結合教學大綱和教學實際，調整教學內容。

（1）力求按照教學大綱要求進行教學，培養創新能力。細胞生物學教學大綱是開展教學的基本框架和內容，為了適應未來社會的需求，教師必須讓學生掌握細胞生物學的基本理論和基本內容，為將來的實際應用打下良好的基礎。因此，選取教材十分重要，作者認為研究生作為高校培養的高級人才，在本科階段已經學過細胞生物學，但是對分子細胞生物學的了解較少，應該選取分子細胞生物學教材，同時在課程安排上考慮實際情況，針對薄弱環節結合教學大綱的要求進行知識結構的調整，從一定的層次要求他們學好這門課程。例如，在教學細胞生物學的基本概念和原理時，應該給出一些事實（例）和問題，讓學生積極思考回答這些問題，在理解的基礎上掌握概念和原理，而不是進行單純的講解，同時也允許學生能夠結合自己在做科研中發現的問題，進行課堂討論，及時總結，激發學生興趣，充分發揮學生的積極性和創造性。［3］

（2）根據課題組的實際情況，進行教學內容的調整。隨著科學技術的進一步發展，細胞生物學領域的進展十分迅速，原來的細胞生物學教科書所涵蓋的內容可能正在發生著新的進展，同時研究生作為學科發展的生力軍，在本學科的教研中起著非常重要的作用，例如針對植物課題組的研究生教學就應該把重點放在植物細胞生物學的研究上，同時也要照顧到動物學和微生物學課題組修該課的研究生，不同的學生要求掌握的重點不一樣，進行教學講解，要做到有的放失。同時，在現行的教學研究中應該根據大綱要求的每個章節所涵蓋的內容結合課題組的實際情況作以適當的調整，補充新的研究進展，開展專題講座，做到既要顧及全局，又要點面結合，［4］做到切合實際的講解，便于研究生更深入的了解和學習各個章節的內容。

（3）補充新的教學前沿動態研究。傳統的細胞生物學研究只是研究細胞的形態、結構和功能等方面，目前細胞生物學的發展逐漸深入到分子領域，且處于快速發展的領域，例如細胞功能方面的研究已深入到分子領域，作者認為研究生細胞生物學的教學應該結合此領域新的研究進展進行講解，使學生能夠了解最新的發展動態，使其受到啟發和教育，為今后的科研工作奠定一定的理念和指明方向。［5］應該在緊扣教學大綱的基礎上結合分子生物學的發展進行拓展講解，使學生能夠了解該章節所涉及的發展前沿，跟上科技進步的步伐，才能在以后的科研中奠定好的基礎，不致于落伍。

（4）結合教學實驗課進行教學實踐總結。細胞生物學是一門實踐性非常強的學科，應該在進行教學的同時給學生一個實踐的機會，因此應該結合教學計劃給予一些階段性的實驗操作，因為實驗是教學的重要組成部分，二者相結合更有助于培養研究生的動手能力和創新能力，這樣對教學的效果也起到一定的補充和檢驗過程。［6］

二、教學改革效果的檢查和驗收

現行的研究生教學必須進行改革，但是對于教學改革的效果如何？應該分階段針對所進行的教學改革的具體實踐措施進行有針對性的檢查和驗收，促進研究生細胞生物學教學的大膽改革和嘗試，同時也為高校培養細胞生物學方面的高級人才隊伍打下基礎。

參考文獻

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【關鍵詞】細胞生物學；教學模式；

【前言】細胞生物學是生命科學中既基礎又前沿的一門學科，它是我國基礎學科發展規劃中的四大基礎學科之一[1]。細胞生物學是生命科學各個分支學科在細胞層次上的交匯，它從顯微、亞顯微和分子水平對細胞的各種生命活動開展研究，進而探討人體細胞結構、功能、發生、發展、衰老和死亡的生命活動規律及發病機理，是高等醫學院校的核心主干課程之一。

進入21世紀以來，細胞生物學的研究發展迅猛，新知識、新方法、新成果層出不窮，傳統的以教師為主的課堂教學模式已無法滿足新形勢下培養高素質人才的要求[2]。如何在有限的課堂教學學時內，切實提高教學質量與效果，讓學生在完整系統地掌握細胞生物學基礎知識的同時，及時了解細胞生物學的最新研究進展及其在臨床醫學中的應用，是目前亟待解決的問題。因此，對現有的教學手段和方法進行優化與改革，探索出符合時代要求的新的細胞生物學教學模式勢在必行。

1、高等醫學院校細胞生物學的教學現況

目前，大多數醫學院校的細胞生物學理論教學存在兩個主要問題：一是學時少，二是內容繁雜、抽象、枯燥且知識點瑣碎。作為醫學基礎的必修課程，我校的細胞生物學安排在大學一年級的第二學期，理論授課采用大班（130人左右）傳統的講授式教學法（LectureBasedLearning，LBL），即以教師為中心，以系統授課為導向的教學方法，這一方式雖可以系統講解基礎知識，但不利于學生自主學習能力的培養[3-4]。而病例教學法（CaseBasedLearning，CBL）是以典型病例為先導，將臨床與相關基礎問題相結合，以學生為主體的啟發式教學方法[5-6]。這種教學方式雖能克服LBL的不足，提高學生的學習主動性和積極性，但是否適合在超過百人的大班授課過程中實施，仍有待商榷。針對我校現存的細胞生物學的教學現狀，我們采用CBL與LBL相結合的教學方法，以期探索出適合我校的切實可行的細胞生物學教學模式。

2、引入臨床案例，提高學生的學習興趣

我校臨床醫療專業的細胞生物學理論教學只有28學時，學時相對緊張，因此我們在授課方式上采用靈活多變的教學模式。對于教材中理論性較強，通俗易懂的知識，仍采用傳統的LBL方式講授，而對于一些難點、重點且與臨床結合緊密的知識點則采用CBL模式。在CBL教學過程中，案例的選擇與問題的設計是關鍵。教師在備課過程中，搜集與授課章節密切相關的常見病例，查閱文獻資料，對病例進行適當的修改和補充，進而編寫成教學病例，并設計相關問題。例如在講授細胞膜物質運輸時，引入“家族性高膽固醇血癥”，引導學生學習受體介導的胞吞作用；利用“矽肺”病例，講解溶酶體膜穩定性的重要；通過囊性纖維化（CysticFibrosis，CF）病例分析，引導學生學習蛋白質在內質網腔中正確折疊的重要性。CBL改變了傳統的教師講、學生聽的教學模式，學生成為案例分析和課堂討論環節中的主體。學生通過學習、研究案例來掌握基礎理論知識，變抽象為具體，而不再是死記硬背單一的知識點，這充分調動了學生學習的主觀能動性，提高了學生的邏輯推理能力，同時也促進了其分析問題、解決問題能力的逐步提升，對學生綜合素質的培養及日后從事臨床工作頗有益處。

3、多媒體教學和網絡學習相結合

醫學細胞生物學的某些理論知識相對抽象、晦澀，因此在以LBL為主進行授課時，PPT課件的制作至關重要。我們力求在每一章節的授課過程中將圖片、動畫與視頻相結合，圖文并茂，充分調動學生的學習興趣，從不同的角度吸引學生的注意力。在充分利用多媒體這一教學手段的同時，我們還利用學校覆蓋全面的無線網絡，將教學過程延展到校園的每一個角落。目前，我校的細胞生物學已成功獲批遼寧省精品資源共享課，課程建設已順利完成。因此，教師可以將教學網站提供給學生，方便學生及時查閱PPT課件、課后自測習題、拓展學習等教學相關資料。同時，我們的SPOC網絡教學平臺也于2018年3月建設完成并投入使用，該平臺的應用進一步夯實了網絡教學基礎，也在一定程度上解決了課堂教學學時緊張的問題。另外，我們還建立了細胞生物學教研室的教學公眾號，定期推送細胞生物學研究的最新進展，課后教師和學生還可以利用微信群和QQ群進行交流與學習的互動。

4、優化理論教學內容，拓展研究型課堂

作為醫學基礎課程，細胞生物學與生物化學、生理學等其他課程的內容有部分的重疊和交叉，為了避免不必要的重復，保證細胞生物學與其他課程知識的緊密銜接，教研室與相關課程的授課教師進行溝通，刪減醫學細胞生物學與其他學科的部分重復內容，合理安排教學章節。同時，在教學過程中有選擇地補充了與本課程密切相關的科研進展，引導學生利用課外時間查閱相關文獻，了解本學科最新的相關研究進展，逐步深化、拓展研究型教學，提高他們自主學習的積極性和主動性。

5、反饋與評價

在2017年、2018年學期末課程結束后，我們連續兩年分別在2016級和2017級臨床醫學專業的260名學生中發放調查問卷，對教學過程和教學效果進行評價。問卷發放260份，收回有效問卷254份，有效回收率為97.7%。通過對問卷進行整理分析，得出以下調查結果：95.8%的學生認為開設細胞生物學課程非常必要或有必要；95.5%的學生認為非常必要或有必要建立網絡教學平臺；98%的學生認為在教學中介紹臨床相關知識非常必要或有必要；97.4%的學生認為非常必要或有必要在教學中介紹相關的研究進展和熱點問題；87.7%的學生喜歡并接受CBL與LBL相結合的教學模式，其中有92%的學生認為這種教學模式可以充分激發自己的學習興趣，但有21.4%的學生認為這種教學模式在對基礎知識的系統掌握和理解方面無顯著促進作用；87%的學生認為CBL與LBL相結合的教學模式可以明顯提高或提高自學能力在調查中，學生還結合自己的體驗對細胞生物學的教學提出了一些建議和意見，也在一定程度上反映了我們在教學方面存在的不足和問題。

綜合分析調查結果和學生提出的合理化建議、意見，我們將采取下列改進措施：由于授課對象是大一學生，學生相關的專業知識儲備不足，因此在選擇課堂教學案例時，應盡量選擇典型而淺顯的病例，并請教臨床的醫生，進行更為準確的描述，重新撰寫案例分析，結合實際教學情況完善教學案例素材；課堂教學及時補充與案例相關的知識點，逐步提升學生自主學習的主動性和積極性；進一步完善網絡教學平臺建設，并配備專業人員進行平臺監管，真正實現師生時時互動，充分發揮網絡資源的空間延展性。

總之，教無定法，因材施教。教學工作就是一個不斷優化的過程。在與學生的交流和互動過程中，我們將不斷總結反思，探索前行，選擇真正適合學生的教學模式，不斷完善教學過程，切實提高教學質量，培養學生成為符合時展需要的新型醫學人才。

【生物博士論文參考文獻】

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[關鍵詞]腭裂；瘢痕；成纖維細胞；rhIFNα-2b；rhIFN-γ

[中圖分類號]R619+.6R782.2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）06-0926-03

Empirical study of interferon affecting on the fibroblasts of the exposed bone surface from cleft palate scar

TAO Ming1,2,HU Chao3,DING Ding1,ZHAO Li-li1,ZHAN Jia1,SUN Hui1,SUN Hui1,WANG Yuan-yin1,ZHOU Jian1

(1.Stomatological Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230032,Anhui,China;2.Department of Stomatology,Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 24100,Anhui,China;3.Department of Stomatology,The Third Military Medical University,Chongqing 400037)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface from cleft palate scar in vitro cultural. MethodsMaking rabbit cleft palate scar models, in vitro culture,observed by MTT assay and flow cytometry, analysis the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface of cleft palate scar. Data using analysis of variance and q test treatment. ResultsCompared with the control group,after added interferon, cleft palate fibroblast's growth trends and value-added activity of experimental group was inhibited significantly. Percentage of cells decreased during the S-G2-M stage.ConclusionsInterferon on the growth trends and value-added activity of the cleft palate fibroblast has significant inhibitory effect, indicating that cleft palate in the prevention of scar formation of the exposed bone surface has some value.

Key words:cleft palate；scar；fibroblast；rhIFNα-2b;rhIFN-r

先天性腭裂發病率約占人口出生率的1/700左右，嚴重影響患者的口腔頜面部器官的形態與功能及心理健康。雖然目前的外科技術已能實現對腭部裂隙的良好修復，有助于語音及吞咽功能的恢復，但大量的臨床與基礎研究證實，術后患者上頜骨的生長發育繼發畸形會變得更為嚴重，對患者的頜面形態與功能構成嚴重危害。腭裂術后上頜骨繼發生長畸形的病理解剖學基礎已經探明是腭裂術后遺留在上頜骨硬腭的骨面瘢痕攣縮所致[1-2]。因此，如何防治腭裂術后骨面瘢痕形成是目前口腔頜面外科領域亟待解決的難題之一。在瘢痕的形成與增生過程中，成纖維細胞是主要的效應細胞，其功能狀態是影響瘢痕發生、發展、以及轉歸的主要因素。干擾素（IFN）具有抗病毒、抗腫瘤、影響細胞增殖分化等多種生物學效應。臨床上已經有將干擾素用于防治瘢痕形成的報道,但用干擾素觀察腭裂術后骨面瘢痕成纖維細胞生物學行為的影響尚未見報道，本實驗通過體外觀察和研究干擾素對腭裂術后骨面瘢痕成纖維細胞的生物學作用，可為尋求應用干擾素治療腭裂術后骨面瘢痕提供實驗依據。

1材料和方法

1.1 實驗試劑：DMEM培養基（低糖 美國Sigma公司），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma公司），PBS(pH7.2～7.4)液，Hank's(pH7.2～7.4)液（自配），rhIFNα-2b和rhIFN-γ（安徽安科生物工程股份有限公司），MTT溶液（5mg/ml）(美國Amresco公司)，二甲亞砜（DMSO，分析純）。

1.2 實驗方法

1.2.1兔腭裂術后骨面瘢痕動物模型的制備：成年大耳白兔6只（合肥工業大學控釋藥物研究中心動物室提供），體重2千克，3%戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg進行耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定四肢，張口，沿腭中縫做縱行切口，逐層切開腭部軟組織，骨膜分離器左右分離軟組織，顯露出上腭骨面，徹底止血后沿切口縫合。麻醉效應過后，兔肢體可自由活動，術后連續5天每日肌注80萬單位青霉素，術后4周在全麻下沿原切口切開，取腭部骨面上的瘢痕組織以進行下一步實驗。

1.2.2腭裂術后骨面瘢痕成纖維細胞的原代培養及傳代：采用組織塊法進行成纖維細胞原代培養(見照片2)，用含15%新生小牛血清DMEM培養液于37℃、5%CO2孵箱中培養，2～4天更換培養液，待原代培養長出的成纖維細胞接近或達到融合時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3細胞生長增殖情況（MTT測定法）：取第3～5代生長狀態良好的對數生長期細胞，消化后用15%新生小牛血清DMEM培養液制成細胞懸液，調整細胞數位1×106/ml，接種于96孔培養板中，共2板，每孔加入200μl，并留下不含細胞和培養液的調零孔，將96孔板移入37℃、5%CO2孵箱中培養24h。取出96孔板，棄上清液，每孔加入200μl無血清DMEM培養液繼續培養24h。取出96孔板，換新培養液，實驗1組分別加入濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培養液，實驗2組分別加入濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培養液每孔液體總量為200μl；對照組加相同容積的DMEM培養液；每一濃度藥物設6個平行孔。將96孔板置入37℃、5%CO2孵箱中分別培養24、48h。

MTT測定法：取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，繼續培養4h后取出，小心吸去孔內上清液，每孔加入150μlDMSO,振蕩10min，使結晶物充分溶解；選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收（OD）值。

1.2.4細胞周期分析(流式細胞術)：取第6～8代生長狀態良好的對數生長期細胞，消化后制成單細胞懸液，調整細胞數為1×106/ml，接種于25cm2的細胞培養瓶內，培養24h。棄原培養液，加入無血清DMEM培養液繼續培養24h，進行細胞同步化處理。實驗1組分別加入終濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培養液；實驗2組分別加入終濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培養液；對照組加入相同容積的DMEM培養液，每組3瓶。將培養液置入37℃、5%CO2孵箱中培養48h；0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，1 000r/min離心5min，棄上清，收集細胞，70%冰乙醇固定18h，4℃保存；PI綜合染液室溫下避光染色30min，300目尼龍網膜過濾，流式細胞儀測細胞周期。

1.3統計學處理：實驗結果用x±s表示，采用方差分析及q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 干擾素抑制腭裂術后瘢痕成纖維細胞生長增殖：MTT比色實驗測定結果顯示，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ培養24h后實驗組于對照組OD值之間差異無統計學意義（P＞0.05），培養48h后，與對照組比較，2 000U/ml濃度組差異無統計學意義（P＞0.05），4 000、6 000、8 000、10 000U/ml濃度組差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），提示rhIFNα-2b和rhIFN-γ對腭裂術后骨面成纖維細胞的增殖有抑制作用（見表1、表2）。

2.2干擾素對腭裂術后瘢痕成纖維細胞的細胞周期的影響：流式細胞術測定結果顯示：對照組成纖維細胞培養48h處于S-G2-M期的百分比為（44.54±3.21）%，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ作用48h，與對照組比較，2 000U/ml濃度組差異無統計學意義（P＞0.05）；而4 000、6 000、8 000、10 000U/ml濃度組處于S-G2-M期的百分比均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）（見表3）。

3討論

國內外研究已表明，腭裂術后硬腭部骨面的形成及瘢痕修復將抑制患者上頜骨的生長，引起患者顏面部凹陷，反牙合等畸形和功能障礙。有研究表明骨面的瘢痕組織，由于缺少大血管和彈力纖維，膠原纖維呈橫向走行并通過纖維附著于硬腭骨上，而且粘骨膜與牙周韌帶相延續，因此在收縮時，對牙弓產生向內的牽張力，從而導致了面中份骨的發育不足[3]。創傷愈合是人體組織修復的一種過程，而瘢痕形成則是過度愈合或愈合紊亂。瘢痕中的成纖維細胞是創面愈合、瘢痕形成、增生和攣縮的功能性細胞，其增殖、活化、分化的異常直接導致病理性瘢痕的形成。干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤以及免疫調節等多種生物活性的細胞因子。它是目前比較明確的瘢痕增生負性調節因子[4-5]。近年來,許多體外研究表明干擾素具有抑制成膠原的合成，促進膠原降解以及激活膠原酶的活性,起到對病理性瘢痕中成纖維細胞的抑制作用[5-6]。臨床上也有局部注射干擾素來治療病理性瘢痕的報道[7-8]。然而，干擾素是否對腭裂術后骨面瘢痕來源的成纖維細胞有抑制作用，之前未見報道。本實驗將干擾素作用于體外培養的兔腭裂術后骨面瘢痕成纖維細胞中，結果表明對細胞增殖產生明顯的抑制作用。

我們為了能夠將干擾素應用到預防腭裂術后的繼發畸形中，于是在此首先觀察了rhIFNα-2b和rhIFN-γ對體外培養的腭裂術后骨面瘢痕來源的成纖維細胞的作用，以便為后續研究打下基礎。本實驗顯示，IFN在較高濃度時對瘢痕成纖維細胞的生長增殖具有明顯的抑制作用。本實驗中采用MTT法檢測IFN對成纖維細胞生長增殖的影響，結果發現當加入IFN48h后，4 000～10 000U/ml濃度組OD值明顯低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），說明實驗組的細胞比對照組細胞生長要慢，活細胞數相對較少，提示IFN對細胞增殖活性產生了抑制作用。但實驗組細胞48h的OD值與24h相比仍然有所增加，說明rhIFNα-2b不能絕對抑制細胞增殖，而是抑制了細胞的增長趨勢。由于MTT比色法測定反映的是細胞總數，于是我們又應用流式細胞儀測定了細胞總數中各細胞周期的百分比，反映細胞中處于分裂期的總體比例，能準確地揭示群體細胞中具有分裂能力的細胞量。結果顯示加入IFN后在短時間內（24 h）與對照組無明顯差別，而延長觀察時間（48h） 則整體瘢痕成纖維細胞中處于S-G2-M期的比例降低（2 000 U/ml濃度組除外）。說明加入的IFN的抑制活性與細胞數量改變之間有一定的時間濃度依賴關系。我們預測：高濃度的IFN在促使瘢痕組織軟化、預防和治療瘢痕攣縮方面可以發揮作用。

本研究分析測定了IFN對瘢痕成纖維細胞的生物學效應。體外實驗肯定了IFN對腭裂術后骨面瘢痕的成纖維細胞的生長趨勢及增殖具有顯著的抑制作用。雖然其具體的作用機制目前尚未完全清楚，但為進一步進行活體實驗提供了依據，也為臨床上預防和治療腭裂術后骨面瘢痕形成及術后上頜骨繼發畸形提供了重要的參考信息。

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1細胞壁的層次與化學組成

細胞壁是原生質生命活動中所形成的多種壁物質加在質膜外方所構成的。由于這些壁物質種類、數量和比例組成上的差異，使細胞壁具有成層現象〔3〕。細胞壁由內到外一般分為胞間層、初生壁和次生壁三個層次，也有一些細胞僅具胞間層和初生壁。

1.1胞間層

胞間層亦稱中層，是細胞分裂產生新細胞時形成的，主要成分是果膠質。胞間層的存在使相鄰的細胞粘連在一起，并可緩沖細胞間的擠壓。

1.2初生壁

初生壁是在細胞生長過程中形成的細胞壁層次，主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質。初生壁具有較大的可塑性，既可使細胞保持一定形狀，又能隨細胞生長而延展。

1.3次生壁

次生壁是細胞體積停止增大后加在初生璧內表面繼續積累形成的細胞壁層，其主要成分為纖維素和半纖維素。

2細胞壁的特化及常見類型

2.1細胞壁的特化

在細胞壁停止生長后，由原生質體產生一些特殊的次生代謝物質，并填充到細胞壁纖維素分子束交錯的網狀空間里，從而引起細胞壁的結構和理化性質產生明顯的變化，即細胞壁的特化。細胞壁的特化是植物在長期進化過程中，植恤細胞在對環境和生理功能的適應的結果。

2.2細胞壁特化的類型根據細胞壁中滲人的化學成分不同，細胞壁的特化類型主要有木質化細胞壁、角質化細胞壁、栓質化細胞壁、礦質化細胞壁和私液化細胞壁等[4]。

2.2.1木質化

細胞壁木質化細胞壁指細胞壁內填充和附加了木質素。木質素是一種分子量相當高的有機化合物，是苯基丙烷衍生物的聚合產物。它比纖維素彈性小，但硬度大。經過木質化后，細胞壁的硬度提高，增加了細胞壁的機械支撐能力。

2.2.2角質化

細胞壁角質化細胞壁指細胞壁為角質所浸透，并常在細胞壁的表面形成一層無色透明的角質層。角質的主要單體成分是單、雙及三經基脂肪酸，這些經基脂肪酸主要通過醋鍵相互連接。細胞壁的角質化使細胞表面形成堅固的疏水層。

2.2.3栓質化

細胞壁栓質化細胞壁指細胞壁內填充和附加了栓質。栓質是脂肪酸組成的高度聚合的化合物。細胞壁經過栓質化后，失去了對水和空氣的通透性。

2.2.4礦化細胞壁

礦化細胞壁指細胞壁滲人鈣鹽或硅質。鈣化合物主要有果膠酸鈣、碳酸鈣、草酸鈣等。硅質主要是二氧化硅、氧化硅等。細胞壁經過礦化后，變得粗糙堅硬，增加了支持力。

2.2.5私液化細胞壁

私液化細胞壁指細胞壁中果膠質和纖維素豁液化或樹膠狀。此類細胞細胞壁僅具果膠層和初生壁。貓液化細胞壁使細胞表面由于水分條件不同而呈現固體狀態或粘液狀態，有利于種子的吸水萌發。例如，車錢、亞麻的種子表皮細胞。此外，細胞壁的特化還包括蠟質化細胞壁和揉質化細胞壁等類型。細胞壁中滲人蠟質，稱為蠟質化，此類細胞常在細胞壁外具蠟被，常可以減少細胞水分損失和機械損傷或抵御病原體的侵人，例如甘蔗莖的表皮細胞。還有一些植物細胞壁滲人揉質，稱為靴質化，常見于多年生木本植物的根、莖中，如鍛樹、松柏類，是細胞腔內的揉質后含物向次生壁滲人的結果。

3植物組織細胞盛的特化與功能的適應

3.1保護組織

保護組織具有減少水分蒸發和機械損傷或抵御病原體的侵人等功能。保護組織的細胞排列緊密，沒有胞間隙，細胞壁高度特化。

3.1.1表皮

表皮是植物體的初生保護組織，由表皮細胞組成。不同種類的植物體莖、葉的表皮細胞細胞壁的外切向壁常角質化或蠟質化或硅質化。表皮細胞是幼嫩植物最外面的保護層，直接與外界環境相接觸。角質化的細胞壁及角質層是陸生植物表皮細胞壁特化的常見類型，這些結構的存在使植物體整個表面形成堅固的疏水層，有效減少了水分散失，體現了對陸生環境的適應。而水生植物、濕生植物的表皮細胞一般沒有角質層或角質化不明顯。另外，在一些單子葉植物葉的表皮細胞中，如小麥、玉米的葉一部分表皮細胞的細胞壁發生礦質化，常為具有棘突的硅質化細胞。細胞壁經礦質化后變得更加堅硬，葉片用手觸摸有些粗糙，有時甚至會劃破皮膚。表皮細胞礦質化是此類植物抵御動物取食或損傷的有效手段。

3.1.2周皮

周皮是植物體的次生保護組織。隨著植物體的次生生長，植物根、莖不斷加粗，出現周皮，它取代表皮在植物體表面起保護作用。周皮由木栓層、木栓形成層、栓內層組成。木栓層在周皮的最外層，一般由幾層扁平細胞疊落狀排列。木栓層細胞是典型的栓質化細胞，成熟的木栓層細胞是死細胞，原生質解體，僅存木栓質的壁。栓質化的細胞壁不能透過水分和空氣，而且隔熱、絕緣。細胞壁的這些特點使木栓層成為覆蓋在植物體表的一層堅固屏障，是植物體完善的次生保護組織。

3.2機械組織

機械組織是對植物起主要支持作用的組織，它有很強的抗壓、抗張、抗曲繞的能力。植物能有一定的硬度，枝干能挺立，樹葉能平展，能經受狂風暴雨以及其他外力的侵襲都與機械組織的存在有關。機械組織的細胞常成束或成層分布，細胞壁強烈木質化。機械組織在植物體內可以分為厚角組織和厚壁組織。厚壁組織是植物體內主要的機械組織，主要由纖維和石細胞組成。

3.2.1纖維

纖維是在植物體內分布最為廣泛的厚壁組織。纖維細胞長梭型，成束存在。成熟的纖維細胞為死細胞，原生質解體，細胞腔狹小，次生壁強烈加厚且高度木質化。由于經過木質化后，細胞壁的硬度提高，增加了細胞群的機械力和支撐能力，使纖維構成植物體內最主要的支持骨架。一些植物的韌皮部富含纖維，例如竺麻、棉花、大麻等，是人類紡織和造紙的重要原料。

3.2.2石細胞

石細胞主要分布在植物的果皮與種皮中。石細胞常呈不規則穎粒狀并成層存在，成熟的石細胞為死細胞，細胞腔很小，中空，次生壁強烈加厚且高度木質化。成層存在的石細胞提高了果皮和種皮的硬度，對果實和種子起到保護作用，例如板栗堅硬的果皮、椰子堅硬的內果皮和豆類的堅固種皮等。

3.3輸導組織

輸導組織是植物體中擔負物質長途運輸的主要組織。輸導組織細胞長管狀，管腔大，細胞壁次生木質加厚，端壁特化，這些特點都與其功能完美適應。輸導組織的主要細胞有導管分子、篩管分子及伴胞。

3.3.1導管

導管分子為長管狀大型細胞，多個導管分子彼此縱向相連構成導管，是植物運輸水分和無機鹽的主要結構。成熟的導管分子為死細胞，細胞腔中空，具加厚的木質化次生壁。導管分子兩端壁特化為穿孔，提高了運輸效率。

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申明:本網站內容僅用于學術交流，如有侵犯您的權益，請及時告知我們，本站將立即刪除有關內容。 摘要：隨著我國教育事業的不斷發展和新課改的不斷推進，對高中生物課堂教學的教學策略也提出了新的要求。依照高中生物新課程理念，對課堂教學過程進行優化、對教學方式進行完善、對教學策略進行研究已成為高中生物教學發展的重中之重，因為只有這樣才能不斷提高高中生物教學的實效性，提高學生的生物學習水平。本文對高中生物《組成細胞的分子》教學策略進行研究。 關鍵詞：高中生物 《組成細胞的分子》 教學策略

《組成細胞的分子》是人教版高中六冊課本中必修第一冊《普通高中課程標準實驗教科書生物1（必修）分子與細胞》第二章的課程內容，這一章節在高中生物課程的學習中有著及其重要的作用，該章是學習第一冊教材其它章節、其它必修模塊以及選修模塊的知識基礎，是培養學生探究、繪圖、實驗等技能的基礎。所以研究如何上好這一章的內容對整個高中生物課程教學都有著極其重要的作用。

一、教學課時安排策略

《組成細胞的分子》這一章的內容主要分為細胞中的元素和化合物、生命活動的主要承擔者─蛋白質、遺傳信息的攜帶者─核酸、細胞中的糖類和脂質、細胞中的無機物這五個小節。建議教師每一節課對應一課時來進行講解，再加上其中兩節有實驗課，每節實驗課一課時，則這章的內容至少要七課時來完成教學計劃。為了循序學生由易到難的認知規律，建議把第一節《細胞中的元素和化合物》和最后一節《細胞中的無機物》放在一起學習[1]。這樣的課時劃分，有利于讓學生有針對性的掌握本章每一節的具體內容，并且能夠突出本章教材的重點和難點，能夠讓教師有側重點地去教學，讓學生能夠有側重點的學習和記憶教材內容，從而能夠提高生物課堂教學的有效率和學生學習的有效率。

二、聯系生活，創設學習情境

在教學過程中，教師要盡可能地創造條件，讓學生通過自主的活動，主動去觀察、去探究、去學習。生物是一門與實際生活聯系緊密的學科，教師可以通過聯系生活創設學習情境，讓學生在輕松、愉悅的學習氛圍中去學習知識、基本技能以及真正領悟科學的思想和精神[2]。《組成細胞的分子》這一章的內容與實際生活聯系尤為緊密，教師可以根據生活中的實際例子，來創設問題情境，讓學生既能夠激發學習興趣，又能夠加強學生對所學知識的理解，還能不斷提高學生的實際應用能力。例如教師可以通過“大頭嬰兒”的示例作為導入來引起學生對《生命活動的主要承擔者─蛋白質》這一節課的學習興趣，然后教師可以讓學生舉含蛋白質食品的例子等，讓學生在接下來的學習中集中注意力。在學習第3節《遺傳信息的攜帶者─核酸》時，教師可以從學生比較感興趣的DNA技術在案件偵破中的應用作為導入，并讓學生自主地圍繞DNA討論幾個問題，把學生從思維熱身中引入核酸內容的學習中。《細胞中的糖類和脂質》這一節內容更是與學生的生活和身體健康密切相關，教師要善于利用這一特點，結合學生的實際創設情境。一提到吃，學生肯定很感興趣，教師就可以利用“吃”來引入教學內容，可以通過“運動會時，可以為運動員們準備哪些能夠快速補充能量的食物”來讓學生認識到糖能為人提供能量，從而過渡到糖類的學習中。通過這樣的方式能夠緊緊抓住學生的注意力，激發學生的學習興趣。

三、不斷完善教學方式

受傳統教育的影響，我國高中教學的教學方式一般都是教師講、學生聽的模式，這樣的教學模式嚴重忽視了學生的主體地位，并且隨著新課改的不斷推進，傳統教學模式的弊端已逐漸顯露出來，這就要求教師從傳統教學模式的框架下走出來，不斷研究并采用國內外有效的教學方式，不斷完善生物課堂教學方式。例如小組合作模式，生物教學內容中的實驗部分是最適合運用小組合作學習模式的教學內容。例如“觀察DNA和RNA在細胞中的分布”的實驗，這個實驗是本節教學內容的關鍵，是本章兩個重要實驗之一。教師可以根據學生的性別、學習能力、實驗技能、興趣愛好等情況遵循“組內異質、組間同質”的原則進行合理分配劃分小組，分小組進行實驗探究并討論。這樣既能夠讓學生自己動手實驗學習知識，又能夠讓學生在小組合作中相互學習、相互促進，不斷提高生物學習水平。

四、運用多媒體技術

生物教學內容中有很多復雜的生命現象或者生化反應，代謝途徑等等，如果教師只是用語言去描述，學生接受起來就有所困難[3]。但是多媒體技術能夠把聲音、文字、視頻等進行有機結合，既形象生動、又直觀，讓學生能夠在視聽享受中加深學生對教學內容的理解，讓學生能夠自主的在頭腦中構建相應的理論模型和知識結構，這樣學生也容易掌握教學中的難點和重點。例如在學習《生命活動的主要承擔者─蛋白質》這一節的內容時，教師可以用多媒體技術展示氨基酸組成蛋白質的結構層次，通過多媒體來展示幾種氨基酸的結構，讓學生自己推導氨基酸的結構簡式，使抽象的內容變得形象生動，既能夠讓學生印象深刻，又能夠構建活潑開放的課堂氛圍。

結束語：

隨著新課改的不斷推進，很多新的教學模式和教學理念正在被廣大教師理解并且運用，已經在慢慢影響課堂教學實踐，并取得了一定的成果。但是我們也能發現，新理念、新教學模式、新教學策略在課堂教學的落實方面還存在著不足。本文上述提到的《組成細胞的分子》這一章的教學策略并不是唯一的、固定的，這就需要教師在教學過程中不斷總結分析并不斷完善，在教學實踐中不斷探索適合自身學科特點的教學策略。

參考文獻：

[1]胡冬英.高中生物新教材（人教版）《組成細胞的分子》的教學研究[D].廣西師范大學.2012，25（12）：21-22

篇6

【摘要】 目的:研究131I標記的Rituximab對B細胞淋巴瘤細胞的生物學效應以及對荷人Raji細胞移植瘤裸鼠的放射免疫治療效果，為放射免疫導向治療提供實驗依據。方法：體外培養人B細胞淋巴瘤細胞系Raji細胞，裸鼠皮下接種Raji細胞成瘤，IODO- GEN法將131I標記于Rituximab，將細胞分為131I- Rituximab組、單純抗體組、單純核素組及空白對照組4組，流式細胞儀檢測各組Raji細胞凋亡和細胞周期；取30只成瘤裸鼠隨機分成高、中、低劑量治療組及單純抗體組、單純核素組、空白對照組6組，進行裸鼠的放射免疫治療研究。每周測量裸鼠荷瘤大小1次，4周后處死裸鼠，取瘤稱重，常規病理分析。結果：131I- Rituximab組凋亡率高于其他各組；131I- Rituximab組細胞周期發生變化，大部分被阻滯在G2期。裸鼠各治療組與對照組比較，腫瘤生長減慢，腫瘤生長抑制率具有劑量時間依賴性，組織病理學檢測顯示治療有效。結論：131I- Rituximab能夠誘導Raji細胞凋亡并調控細胞周期，而且可特異性地定位于腫瘤組織，發揮放射免疫導向治療作用，具有潛在的臨床應用價值。

【關鍵詞】 放射免疫治療； B細胞淋巴瘤； 抗CD20單克隆抗體； 131I-Rituximab

非霍奇金淋巴瘤（NHL）是最常見的淋巴系統惡性腫瘤之一，其絕大多數是B細胞來源，放射免疫治療（RIT）屬于內照射治療，已成為目前B細胞NHL治療的研究熱點。本實驗將Rituximab-人鼠嵌合型抗CD20單克隆抗體偶聯放射性核素131I，從體外和體內實驗兩方面研究其對B細胞淋巴瘤的生物學效應。

1 材料與方法

1.1 細胞與實驗動物

人B淋巴瘤細胞系Raji細胞購于中國科學院上海細胞研究所；BALB/c裸鼠（4～6周齡）購于中國科學院上海實驗動物中心，于東南大學醫學院SPF動物房飼養。

1.2 主要試劑及器材

Rituximab購于羅氏制藥公司，Na131I購于南京森科公司，Iodogen(四氯二苯基甘脲)由蘇州大學醫學院核醫學實驗室提供，流式細胞儀為FACS Vantage SE型，SPECT顯像儀為德國西門子公司E.CAM9358型。

1.3 細胞培養

用含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1鏈霉素的RPMI 1640培養液，在37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養箱中培養，2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用流式細胞儀測定CD20表達率。

1.4 131I- Rituximab的制備

應用IODO- GEN法［1］標記，標記產物經Sephadex G- 25分離純化，檢測標記產物的標記率及放射化學純度。

1.5 體外實驗

1.5.1 分組 細胞換液后24 h，將細胞濃度調整為1×106 ml-1，分為4組。A組（131I- Rituximab組）：將131I- Rituximab加入Raji 細胞中，使131I- Rituximab的最終比放射性活度為3 μCi·ml-1（1 Ci=37 GBq），Rituximab的最終濃度為50 μg·ml-1；B組（單純核素組）：將Na131I加入Raji細胞中，使Na131I的最終比放射性活度為3 μCi·ml-1；C組（單純抗體組）：將Rituximab加入Raji細胞中，使Rituximab的最終濃度為50 μg·ml-1；D組（空白對照組）：加入等量培養液。上述各組劑量參照文獻［2］確定。

1.5.2 觀察指標 加藥24 h后顯微鏡下觀察細胞形態，流式細胞儀測定細胞凋亡和細胞周期：以Annexin Ⅴ- FIFC/PI雙染法測定藥物對細胞的早期誘導凋亡作用，采用DNA倍體分析法檢測細胞周期，重復測定3次。

1.6 體內實驗

1.6.1 B細胞淋巴瘤動物模型的建立 將處于對數生長期的Raji細胞，用不含血清的RPMI 1640調整細胞密度為1×107 ml-1，每只裸鼠皮下接種0.2 ml，30 d后部分裸鼠成瘤，挑選腫瘤直徑約為0.8 cm的30只成瘤裸鼠進行實驗分組。

1.6.2 實驗動物分組 成瘤裸鼠模型隨機分為6組（每組5只）。a組（高劑量組）：尾靜脈注射131I- Rituximab 400 μCi；b組（中劑量組）：尾靜脈注射131I- Rituximab 150 μCi；c組（低劑量組）：尾靜脈注射131I- Rituximab 50 μCi；d組（單純抗體組）：尾靜脈注射Rituximab 0.8 mg；e組（單純核素組）：尾靜脈注射Na131I 150 μCi；f組（空白對照組）：尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml。上述各組劑量參照文獻［3］確定。

1.6.3 治療效果觀察 （1）觀察實驗動物的一般狀況包括精神狀況、皮膚光澤、活動度、飲食、飲水情況，并稱體重；（2）每隔3～4 d測量腫瘤的長徑和短徑，根據公式計算腫瘤體積和腫瘤生長抑制率（IR）：V=ab2/2（a為長徑，b為短徑），IR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治療組的腫瘤體積，Vn為治療組的腫瘤體積)；（3）SPECT顯像：分別于注射后4、24、48、72、96、168 h顯像；（4）組織病理學檢測：治療4周后處死裸鼠分離腫瘤，稱重后用10%福爾馬林固定，HE染色，作常規病理檢查。

1.7 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件處理，進行方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結

果

2.1 Raji細胞形態改變及CD20表達率

倒置顯微鏡下可見細胞為圓形，生長旺盛，聚集成團，透明度高，折光性強。流式細胞儀測定CD20表達率為98.03％。

2.2 131I- Rituximab的標記率及放化純度

131I- Rituximab采用紙層析法測其標記率為90％，其穩定性好，4 ℃貯存24 h，其放化純度為91％。

2.3 體外實驗結果

2.3.1 鏡下細胞形態學改變 A、B、C組細胞生長受到抑制，數量減少，細胞收縮，胞核變小。

2.3.2 細胞凋亡情況 細胞凋亡率 A組為59.94％，B、C、D組依次為48.21％、40.40％、1.06％，各組間差異具有統計學意義(P

2.3.3 細胞周期分析 （1）A組有17.13%的細胞截止于S期，B、C、D組依次有24.31%、25.73%、33.32%，除B組和C組之間差異沒有統計學意義以外，余各組間差異有統計學意義(P

2.4 體內實驗結果

2.4.1 實驗動物的一般情況 b組裸鼠精神狀況、活動度、皮膚狀況、飲食飲水量及體重均未發現明顯異常變化；a、c和d組裸鼠精神情況尚可，活動度較b組略差，飲食飲水量輕度減少；e組和f組在實驗后期裸鼠精神萎靡，皮膚暗淡，體重減輕，飲食飲水量明顯減少。a組分別在注射后第2、3天各有一裸鼠死亡，說明劑量過高，射線對裸鼠本身有一定傷害作用。

2.4.2 131I- Rituximab對腫瘤的抑制情況 如圖1所示：a、b組隨時間的延長腫瘤體積無明顯增大甚至有所縮小，c、d組隨時間的延長腫瘤體積稍增大，e、f組隨時間的延長腫瘤體積有明顯增大。各組裸鼠經治療后第4周計算腫瘤生長抑制率，結果，a、b、c、d、e組依次為48.69％、47.60%、29.60％、17.27％、6.81％，各治療組與對照組之間差異具有統計學意義(P

2.4.3 SPECT顯像 給藥后4、24、48、72、96及168 h利用SPECT顯像。于注射后4 h腫瘤未見明顯顯影，周圍組織及血本底較高；24、48 h后a、b、c組可見腫瘤部位放射性濃聚（圖2），e組未見明顯腫瘤部位濃聚；72、96及168 h a、b、c 3組可見腫瘤圖像逐漸變淺；24 h b組可見腫瘤部位放射性濃聚。

2.4.4 病理觀察結果 e、f組腫瘤細胞增生活躍，可見較多的病理性核分裂相，偶見小灶性壞死；c、d組瘤細胞體積縮小，病理性核分裂相可見，腫瘤細胞核固縮、結構不清、破裂，腫瘤組織見小片壞死，部分區域腫瘤細胞全部壞死、消失；a、b組瘤細胞體積明顯縮小，病理性核分裂相可見，腫瘤組織見大片壞死（圖3）。

3 討

論

放射免疫治療（RIT）是近幾年在分子靶向治療基礎上發展起來的新的治療方法，即利用特異性抗體作載體，與能釋放射線的放射性核素偶合，注入體內與腫瘤細胞特異性結合，實現對瘤體的內照射治療，它不僅能殺傷與抗體結合的腫瘤細胞，還能殺傷鄰近的不表達抗原及無法與抗體結合的細胞。

RIT淋巴瘤具有許多優勢［4- 6］：（1）淋巴瘤細胞對射線具有高度敏感性；（2）RIT通過射線殺傷腫瘤，不必完全依賴補體依賴的細胞毒作用（CDC）和抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC），因此即使機體免疫缺陷、抗原表達陰性或腫瘤免疫逃避等導致抗體及免疫毒素無效時，內照射仍可發揮作用；（3）標記抗體本身固有強大的抗腫瘤效應；（4）放射性核素釋放的β射線能穿透多個細胞直徑的距離，因此對于周圍抗原表達陰性而沒有結合核素的腫瘤細胞同樣也有殺傷作用，這種作用稱為“交叉火力作用”（cross fire）；（5）與傳統的分次、短時、高劑量外照射治療相比，RIT為持續性低劑量內照射治療，避免腫瘤細胞在放療間隔期DNA的修復，且持續低劑量輻射使腫瘤細胞被阻止在對射線敏感的細胞周期G2期，從而增加放射性細胞毒作用。國外對該方面研究成果顯著：90Y- ibritumomab和131I- tositumomab已被FDA批準用于難治、復發性NHL及CD20陽性的轉型NHL的治療［7］。

本實驗從體外和體內實驗兩方面研究131I標記的Rituximab對B細胞淋巴瘤的生物學效應：體內實驗觀察131I- Rituximab對Raji細胞的早期凋亡及細胞周期的影響，體外實驗觀察131I- Rituximab對荷B細胞淋巴瘤裸鼠的治療效果。選用IODO- GEN法把131I標記到Rituximab上標記方法簡單，標記率及放化純度均在90％以上，標記物穩定，證明IODO- GEN法有很強的實用性。Raji細胞的CD20表達率達98.03%，證明CD20是放免治療B細胞淋巴瘤的良好靶點［8］，131I- Rituximab可與Raji細胞表面抗原CD20特異性結合，將131I固定到腫瘤細胞，131I所發射的β射線對腫瘤細胞產生輻射生物效應［9］，Rituximab在行使載體功能［8］的同時，其所產生的補體依賴的CDC和ADCC［10］共同作用抑制腫瘤生長。

體外實驗中，由于131I- Rituximab中131I所發射的射線對細胞產生的輻射生物效應，使細胞內DNA斷裂、交聯，影響了DNA的復制和細胞的有絲分裂。本研究顯示，131I- Rituximab作用于Raji細胞后其凋亡率為59.94％，而單純抗體組僅為40.40％。131I- Rituximab組有17.13%截止于S期，單純核素組、單純抗體組、對照組依次為24.31%、25.73%、33.32%，提示治療組腫瘤細胞增殖狀態不佳；131I- Rituximab組有69.01%截止于G2期，單純核素組、單純抗體組、對照組依次為65.10%、51.83%、50.13%，提示射線將腫瘤細胞阻滯于G2期，阻止細胞進一步分裂。以上說明131I- Rituximab具有生物導向的治療作用，通過持續低劑量輻射，使細胞被阻止在對射線最敏感的有絲分裂期，增強放射性細胞毒作用。

體內實驗中，從6組裸鼠腫瘤的增生情況及治療后第4周對腫瘤生長的IR來看，單獨使用Rituximab已經有一定的抑瘤效果，其抑瘤率達到17.27％；使用低劑量131I- Rituximab的抑瘤效果要好于單獨使用Rituximab的效果，這說明核素在其中起了增強作用；中劑量131I- Rituximab組的抑瘤效果最明顯，甚至使腫瘤略縮小；高劑量131I- Rituximab組由于劑量太高，雖然也有明顯的抑瘤效果，但是造成了正常組織的損傷，治療效果不理想。

總之，131I- Rituximab在體內和體外均顯示了較強的特異性殺腫瘤作用，適合以后作為免疫導向治療的藥物，針對B細胞淋巴瘤高表達的CD20抗原作為治療靶點的免疫導向治療前景樂觀。腫瘤放射免疫治療的發展為難治性復發性B細胞NHL治療開辟了新的天地。通過131I- Rituximab對B細胞淋巴瘤生物學效應的實驗研究，希望能夠為其進一步臨床應用提供實驗依據。

參考文獻

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篇7

【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；生物學特性；細胞培養

The Biological Characteristics and Culture in Vitro of Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

〔Abstract〕 ObjectiveTo further study the isolation and cultivation procedures of mesenchymal stem cells from rabbit in vitro， and explore their biological properties. To build an experimental basis on applying MSCs as seed cells to treat many diseases. Methods

MSCs were obtained from tibias by density gradient centrifugation and were tested the rate of adhesion. The configuration was observed under phase-contrast microscope consecutively and the cell growth was measured by MTT method. Cell cycle and surface antigens were detected through flow cytometer. Results The subcultured cells showed active proliferative ability. More than 95% of subceltured MSCs were adhesive in 12 h. MSCs were positive for CD29， CD44， CD105 and negative for CD34.

Conclusion

In present culture condion， MSCs showed stable and rapid

growth in vitro . The characteristics make it possible to MSCs to be the seed cells for tissue engineering.

〔Key Words〕

Mesenchymal stem cells; Biological characteristics; Cell culture

干細胞是具有自我更新能力，且在適宜微環境下具有多系分化潛能的原始細胞[1]。近年研究發現，機體內除胚胎干細胞外還存在具有自我更新和分化能力的成體干細胞。其中骨髓中的干/粒細胞包括間充質干細胞（Mesenchymal stem cells， MSCs），造血干細胞及網狀內皮系統。 MSCs 可在體外擴增并有多向分化潛能[2-4]， 且取材方便，免疫耐受性、遺傳背景穩定及易于轉染外源基因等，因而作為組織工程“種子細胞”有“廣泛的應用前景”[5-8]。本實驗通過對兔 MSCs 體外培養法及其生物學特性進行研究，以建立一套穩定、成熟的兔 MSCs 培養方法，從而為細胞移植等組織工程提供種子細胞來源提供實驗基礎。

1

材料及方法

1.1

主要試劑與儀器

低糖 DMEM 培養基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（Hyclone 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴細胞分離液（上海華精生物高科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 單克隆抗體和 FITC 標記的二抗（Lab vision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）、細胞培養箱（Forma）、流式細胞儀（FACSCalibur， BECTON DICKINSON 公司，美國）及超凈工作臺（ESCO）等。

1.2

實驗動物

普通級健康新西蘭大耳白兔，雌性，兔齡約 3 個月（南京市第一醫院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK [蘇] 2002-2007）。

1.3

方法

1.3.1

骨髓 MSCs 的分離純化與培養

兔仰臥固定于兔臺上，予 2% 利多卡因局麻后，持 16 號骨穿針，沿脛骨平臺垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）潤洗過的 10 mL 無菌注射器，抽取骨髓 4 mL，緩慢疊于等量 Ficoll 淋巴細胞分離液（密度 1.077 g/mL）上，以 2 000 r/min 的速度離心 20 min，分離骨髓單個核細胞，收集界面上的細胞，移入另一離心管，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心 5 min，反復 2 次，棄上清，懸浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL），輕輕吹打均勻，接種到 25 cm2 培養瓶，置 37℃，5% CO2 及飽和濕度培養箱中培養。4~6 d 首次換液，以后每 3 d 或 4 d 換液 1 次，14~21 d 細胞生長融合達 80% 以上，以 0.125% 胰蛋白酶消化，按 1:2 比例傳代培養，倒置顯微鏡下逐日觀察細胞形態。

1.3.2

骨髓 MSC 貼壁率檢測

取對數生長期細胞，0.125% 胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，調整細胞濃度為 1×105/mL，接種于 24 孔培養板，每次孔 1 mL，每 2 h 取出培養板，吸去 4 孔培養液，0.1 mol/L PBS 漂洗除去未貼壁細胞，0.125% 胰蛋白酶消化后離心收集細胞，進行細胞計數，共觀察 12 h，按以下公式逐個計算每個時相點的貼壁率：貼壁率=（貼壁細胞總數/接種細胞總數）×100%。

1.3.3

骨髓 MSCs 生長曲線的測定

取第 3 代生長良好的細胞，用 0.125% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM 制備細胞懸液，以每孔 103~104 個細胞于不同時相分別接種于 8 塊 96 孔板中的 8 孔，每孔體積 200 L，置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 L，37℃ 繼續孵育 4 h 后，每孔加入 150 L 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后選擇 490 nm 波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以時間為橫軸，光吸收值 A（OD）為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.3.4

骨髓 MSCs 表面標記測定

取第 3 代MSCs，用 0.125% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 離心 5 min，PBS 洗滌 2 次，調節細胞濃度為 1×106/mL，分為 4 份，分別滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以 PBS 代替一抗作為陰性對照），室溫反應 30 min 后，PBS 洗滌 2 次，滴加 FITC 標記的抗兔 IgG，避光反應 15 min 后，經流式細胞儀檢測細胞表面 CD29、CD34、CD44、CD105 陽性細胞的表達。

2

結

果

2.1

MSCs 的形態學變化

原代培養中，可見細胞以分散、克隆集落方式增殖；第 1~3 天細胞大部分呈圓形、橢圓形生長；第 3~7 天貼壁細胞增多，并逐漸延展生長為多角形、星形或梭形； 7~21 d 貼壁細胞明顯增多，并有集落形成，相鄰集落融合成片達 80% 以上，細胞排列呈漩渦狀，細胞間界限不清，細胞呈長梭形；14~21 d 后，細胞傳代，傳代后的細胞不以集落方式生長，而是均勻分布長梭形細胞。

2.2

MSCs 各時相點細胞帖壁率

見表 1。

2.3

MSCs 生長曲線分析

實驗發現，細胞傳代培養 1~2 d，吸光度變化不大，甚至有輕微下降，細胞處于潛伏期，第 3 天起呈對數生長，至第 7 天到達高峰，之后進入平臺期，見圖 2。

根據計算細胞的倍增時間公式可得：

DT = t ×〔lg2/（lgNt-lgNo）〕= 96 ×〔0.301/ （-0.060+1）〕= 30.8 h

2.4

MSCs 表面標記

流式細胞儀結果顯示：CD34、CD45 陽性細胞均為 0.8%；CD29 和 Cd105 陽性細胞數為 99.8%。說明分享獲得的細胞符合骨髓間充質干細胞的特點（見圖 3）。

3

討

論

MSCs 體外培養的生長特點和生物學特性已有較多相關文獻報道。MSCs 在骨髓中的含量極少，約占有核細胞的 0.001%~0.01%[9]，如何獲得高純度、足量的 MSCs，成為 MSCs 應用研究的關鍵。

目前常用于 MSCs 分離方法有密度梯度離心法[10-11]、貼壁篩選法[12]、免疫磁珠法[13]、流式細胞儀分離法[14]及 Hung 等[15]研究的特制微孔培養板篩選法。采用全骨髓貼壁篩選法，將抽取的骨髓直接置于培養瓶中培養，利用骨髓間充質干細胞貼壁生長的特性分離細胞，幾天后換液觀察細胞貼壁情況，這種保留造血干細胞和各種細胞混合培養的方法，由于維持了 MSCs 原始的生活環境，有利于 MSCs 分化，但所得細胞成分復雜， MSCs 純度不足。單克隆抗體磁珠分離系統或流式細胞儀技術對細胞活性影響較大，甚至導致細胞完全失去活性，而且實驗操作復雜，需要骨髓量大，不易重復，造價較高，一般僅限于在大實驗室應用[16]。特制微孔培養板篩選法，可以快速有效分離得到相對同質的 MSCs，利用這種方法可以不用 Percoll 液去除紅細胞[17]，但是結果不穩定，特定原料不易大量獲取。密度梯度離心法即根據骨髓中細胞成分比重的不同，利用Percoll 或淋巴細胞分離液提取單核細胞進行貼壁培養。操作上較貼壁細胞分離法煩瑣，得到的細胞數不如后者多，但細胞純度較后者高。本實驗結合密度梯度離心法和貼壁篩選法，利用密度為 1.077 g/L 的 Ficoll 分離液，能有效去除絕大部分紅細胞、粒細胞、脂肪細胞和血小板，獲得純度較高的單個核細胞。然后利用 MSCs 的貼壁性，逐漸棄掉未貼壁細胞，從而獲得足量的 MSCs。

在培養過程中，我們還注意到以下幾個環節：①與蔣雯等[18]不同，本實驗研究發現，兔 MSCs 原代培養首次換液的時間宜在 4~6 d，過早換液將丟失過多尚未貼壁細胞，因在實驗過程中，第 3 天首次換液后，收集舊培養液離心洗滌，再接種仍有細胞大量生長；且原代細胞在培養 14 d~21 d 左右才能達到80% 以上的融合，才能進行傳代培養，這可能與我們用的培養基加的胎牛血清濃度不同，蔣雯等用的是 20% 的血清，而我們用的是 10% 的胎牛血清；②培養基中胎牛血清濃度保持在 10% 左右為宜，過低由于缺乏生長因子的刺激，細胞增殖減慢，而過高又因含大量促進細胞生長增殖分化的因子，易引起細胞過早出現老化；③兔 MSCs 原代接種貼壁不良時，可予膠原[19]包被培養瓶，增加細胞的貼壁率；④胰蛋白酶消化細胞時，可先將 PBS 潤洗培養瓶 2 次，去除殘留血清，更易將貼壁細胞消化下來，且消化時間縮短，不會造成消化時間過長對細胞的損傷；⑤細胞傳代時，應注意接種密度，宜按 1:2 比例傳代接種，如此細胞才能保持良好的增長趨勢，不會因接種密度過稀致增長緩慢且易老化。

目前 MSCs 在生物醫學領域有著廣泛的應用，然而 MSCs 表面標志由于細胞分離、培養方法和培養時間等的不同而有差異。Pittenger 等[20]認為人MSCs 陽性表面標志是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，陰性表面標志是 CD45、CD34 和 CD14 等造血細胞標志。Hung 等[21]采用帶 3 m 孔培養板的裝置培養分離得到人 MSC，培養至第 2 代末時陽性表面標志是 CD90、CD44、CD29、CD51，陰性表面標志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者們應用不同的分離擴增方法及不同的方式表達細胞特性，使得對一些研究結果的比較變得困難，阻礙了其在這些領域的應用[22]。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定義了 MSCs 的最低標準： 首先，MSCs 在標準培養條件下必須具備貼壁生長的特點；其次，MSCs 表達 CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表達陰性；第三，MSC 在體外能分化為格根包爾氏細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞[23]。本實驗選擇第 3 代細胞行流式細胞儀檢測表面抗原顯示，陽性表達黏附分子、整合素家族成員等如細胞表面抗原 CD29、CD44、CD105 陽性細胞數占 99.8%，而造血細胞表面標志陰性或極少表達即 CD34 陽性率只有 0.8%，上述結果表明：獲得的細胞為非造血類的、符合骨髓間充質干細胞的特點，與文獻資料吻合[12，24]。

通過對兔MSCs 培養方法和表面標識物的進一步研究，本研究建立了一套穩定分離、培養擴增骨髓間充質干細胞的方法，獲得足量純化的 MSCs 并進而研究其作為種子細胞治療多種疾病提供了實驗基礎。隨著基因工程和組織工程的發展，骨髓 MSCs 也將在細胞治療、基因治療等方面得到廣泛應用。本研究設計的缺陷在于，這只是細胞培養的一個初步研究，下一步若對細胞周期及細胞活力進行檢測，將對選擇最合適代數細胞作為種子細胞的應用提供更有價值的信息。

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篇8

【關鍵詞】 異體移植

摘 要：［目的］研究神經長度是否影響化學去細胞神經的質量及化學去細胞異體神經修復犬神經缺損的適當長度范圍。［方法］切取犬的坐骨神經全長，截取直徑近似段長度12 cm，去除神經外膜的脂肪組織及血管，在50％Triton X100和50％脫氧膽酸鈉中重復消化得到化學去細胞神經；部分神經用于組織學評價，將12 cm神經按順序切割為6段，石蠟包埋制備切片，厚度5 μm。HE染色和Fastblue染色，觀察去細胞程度、神經細胞外基質結構完整性、髓鞘染色強度，觀察每段神經的差異。在體內實驗中，用化學去細胞異體神經橋接犬的坐骨神經缺損，缺損長度分別為8、10 cm組，每組各有6條成年犬，隨訪時間12個月。觀察動物肢體功能恢復、肌電圖變化及再生神經組織學表現，包括HE染色、S100免疫組織化學染色、乙酰膽堿酯酶染色。［結果］去細胞神經全長各段在去細胞程度、結構完整性及殘余髓鞘染色綜合評價中無差異。體內移植實驗結果顯示8 cm去細胞異體神經移植組的犬在術后12個月踝關節可直立行走，而10 cm去細胞異體神經移植組犬12個月時踝關節不能直立行走。肌電圖檢查結果顯示，兩組動物的手術肢體均可記錄到誘發的運動和感覺電位。肌電圖波幅、時限及運動神經傳導速度結果顯示，8 cm移植組明顯高于10 cm移植組(P

關鍵詞：去細胞神經； 異體移植； 再生

Abstract：［Objective］The purpose of this paper is to demonstrate whether the nerve length could affect the quality of acellular nerve and investigate the properly repairable distance of nerve defects with acellular nerve allografts. ［Method］Fresh sciatic nerves were obtained from adult dogs and pided into 12 cm long segments. The nerve segments were decellularized via an improved chemical decelluarization treatment as following: Nerve segments were rinsed with cold sterile Ringer's solution and submergedin 5% Triton100 solution 12h ，and then soaked the nerve segments into 5% sodium deoxycholate for 12h. The treated nerve segments were washed in distilled water for 3h. This procedures were repeated once again. In vitro， the degrees of decellularization ， demyelination and integrity of nerve fiber tubal of chemically extracted acellular nerves were observed with microscope and assessed by a score system. In vivo，the sciatic nerve of dogs on the right was exposed.In 8 cm grafted group (n=6)，a 7 cm segment of sciatic nerve was removed from the midthigh level. In 10 cm grafted group (n=6) ， a 9 cm segment of sciatic nerve was removed at the same level. The gaps were bridged with acellular nerve allografts by 8 cm and 10　cm long segments respectively. The followup period was 12 month postoperatively. Motor functional recovery of the right hind following allografting was examined by neurobehavioral， electrophysiological， histological and immunohistochemical assessment. ［Result］There was no difference on the degrees of decellularization， demyelination and integrity of nerve fiber tubal among every fraction of the acellular nerve from the two ends to the central portion. In 8 cm grafted group ， all survival dogs(n=5) were held upright with the affected hindlimb extended so that the body's weight was supported by the distal metatarsus and toes. In 10 cm grafted group， animals were failed to held upright with the affected hindlimb. Electrophysiological studies showed that elctromyographic activity was observed in both groups.After 12 month the conduction velocity was 321+51 m/s in 8 cm grafted animals and 183+6.0m/s in 10 cm grafted group. In normal animals， the conduction velocity was 1066+164 m/s. The conduction velocity in 10 cm grafted group was lower than 8 cm grafted(P

Key words: Acellular nerve; Allograft; Regeneration

創傷、理化因素及腫瘤等原因可導致周圍神經的損傷，造成長距離的神經缺損。為恢復肢體的神經支配通常需要應用移植物橋接神經缺損。該類移植物的功能是引導神經纖維通過缺損區并長入支配的器官和組織。由于新鮮異體神經移植的免疫學反應，在臨床實踐中自體神經移植一直被認為是“金標準手術”。但是由于切取自體神經帶來的諸多并發癥及供區所限，自體神經替代物修復神經缺損成為研究的重點。人工合成的替代物主要是由具有良好生物相容性和生物可降解材料制備，如PLA(polylacticacid)［1，2］，PLGA［poly(lacticcoglycolic)］［3］等。合成材料雖然可避免切取自體神經的并發癥及異體神經的免疫反應，但在內部結構上不具備天然神經細胞外基質的三維空間結構，而這種結構對引導神經軸突的生長至關重要。異體神經的MHC(major histocompatibility complex)主要存在于神經的雪旺細胞和髓鞘成份中，近期研究顯示經化學處理的去細胞異體神經可有效降低移植后的免疫反應并促進神經軸突向遠端生長［4，5］，從而修復周圍神經的節段性缺損。因此，化學去細胞異體神經已成為一種具有應用前景的自體神經替代物，并對其神經移植物的保存方法進行了研究［6］。然而，在實驗研究中，對下述兩個問題尚未進行深入研究：(1)較長節段神經的化學去細胞處理是否會造成神經斷端與神經中段質量的差異；(2)在大型動物神經缺損修復中有效的長度范圍為多少。上述問題的研究對制備較長的去細胞神經移植物和選擇修復神經缺損的長度具有重要意義。

1 材料與方法

11 儀器及試劑

Medtronic Keypoint肌電圖儀(丹麥)，恒溫振蕩器(回旋式，上海)，Triton X100(Sigma，美國)，脫氧膽酸鈉(Sigma，美國) 。

12 犬化學去細胞神經的制備

已行鈷―鉻―鉬人工假體體內植入實驗并準備取材的實驗犬6條，體重在24～26 kg，用速眠新100 mg肌注后全麻安樂死，取雙側全長的坐骨神經干，每條坐骨神經長約12 cm。將切取的全長犬坐骨神經標記遠近端后，按下述順序進行化學處理：(1)蒸餾水浸浴12 h；(2)50％Triton X100消化12 h;(3)蒸餾水浸浴3h；(4)50％脫氧膽酸鈉消化12 h；(5)重復前述步驟；(6)蒸餾水浸浴3 h；(7)萃取神經在4℃、 pH 72無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)暫時保存；(8)將處理好的去細胞神經組織和Hank’s液一起用雙層無毒塑料袋進行分裝，在250 KGy的γ射線下進行輻照滅菌，放置在4℃冰箱中備用。

13 去細胞神經的組織學評價

去細胞處理后的神經組織，將每一神經段按等比例分為6小段，每小段長為20 mm，石蠟包埋，做5 μm厚橫向和縱向組織學切片，進行HE染色觀察去細胞程度及纖維管道結構完整性、Fast blue染色觀察髓鞘成分。按照表1的標準進行去細胞神經的質量評價。每段隨機取3張切片進行觀察，取其均值單項計分。

14 去細胞異體神經移植試驗

健康雜種犬12只，雌雄不分，體重243～266 kg，隨機分成2組，8 cm移植組和10 cm移植組，每組 6只。用25％戊巴比妥鈉(10 mg／kg體重)靜脈注射進行麻醉。在無菌條件下右股后切口顯露坐骨神經干。在坐骨神經干中段分別銳性切除7、9 cm長的神經節段，自然回縮造成8、10 cm長的神經缺損。分別用8、10 cm長的化學去細胞同種異體神經進行移植橋接神經缺損，用8-0無創尼龍線行神經外膜縫合，環形縫合6針。術后分籠飼養，觀察期12個月。

15 體內移植實驗觀察

151 一般觀察 觀察移植后切口愈合及肢體功能恢復。

152 神經電生理觀察 用丹麥產Medtronic Keypoint便攜式肌電圖儀進行運動和感覺誘發電位的檢測。隨機選取左側非手術側肢體5例作為正常值對照。在全麻下手術切開顯露待測神經。

在進行運動誘發電位檢查時，將刺激電極放置在移植段神經近側2 cm的正常神經上，記錄電極放置在小腿三頭肌上，通過給予相同劑量的方波刺激比較兩組實驗動物在運動誘發電位波幅和時限上的區別。左側肢體電極放置在相應位置，刺激參數為：10～20 mA，01 ms，10 Hz。

在進行感覺誘發電位觀察時，刺激電極放置在踝關節部的脛神經上，記錄電極放置在移植段近側的正常神經上。刺激參數為50～100 mA，02 ms，19 Hz。

運動神經傳導速度檢查時，在移植側，近端刺激電極位于移植段近端吻合口近側2 cm處，遠端記錄電極位于移植段遠端吻合口遠側2 cm處，兩實驗組距離分別為12、14 cm。在對照側，兩點位于與右側相應部位的坐骨神經干上，間距10 cm。刺激參數為10～20 mA，02 ms，10 Hz，肌電圖儀自動記錄并計算運動傳導速度。

153 再生神經的組織學觀察 在過量麻醉藥物的作用下處死實驗犬并即刻觀察取材。對實驗組全部動物的移植段神經的近側吻接口、移植段中央、遠側吻接口、移植段遠側神經和神經支配區域的靶肌肉進行神經再生的組織學觀察。

1531 HE染色 將切取的移植神經及兩端各1 cm正常神經取出后浸于4％多聚甲醛水溶液中固定24 h，經脫水處理后分段用石蠟進行包埋，連續組織學切片，切片厚度為5 μm，蘇木素-伊紅染色后觀察組織結構形態，再生神經纖維和細胞浸潤情況。

1532 S-100免疫組化染色 標本為石蠟包埋，切片厚度5 μm。Ⅰ抗為兔抗S-100蛋白抗體，Ⅱ抗為生物素標記的羊抗兔IgG抗體。用于觀察再生神經中的許旺細胞的分布情況，特別是移植段神經中許旺細胞的分布。

1533 美藍復紅染色 在移植段中央和移植段遠側的神經中各取2 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊用05％戊二醛固定24 h，樹脂包埋后用于半薄切片美藍復紅染色，切片厚度2 μm，染色后觀察有髓神經纖維。

1534 透射電鏡觀察 將經05％戊二醛固定后樹脂包埋的神經組織行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。在SEM透射電鏡下觀察再生神經的超微結構。

1535 靶肌肉運動終板染色 在脛神經進入小腿三頭肌肌腹部位切取3 mm厚的肌肉塊，在含1％氯化鈣的 10％福爾馬林水溶液中固定24 h，取出后放置在蔗糖-凝膠溶液中，行冰凍切片，切片厚度為30 μm。用膽堿酯酶法進行運動終板染色，觀察靶肌肉中再生的運動終板的形態。每張切片隨意選3個視野計數運動終板數量，取其平均數。

16 統計學分析

用SPSS 115統計分析軟件進行數據處理，組間對比用成對資料的t檢驗，P

2 結 果

21 去細胞神經各段間組織學觀察結果

神經全長從近端到遠端去細胞完全，評分均為0分；在結構觀察中，除第2段為0分外，其余5段均為1分，存在輕度的結構破壞：觀察髓鞘染色強度，神經全長均為1分，仍殘留少部分髓鞘成分。綜合評分第1段為2分，第2段1分，第3段到第6段均為2分，神經全長各段經去細胞處理后綜合評分相似（見表1）。 表1 化學去細胞神經評分標準

22 移植動物一般情況和功能觀察

8 cm組有1犬在移植后3個月并發肺部感染死亡。10 cm組有1犬在4個半月腹瀉死亡。其余動物均存活至觀察期滿。 在8 cm組實驗犬在移植術后3個月時均有不同程度運動功能的恢復，至6個月時恢復了較好的行走功能，但是外觀上仍有輕微的跛行，12個月時在行走過程中踝關節可以完全直立和有較好的背屈。10 cm組在6個月時也有不同程度的下肢功能恢復，但是進展較慢，移植后12個月踝關節仍不能直立或爪背著地。

23 神經電生理觀察

在移植段近側的正常神經上給予電刺激時，8 cm組和10 cm組均在小腿三頭肌上記錄到誘發的運動神經傳導電位。如表2所示移植術后12個月記錄到的運動誘發電位時限和波幅的區別，8 cm組的波幅高于10 cm組(t=3286，P

24 再生神經組織學觀察

大體上觀察，8 cm組在局部切開檢查時，移植段神經與周圍組織有輕微的短縮，可見移植段神經有良好的連續性，無明顯變細變硬。神經與周圍組織有少量的粘連，再血管化良好。近側和遠側吻接口無神經瘤形成。神經支配區的肌肉組織有輕度萎縮。10 cm組在切開檢查時，可見移植段神經的遠側段明顯變細變硬，但是仍然保持連續性，神經與周圍組織有粘連，神經支配區肌肉萎縮明顯。 表2 去細胞異體神經移植術后12個月肌電圖結果光鏡下，在兩組移植段神經內均有S-100表達陽性的雪旺細胞，沿神經纖維方向呈帶狀排列(圖1)，8 cm組的數量多于10 cm組。移植段以遠的神經內亦可見到雪旺細胞增殖成帶，神經橫切面顯示有再生的神經纖維，8 cm組優于10 cm組，在10 cm組可見較多神經束呈脫髓鞘改變。

運動終板染色顯示在神經支配區的小腿三頭肌中可以見到重新形成的運動終板結構，兩組實驗犬在運動終板數量上有較明顯的差別，8 cm組再生的運動終板數量多于10 cm組，終板的形態也優于10 cm組(圖2)。每個高倍視野下的運動終板的數量在8 cm組明顯多于10 cm組，有顯著統計學差異(P10 cm組。但是兩組終板和正常的終板結構相比不管是在終板的數量還是在終板的縱橫徑上均有差別(P

電鏡下8 cm組移植段神經內可見由雪旺細胞形成的髓鞘和有髓神經纖維，同時可見大量的無髓神經纖維呈束狀分布(圖3)；10 cm組移植段神經內也有少量有髓神經纖維形成。表3 去細胞異體神經移植術后小腿三頭肌運動終板測量

3 討 論

在異體神經移植的研究中，雖然經凍融處理、放射處理和化學處理后的異體神經均具有促進神經再生的功能，但由于凍融處理及放射處理的神經細胞碎片仍殘存在神經的基底板層管內，妨礙神經軸突向遠端的延伸，因此修復神經缺損的距離一般較短。而化學處理后的異體神經在降低免疫原性的同時，保留了神經纖維管道的結構完整性，其內部細胞碎片已被清除，去除了軸突生長的障礙，因此可用于修復較長距離的神經缺損。但在化學去細胞處理過程中，當為修復較長距離的神經缺損而處理較長神經段時，神經的兩端與中央部位是否存在質量差異，對修復神經缺損有較大的影響。化學浸提液是從神經的兩端還是透過神經外膜對神經進行去細胞處理存在爭議。實驗中從去細胞程度、髓鞘提取的程度及神經纖維管道的完整程度進行評價。結果顯示在長12 cm的神經段中，經化學去細胞處理后，神經的中央部分與兩端的各段間在上述三個方面的綜合評價中無差異，說明對同等粗細的神經其長度并不影響其神經移植物的質量，由此可以推斷化學浸提液并非從神經的兩端而是從神經的外膜開始進行去細胞處理。故在用相同的浸提液及處理程序進行去細胞處理時，神經的長度對神經移植物質量無影響。

雖然在理論上可以應用化學去細胞的方法處理任意長度的神經，但在實驗及臨床應用中移植長度仍然影響肢體功能康復的結果。在早期的研究中應用化學去細胞異體神經較滿意修復了犬5 cm長的坐骨神經缺損［7］。在應用相同方法處理的犬的化學去細胞異體神經移植實驗中，對犬的8、10 cm 長的坐骨神經缺損用化學去細胞同種異體神經進行移植修復。結果發現在8 cm長的坐骨神經缺損修復組，無論是肢體功能的大體觀察還是電生理的觀察，均恢復較好。運動神經的波幅已達正常神經的50％，神經傳導速度達到正常神經的30％；而在10 cm長的神經移植組，功能恢復較差，肌電圖波幅及運動神經傳導速度均未達到正常神經的20％。再生神經的組織學觀察顯示8 cm長的去細胞神經移植組在雪旺細胞、有髓神經纖維的分布及運動終板的數量和形態方面均明顯優于10 cm移植組。

在8、10 cm神經移植組，其移植物本身的質量無差異，但最終結果具有明顯的差異。產生這種差異的原因不在移植物本身，而與神經缺損的距離有關。Haase等［8］用去細胞異體神經橋接大鼠腓神經缺損，研究顯示去細胞異體神經可以修復2 cm的周圍神經缺損，當缺損>4 cm時未出現功能恢復，并認為生長因子可能有助于修復較長的神經缺損。但在隨后的實驗中應用血管內皮生長因子與去細胞異體神經復合后移植修復神經缺損，僅表現出促進近端吻合口軸突的生長，并未顯出促使神經軸突延長的作用［9］。出現這種現象的原因可能是生長因子雖有促神經再生的作用，但在修復區內未能呈現生理環境下的濃度梯度變化，故軸突的生長方向受到干擾。在周圍神經損傷后，靶器官通過神經遠端釋放不同的生物因子，發揮化學趨化作用，促使神經軸突向遠端生長。生物因子的濃度呈現明顯的梯度改變趨勢，隨距離的增加，生物因子的濃度發生明顯的變化，從而影響神經的再生速度及肢體功能康復。因此，在使用生長因子促使神經向遠端生長時應考慮其作用環節及濃度梯度變化。

本研究證實神經的長度并不影響化學去細胞神經制備的質量，在應用去細胞異體神經修復周圍神經缺損中，8 cm或許是目前單獨使用化學去細胞異體神經移植取得較好結果的最大范圍。為修復更大范圍的神經缺損，應探討神經遠端的生物因子表達分布規律，利用化學趨化原理促進神經的快速生長。

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【關鍵詞】醫學細胞生物學 教學改革

【中圖分類號】G642 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-4810（2015）23-0067-02

隨著細胞結構及功能的相關知識和理論在醫學領域中應用的不斷深入，細胞生物學已成為現代醫學的重要基礎，在醫學教育中占有重要的地位。對于現代醫科學生來說，具備細胞生物學的相關基礎知識和基本技能，是進一步學習其他醫學課程必不可少的條件。2011年以來，我校執行新版教學計劃，其中對蒙醫專業、臨床和護理專業的醫學細胞生物學課時改革，學校教研室對其教學內容的安排和教學方法的施用也進行了相應的改革，旨在進一步提高和完善教學質量和效果。

一 我校醫學細胞生物學發展歷程

1978年，哲里木醫學院生物教研室成立，在臨床醫學專業開設了醫學生物學課程，本、專科分別為72、54學時，先后由校內一些教師任教。在當時的醫學生物學課程中，已用相當的篇幅向學生介紹了醫學細胞生物學知識。1992年，蒙醫學院將臨床醫學專業的醫用生物學課程一分為二，南×老師開設醫學細胞生物學，理論課30學時，實驗課18學時。2000年，內蒙古民族師范學院、內蒙古蒙醫學院和哲里木盟畜牧學院三校合并成立內蒙古民族大學后，教學條件得到了顯著改善。2011年，學校各學院執行新版本科生培養計劃，蒙醫藥學院蒙醫專業、醫學院臨床和護理專業醫學細胞生物學課時壓縮（僅24學時）。

二 優化醫學細胞生物學教學大綱

教學大綱作為重要的指導性文件，是課程教學的基本依據和教學質量的基本保證。大綱中的教學內容與學時分配是對一門課程教學的基本內容所做的基本規定，是教學大綱的核心部分。在教學大綱的制定過程中，我們既要注重醫學專業目標培養的需要，還要考慮與其他醫學基礎課程的前后鏈接，對于已學課程、將開課程和正在進行中的課程的教學內容，要深入了解分析，注意知識之間的銜接，避免遺漏與重復，最大程度地保證教學質量的不斷提高。

蒙醫學專業，過去曾開設“醫學生物學”，該課程中涵蓋了部分細胞生物學知識，后來取消了這門課程，這樣在醫學細胞生物學教學內容安排時增加了相應內容，并作深入講解。如在醫學生物學中第二章《細胞膜及其表面》的教學內容擬定過程中，細胞膜的化學組成、細胞膜的分子結構和細胞膜的特性三部分內容加到醫學細胞生物學中。2011年，執行新版教學計劃，蒙醫、臨床醫學和護理學專業，學時由原來的30減為24學時，由于課程壓縮，醫學細胞生物學總課時數減少。我們知道每個專業培養計劃中所開設的每門課程相互之間聯系密切，醫學專業也不例外。如今醫學細胞生物學面臨著學時嚴重不足的現狀，所以，我們重新審視了這門課的教學大綱。甄別在醫學細胞生物學大綱中與其他課程重復的部分予以刪除，盡量使學生在有限時間內學習掌握醫學細胞生物學的精髓內容。近幾年，學校教研室通過類似的教學改革研究，更加合理地組織醫學細胞生物學教學內容，不但解決了課時少、內容多的矛盾，同時也使我們的教學活動有的放矢，學生也學有所獲。

三 結合多媒體教學手段，改進教學方法

當今很多課程都使用了多媒體輔助教學，在醫學細胞生物學教學當中，我們也將比較枯燥的純理論知識放在圖文聲像并茂的多媒體課件中，將微小的、看不見的細胞變為可視的，并營造了一種科學性、知識性、形象性融為一體的富有強烈感染力的教學情境，確實激起了醫學專業學生學習細胞生物學的興趣，調動了學生多種感官參與到細胞生物學的學習中，激發了學生學習細胞生物學的積極性。

多媒體課件的另一大特點（優點）是極大壓縮了傳統教學中教師板書及學生記筆記的時間。同時由于屏幕的快速投放，在短時間內播放大量的信息，提高了教學效率，并且解決了學時矛盾。這個優點也在其他很多課程中得到了驗證，我們也利用多媒體的這個優點，在教學中增加了細胞生物學的一些新知識、新進展、新技術，這樣既開闊了學生視野又擴展了知識面，這在應用多媒體手段之前是不可能實現的。因此，可以制作內容豐富的多媒體課件，改進教學手段，提高教學質量。

醫學細胞生物學這門課側重于從形態學的角度研究。在整個授課過程中，細胞的形態結構及功能機制的講授是細胞生物學中的重點及難點內容。多媒體輔助教學的第三個特點是可以進行大量相關圖片的演示。由于該課程的研究對象是細胞，一般肉眼是看不見的，更不用提細胞的超微結構。在課堂中無論一個教師是多么善于語言、肢體表達或是精致的繪畫，都難以表現或畫出一些抽象的細胞結構圖畫，而這些結構知識內容又恰恰是細胞生物的重點和難點。

多媒體教學的第四個優點就是過程再現等操作，不但可以演示細胞功能機制，還能重現，即一遍沒理解，能再播放一遍。例如，講授“細胞質膜的物質跨膜轉運”這一知識要點時，將細胞質膜上的鈉鉀泵轉運細胞內外的鈉離子和鉀離子，可以把這個過程做成動畫，并配以相應的講解，使書面理論變成看得見的動態圖像，能幫助學生更好更快地理解掌握這個知識內容。

傳統的課堂教學模式是以老師板書為中心進行的教學活動。如今多媒體輔助教學作為一種新的教學手段，具有一些傳統手段無可比擬的優越性。如圖文并茂的課件帶動學生興趣；有限的課堂時間匯聚大量知識；易突破重點并分散難點，而且在眾多其他課程中已得到了充分應用與認可。眾所周知，醫學是一門應用科學，作為21世紀的醫學人才必須具備醫術精、能力強等較高的素質，而創新能力就是高素質的人才所必需的，因此我們在教學活動中就必須更新教育觀念，改進教學方法。

四 建設具有民族特色的醫學細胞生物學教材

1.課程教材建設目標

教學內容的改革是提高課程教學質量的關鍵，教材建設是教學改革與課程建設的體現。發揚內蒙古民族大學細胞生物學教學的優良傳統，在保持原有體系的基礎上，充分利用校內民族特色資源，建設符合我校醫學專業的課程教材，使學生既能扎實掌握細胞生物學的基礎知識和基本理論，又具有較強應用知識的能力和探究創新意識，為后續的生物學課程的學習和高素質的生物、醫學科學人才的培養奠定堅實的基礎。

本課程在老一輩細胞生物學家的帶領下，曾編寫了《細胞與遺傳實驗指導》教科書，在使用過程中，收到了良好的評價。目前我校的醫學細胞生物學課程已構建了完整的教學建設體系，教材建設提上日程。

2.教材建設步驟

第一，整理分析已有的醫學細胞生物學教學教案，積極編寫適合我校不同學院專業的新的細胞生物學教材和細胞生物學實驗指導。第二，結合我校的民族特色，如蒙醫蒙藥研究，增設民族研究特色內容，對學生更具針對性，有的放矢。比如在細胞實驗中開設綜合性實驗蒙藥對肝臟的保護作用等。第三，聘請校內外的知名專家作教材編寫顧問，對教材編寫進行指導，進一步提高教材質量。加強與國內其他先進學校的細胞生物學精品課的教師（如北京大學、清華大學、內蒙古民族大學、四川大學、東北師范大學等知名大學）的聯系與交流，學習他們的經驗，進一步提高我們教學的水平。第四，結合多媒體授課手段，在教材編寫中，注重圖片與文字相結合，特別是重點難點內容，要多插入圖片，便于學生理解。

參考文獻

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【關鍵詞】　細胞生物學　實驗教學　科研素質

細胞生物學是生命科學中重要的組成部分，它能夠反映生命科學的形成進程，同時也體現生命科學的最新進展。該學科是由實驗研究產生和發展起來的。因此，細胞生物學研究技術和方法的作用及地位顯得尤為突出，細胞生物學實驗課教學是培養本科生科研素養的重要環節。是研究性學習的重要內容，也是最必要的形式和過程。

1.開設實驗課，是生命世紀所需。細胞生物學的發展經歷了經典細胞學、實驗細胞學及細胞生理學、現代細胞生物學等階段，推動學科理論內容的產生、發展及豐富的動力是實驗研究。例如：顯微鏡觀察方法導致了細胞學的產生，而電子顯微鏡及其它更精細觀察顯像技術的應用，可以觀察細胞內部的亞顯微結構、甚至單一生物分子的位置，更加準確描述細胞的結構與功能。

在大三開設細胞生物學實驗課是適時的。大三本科生經過動植物學的學習初步了解動植物細胞的一般特性：通過微生物學的學習，則了解微生物在細胞形態、結構及功能等方面的特殊性；生理學與生物化學的學習，掌握了細胞生命活動的動態性，并且有了相應的實驗技能。在此基礎上，本科生能夠適應較為復雜的細胞生物學實驗課的學習和操作。

細胞生物學實驗技術直接與當今生命科學的前沿技術接軌，在高年級開設這樣的課程，有助于本科生迅速進入畢業論文研究的狀態，有助于考研進入更深層次的研究工作。

2.選擇實驗課內容，注重基本能力和創新能力的培養。參考國內主要細胞生物學實驗教材，自編實驗教材，編寫過程中，注重介紹與某一個實驗項目相關的背景知識和實驗原理。例如：光學顯微鏡的使用是最基本的細胞生物學實驗，是從事生物學教學和科研必備的基本技能，在實驗教材中，作詳細介紹，列出不同放大倍數物鏡的鏡口率、工作距離、景深和視野直徑等參數，使學生明確“放大倍數小的物鏡工作距離大，放大倍數大的物鏡工作距離小，物鏡是顯微鏡中關鍵部件”等基本規律，有助于使用和選擇顯微鏡。

設計了染色體制備和分帶的內容，可以允許每個人動手操作，完成整個實驗程序，得到預處理、樣品制備、離心、顯微鏡使用等綜合技術的訓練。事實反映出操作認真、嚴謹的同學能獲得較理想的實驗結果。

選編了細胞培養、熒光顯微鏡技術等較高要求的實驗內容，并附編了相應的前沿技術，如激光共聚焦顯微鏡原理。這些都是從事細胞生物學科研工作所需的研究技術，該類實驗內容的開設，使學生初步了解細胞生物學研究的基本技術路線和實驗方法，使學生對實驗課的認識從完成操作、獲得學分過渡到科研綜合性、探索性，乃至創新性的高度。

詳盡描述實驗操作步驟，特別是不可忽視的、影響實驗成敗的關鍵細節，以及實驗試劑、藥品的配制和儀器實驗注意事項等內容。注意操作過程與實驗原理的結合，增加圖解。例如小鼠骨髓細胞染色體標本制備和C帶分析實驗，操作步驟多，影響因素多，相對成功率較低，學生興趣濃。操作程序的清晰、嚴格要求是完成實驗的重要保障。

設計具有啟發性的創新性實驗及實驗后思考題，以激發學生利用所學理論知識和實際動手經驗，熟悉怎樣設計實驗、組建哪些實驗技術達到實驗目的、哪些步驟是控制實驗的關鍵及其影響因素，甚至可提出修改的方案。

3.注重課前準備，確保實驗質量。教師持之以恒動手從事科研實驗工作，掌握或了解本學科研究技術的過去、現在及將來。堅持與實驗員設計、商討、準備實驗，要有預瞻性，掌握實驗中可能出現的問題，以便在課堂及時準確回答學生問題。

作為實驗教學的主體，學生的臨陣狀態也很重要。不少學生習慣于課前不預習，課堂上一邊對照實驗指導，一邊操作，經常導致操作混亂、時間延長甚至實驗失敗。目前，此類現象仍然較普遍，教師需注意檢查督促，進行關鍵性問題提問、請個別學生上臺操作示范，教師再對其中的注意事項、操作錯誤重點強調。另外，可將預習作為實驗成績的一部分，學生有備而來，提高實驗質量。

4.細致指導，重視基本技能訓練。細胞生物學實驗包括形態、結構觀察性實驗，也包括操作復雜、技術綜合的實驗，要求學生牢固地掌握基本實驗技能，如顯微鏡及特殊顯微鏡的熟練操作，微觀世界的確認，臨時與永久玻片制作，實驗動物解剖，生物繪圖方法，離心機的使用，細胞生物學染色體方法，細胞培養過程的無菌要求，這些基本技能都是每個學生必需的。教師必修逐個指導、示范和糾正，培養學生正確的規范的操作習慣。嚴謹的科學態度、創新的精神和嚴格的實驗習慣，是科研最基本的素養，而本科細胞生物學實驗是訓練的最好平臺。

5.誘導啟發，培養創造性思維。細胞生物學實驗項目廣泛，材料具有多樣性和普遍性，教師給學生安排的實驗是挑選了典型的材料和經典的實驗方法。教師應鼓勵學生在完成實驗指導指定實驗基礎上，提出衍生性的實驗題目，讓學生書面自行設計實驗(包括實驗材料、方法、目的)，有條件情況下，少部分同學進行創新性實驗。強調科研協作的重要性，鼓勵同學之間互相學習，有利于同學們開闊視野、培養敏捷的思維，激發對科學的求知欲和對本課程的興趣。