表觀遺傳學意義范文

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2表觀遺傳學概述每個細胞都具有全套基因，這全能性的基因如何表達出如此多樣性的細胞、組織 這一復雜有序表達調控過程被稱為表觀遺傳學[4]。基因的DNA序列只是一個模板 ，高等生 物的每個細胞必須通過表觀遺傳信息的調控，有序地指令其遺傳信息的開啟或關閉。使全能 性基因表達出多樣性細胞、組織。它不僅對基因的表達、調控、遺傳有重要作用，而且在腫 瘤、免疫包括高血壓等許多慢性疾病的發生和防治中，也具有十分重要是意義。表觀遺傳變 量則是聯系基因組、環境和疾病的重要環節。表觀遺傳學的分子機制包括DNA甲基化、組蛋 白修飾、染色質重塑和RNA干擾等，其中最重要的是DNA甲基化和通過組蛋白修飾的染色質重 塑。這些調控機制有二個特征：一是它們可以受后天環境影響，具有可獲得性；二是它們可 遺傳性。在“全基因組關聯研究（GWAS）”發現了一些血壓 、高血壓的遺傳易感位點，但這些位點對人群血壓水平影響很小（≤1mmHg）[2]，這 一現象在其它復雜性狀疾病GWAS研究中普遍存在，稱為：遺傳性缺失（missing heritabilit y）[5]。而重視表觀遺傳學的研究也是對類似高血壓這樣的復雜性狀疾病，呈現環 境和基因相關所致“遺傳性缺失”的揭示。

3表觀遺傳調控與線粒體代謝[6] 表觀遺傳學可提供環境與核DNA（nDNA）二者之間的相互關系。環境的關鍵要素是 對機體的能源給予可利用的熱量（calories）。通過細胞生物產能系統，經由糖酵介和線粒體 氧化磷酸化（OXPHOS）產生能量。有成千生物能源基因（Bioenergetic genes），彌散越過染色 質和線粒體DNA（mDNA），并需有mDNA順式（cis）和反式（trans）二者的調節。生物產能系統轉化 環境中的熱能為ATP，乙酰輔酶A，S_腺苷甲硫氨酸（SAM）以及還原性NAD+。當能源充沛時， AT P和乙酰輔酶A磷酸化和乙酰化染色質，開放nDNA轉錄和復制。當能源受限時，染色質的磷酸 化和乙酰化喪失，抑制基因表達。經由SAM使DNA甲基化，也可由線粒體功能所修飾。磷酸化 和乙酰化也是調節細胞信號傳遞的關鍵。所以，生物能源學提供環境與表觀遺傳二者相互作 用，最終組成表觀遺傳調控疾患的臨床表型（phenotype）。類似表觀遺傳疾病的有Angelma n，Rett，Fragile X綜合癥，和癌癥等，常伴有線粒體功能失調。“生物能源學-表觀遺傳學 ” 的假設，也可更廣泛適用于如高血壓、糖尿病等一般常見的由環境-基因相互作用的疾病， 用來探索其病因、病理生理和指導其治療。

4表觀遺傳與高血壓的發生

41DNA甲基化與原發性高血壓：高血壓的發生和發展與DNA甲基化密切相關。11β_類固 醇脫氫酶_2（11β_hydroxysteroid dehydrogenase_2 11β_HSD_2） 、內皮素轉換酶1（endothelin converting enzyme_1，ECE_1）和AT1b等基因發生甲基化和去 甲基化，會影響代謝酶和受體的表達；從而通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活，以及腎 性水鈉潴留等途徑引起高血壓的發生[7]。

411血管緊張素Ⅱ受體1型b（AT1b）：基因可通過甲基化調控，參與高血壓的發生和 發展。AT1b受體主要分布于腎上腺、垂體腎臟等部位，有實驗在妊娠期的小鼠，喂以低蛋白 飲食，其子代腎上腺AT1b受體基因啟動子發生顯著去甲基化，AT1b受體基因表達上調；引起 子代對血管緊張素的反應性升高，收縮壓、舒張壓均高于正常。表明AT1b受體的低甲基化（ 或去甲基化）可能是高血壓的潛在病因之一[8]。

41211β_HSD_2：11β_HSD_2活性減低，通過皮質醇作用，導致鹽皮質激素受體（mine ralcorticoireceptor MR）過表達，并且有腎臟鈉離子的潴留，低鉀血癥和鹽敏感性 高血壓。這種情況發生在糖皮質激素治療，導致11β_HSD_2基因啟動子高甲基化，活性降 低，同時伴有尿中THF（四氫皮質醇）/THE（四氫可的松）比率增高[9]。

413甲基化CpG結合蛋白增強自主神經反應性：甲基化CpG結合蛋白_2（MECP_2） 是MECP基因的產物。有報道[10]通過MECP_2致去甲腎上腺素轉運體基因沉默。去甲 腎上腺素轉運體是一種膜蛋白，通過此轉運體可將兒茶酚胺神經介質如去甲腎上腺素和多巴 胺轉運回突觸前（presynaptic）神經元而釋放。在腦力應激下，苯乙醇胺N_甲基轉移酶（PNM T）（將去甲腎上腺素轉換為腎上腺素，源于腎上腺髓質嗜酪細胞）釋放，如同DNA甲基化酶 ，具有MECP_2基因沉默作用；因而可以減少神經元再攝取去甲腎上腺素，而產生突觸與周 圍兒茶酚胺水平增加，自主神經系統反應增高，引起血壓升高和驚恐狀態。

414高同型半胱氨酸所致基因組DNA低甲基化與原發性高血壓：Kim等[11]對 同型半胱氨酸（Homocystine Hcy）和血壓水平調查，二者呈獨立正相關。具有高Hcy的高 血壓稱H型高血壓。對高Hcy引發的高血壓有多種解釋，而Hcy在機體內的功能是比較復雜的 ，機體內Hcy含量主要受遺傳和環境營養二種因素調控。環境營養因素主要指代謝輔助因 子：如葉酸，維生素B6、維生素B12等，如果葉酸、維生素B12不足，就會造成獲得性Hcy代 謝障 礙。維生素B12是5_甲基四氫葉酸轉甲基酶的輔酶，而5_甲基四氫葉酸是體內甲基的間接供 體，二者的缺乏使甲基不能轉移，阻礙甲硫氨酸的再生成，同時造成Hcy的蓄積。Hcy水平升 高時，肝臟中S_腺苷同型半胱氨酸（SAH）水平升高；而甲基供體S_腺苷甲硫氨酸（SAM）下降， 導致DNA低甲基化[12]。由高Hcy和高SAH水平所致的基因組低甲基化，容易誘發AT1 b，ECE_1等基因去甲基化，使這些受體和代謝酶基因表達上調，并通過RAS激活和腎性水鈉 潴留等途徑引起高血壓的發生。由此可見不同細胞類型有特殊甲基化模式，反映它們的多樣性和特殊性。甲基化模式遺傳（M ethylation Pattern Inheritance）可以經過一代至另一代，相應于環境對細胞的發展和功 能的改變。

42組蛋白乙酰化與高血壓：染色質的基本單位為核小體，后者是由四種組蛋白（H2A，H 2B，H3，H4）各二個分子構成的八聚體核心，N端尾部為單一的H1。組蛋白乙酰化與基 因活化和DNA復制相關，組蛋白的去乙酰化和基因失活相關。有報道[13]在用C172 NSC系列細胞給予生理劑量褪黑激素（Melatonin MLT）24h 后，顯示組蛋白H3乙酰化增加，軸突樣伸展，和標志神經干細胞nestin mRNA表達增加；M LT也對不同的其它組蛋白乙酰轉移酶亞型表達增加。MLT對富含MLT受體最后區（area postrm a AP）神經元的調控，提供輸出至嘴側延髓腹外側區（Rostral Ventrolateral Medulla RVML ）血管運動中樞興奮增加。RVML是腦干交感性輸出至血管的主要調節者。因而當RVML功能失 調時，也是人類原發性高血壓發生的一種重要機制[14]。

43SiRNA對NADPH氧化酶、氧化應激和RAS（腎素-血管緊張素）的升壓抑制作用：20世紀 90年現了小干擾RNA（SiRNA），RNA已成為重要的遺傳學信息的決定者和調控基因的表達 。RNA干擾（RNAi）是由雙鏈RNA（dSRNA）使靶基因的mRNA降介或阻止其翻譯，最終導致特異性 靶基因表達阻斷。SiRNA通常來源于mRNA、轉座子、病毒或異染色質DNA。經過Dicer酶切割 形成長20～25bp的小片段，并與靶基因mRNA互補鏈結合，產生轉錄后基因沉默（PTGS）。對于 SiRNA已成為近年來在腫瘤及一些復雜性狀的慢性疾患研究的熱點[15]。有報道 [16]用SiRNA靶向p22phox（sip22phox），使其RNA沉默，抑制NADPH氧化酶_AngⅡ 誘導的 平滑肌細胞收縮反應。RNA沉默，減輕NADPH氧化酶活性和產生氧化應激；并在清醒小鼠給予 AngⅡ的第二周顯示減輕其進行性的升壓反應。

5展望近年來表觀遺傳調控高血壓、血管重構，以及有關高血壓的并發癥等，有較多的報道[ 17，18]。成為推動闡明高血壓這樣一種遺傳和環境因素相互作用所導致的復雜性狀的疾 病，拓展了新的領域，并引起極大的關注。然而，表觀遺傳領域的最大難題是清理出致病徑 路[19]。例如，表觀遺傳的DNA修飾能引起疾病，而有些致病因素又能誘發DNA修 飾，或染色體的重構。已知有些表觀遺傳修飾是后天獲得的，有些是遺傳的；但它不同于單 基因遺傳所致的特殊類型的高血壓，可以經過傳代后發生血壓升高，也可以逆轉。要系統地清理表觀遺傳調控高血壓的徑路及其發病機制，還需做大量工件。目前表觀遺傳學 對腫瘤的研究最為活躍，有些已轉化為臨床應用，取得了可喜的成果。表觀遺傳被假設為環 境與基因表達二者之間的調節者；而環境對機體最重要的因素是熱量的利用以及其調控機制 ；其次是隨齡的氧化損傷。這二者與線粒體的代謝密切相關。因此，在清理表觀遺傳致病徑 路，將表觀遺傳調控與線粒體代謝二者結合探討，可能更有利于闡明如高血壓這類復雜性狀 的疾病。表觀遺傳學在高血壓發生中的作用，及其在某種程度上的可逆性，這就為高血壓的防治提供 了新的靶點，為個體化藥物治療提供依據。更重要的是能確立高血壓是多基因和環境因素參 與的一種復雜性狀的病癥的概念，將高血壓的防治前移[20]，倡導更合理、健康、 優化的營養和生存環境。

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關鍵詞：表觀遺傳學；染色體失活；DNA甲基化；組蛋白修飾；基因組印記

遺傳學是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛星不穩定等；而表觀遺傳學則是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質構象變化等；表觀基因組學則是在基因組水平上對表觀遺傳學改變的研究。

通俗的講，表觀遺傳學是研究在沒有細胞核DNA序列改變的情況時，基因功能的可逆的、可遺傳的改變。也指生物發育過程中包含的程序的研究。在這兩種情況下，研究的對象都包括在DNA序列中未包含的基因調控信息如何傳遞到（細胞或生物體的）下一代這個問題。在分子水平上，表觀遺傳學解釋了DNA序列所不能解釋的諸多奇怪的現象。如：同一等位基因可因親源性別不同而產生不同的基因印記疾病，疾病嚴重程度也可因親源性別而異。表觀遺傳的現象很多，主要包括：染色體失活、DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印記等。

1 染色體失活

在哺乳動物中，雌雄性個體X 染色體的數目不同，這類動物需要以一種方式來解決X 染色體劑量的差異。在雌性哺乳動物中，兩條X 染色體有一個是失活的，稱為X染色體的劑量補償。人類存在相同的現象，女性有兩條X染色體，而男性只有一條X染色體，為了保持平衡，女性的一條X染色體被永久失活。X染色體失活的選擇和起始發生在胚胎發育的早期，這個過程被X 失活中心(X - inactivation center) 所控制。這個失活中心存在著X染色體失活特異性轉錄基因Xist (X - inactive - specifictranscript) ，當失活的命令下達時，這個基因就會產生一個17 kb 不翻譯的RNA 與X 染色體結合，引發失活。Xist基因編碼Xist RNA，Xist RNA包裹在合成它的X染色體上，引發X染色體失活；隨著Xist RNA在X染色體上的擴展，DNA甲基化和組蛋白的修飾馬上發生，這對X染色體失活的建立和維持有重要的作用。X 染色體失活是表觀遺傳學最典型的例子，它可以通過有絲分裂或減數分裂遺傳給后代。人們可以通過了解染色體失活的原理來解釋遺傳規律。

2 DNA 甲基化

所謂DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結合一個甲基基團。它是基因組DNA 的一種主要表觀遺傳修飾形式，是調節基因組功能的重要手段。CpG常成簇存在，人們將基因組中富含CpG的一段DNA 稱為CpG島，通常長度在1～2 kb 左右。人類基因組中大小為100～1 000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG島總是處于未甲基化狀態，并且與56%的人類基因組編碼基因相關。CpG島常位于轉錄調控區附近，在DNA 甲基化過程中胞嘧啶突出于DNA 雙螺旋并進入與胞嘧啶甲基轉移酶結合部位的裂隙中，該酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 的甲基轉移到胞嘧啶的5′位，形成5 - 甲基胞嘧啶。由于DNA甲基化與人類發育和腫瘤疾病的密切關系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉錄失活問題，DNA甲基化已經成為表觀遺傳學和表觀基因組學的重要研究內容。體內甲基化狀態有3種：持續的低甲基化狀態、誘導的去甲基化狀態和高度甲基化狀態。DNA 甲基化主要是通過DNA 甲基轉移酶家族來催化。DNA 甲基轉移酶分兩種：維持甲基化酶和重新甲基化酶。在細胞分化的過程中，基因的甲基化狀態將遺傳給后代細胞。但在哺乳動物的生殖細胞發育時期和植入前胚胎期，其基因組范圍內的甲基化模式通過大規模的去甲基化和接下來的再甲基化過程發生重編程，從而產生具有發育潛能的細胞。

3 組蛋白修飾

組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，是一類小分子堿性蛋白質。組蛋白有兩個活性末端：羧基端和氨基端。染色體的多級折疊過程中，需要DNA 同組蛋白結合在一起。這種常見的組蛋白外在修飾作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP 核糖基化、羰基化等，它們都是組蛋白密碼的基本元素。與DNA 密碼不同的是，組蛋白密碼和它的解碼機制在動物、植物和真菌類中是不同的。我們從植物細胞保留有發育成整個植株的全能性和去分化的特性中，就可以看出它們在建立和保持表觀遺傳信息方面與動物是不同的。乙酰化修飾大多在組蛋白H3 的Lys9 、14 、18 、23 和H4 的Lys5 、8、12 、16 等位點。甲基化修飾主要在組蛋白H3 和H4 的賴氨酸和精氨酸兩類殘基上。研究也顯示，在進化過程中組蛋白甲基化和DNA甲基化兩者在機能上被聯系在一起。在引起基因沉默的過程中，沉默信號(DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重新裝配)是如何進行的目前仍處于研究階段。當DNA量增加時，阻抑作用可消除，轉錄便開始進行。這說明組蛋白的阻抑作用不是抑制RNA聚合酶，而是組蛋白與DNA相結合后，將DNA束縛住使其不能轉錄。

4 基因組印記

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【關鍵詞】 目標教學法；初中數學；課堂教學

每一節課都必須有教學目標，在設計教案的時候最初就應該明確一節課的教學目標. 教學中各個環節和內容的設計都應該是圍繞著教學目標而進行的. 教學目標是整堂課的出發點，也是課堂的最終歸宿點. 有了明確的目標才能更好地保障每節課的課堂效率，讓學生們在目標的指引下，真正掌握一節課所要掌握的內容. 現在我將結合自身的教學實踐，談談在教學的過程中，如何去落實讓目標貫穿課堂的每一個環節.

一、明確教學目標，體現出對教學過程的引導

制定教學目標是設計一堂課的開始，教學目標的制定關系著一節課的課堂效率. 總的來說，教學目標的制定要盡量的具體詳細. 這樣不但可以更加具體地體現一節課的目標，教師在備課的時候也可以根據教學目標來安排更加適當的教學內容. 如果教學目標太籠統，教師則比較難很難組織教學內容，并且要判斷學生們是否已經掌握所要學習的內容，是否達成了學習目標也比較難有具體的判斷依據. 因此，在制定教學目標的時候，要盡量詳細具體.

比如，在學習七年級的數軸這一節課時，大部分老師給的教學目標就是：一、能根據構成數軸的三個要素正確畫出數軸；二、學會由數軸上的已知點說出它所表示的數，能將有理數用數軸上的點表示出來. 我認為這節課的教學目標可以這樣去具體化，如一、明確什么是數軸；二、數軸的三要素是什么；三、畫數軸的方法是什么；四、數軸上的點與有理數之間的關系是什么；這樣把課堂目標具體化之后，學生們如果可以回答這幾個問題，那么這節課的內容就算是掌握了. 要判斷學生們是否達成了課堂的學習目標，就按照這樣的依據來檢驗就可以了. 因此，教師在制定課堂教學目標的時候，要保證目標內容的具體性和目標的可操作性，盡量不要設計一些抽象的，范圍籠統的目標.

二、授課的過程應以課程目標為向導

在制定了具體的教學目標之后，課堂的展開就應該是以教學目標為導向和線索，一步步進行教學. 這樣不但有利于教學的有序展開，還可以使課堂的邏輯更加合理. 在導入新課之后，教師可以直接把本堂課的教學目標告訴學生，如要讓學生們明確本節課要學習的內容是什么，我們要掌握哪幾點，哪些內容是重點，哪些內容是難點，不同的內容對學生們的不同要求. 讓學生明確這節課要達成的目標有哪些，學習的內容難度有多大. 在這樣的明確目標的指引下，無形中就可以促使學生們在目標和任務的驅動下學習. 因為有學習任務和目標的提示和指引，在學習的過程中就可以對學生們形成有利的刺激，讓學生們的學習變得有目的，避免學習的盲目性.

學生們在目標的指引下學習，也能更好地理解教師的授課內容安排，可以更加連貫地理解內容之間的銜接和過渡. 現實的教學中，很多教師在上課開始之后，直接就說我們今天學習什么內容，比如說我們今天學習數軸，數軸是這節課的標題，但這一節具體講了些什么內容，如果教師不先宣布教學目標的話，接下來就開始講課，可能到下課，也有很多學生不知道這節課的重點是什么，到底要掌握一些什么內容才算過關，這樣給學生的感覺是會很籠統的，也會覺得比較盲目. 因此，教師在上課之間要詳細說明這節課具體要學習的是哪些內容，那將會大大提高課堂的效率.

三、教學方法要適應目標教學的過程

目標教學的過程是以目標為導向的，但也還需要依賴一定的教學方法. 教學方法并不能隨便用，要達到好的教學效果，就要采取適當的教學方法. 教學方法受特定的課程內容所制約的，教學方法是一種引導和調節教學過程的規范體系. 它不但是一種教法，還是一種學法. 在目標教學的引導下，圍繞教學目標，教師可以選擇講授的方法，還可以選擇讓學生們自主學習的方法，目標教學法是一種比較容易選擇教學方法的學習方式. 教師可以根據教學目標把每一個知識點講清楚，學生也可以根據教學目標進行學習和探究性的自主學習. 課堂中教師調配得好，就可以實現講授和學生探究相結合的理想的授課方式. 不但能把知識傳達清楚，還可以培養學生們自學的能力.

比如在學習數軸的時候，因為這節課的內容比較簡單，可以讓學生們先看書，讓他們來回答什么是數軸，數軸的三要素是什么. 也可以教師先講授什么是數軸，然后讓學生們自主學習探究后來回答數軸的三要素. 老師的講授和學生的自主學習可以很自由地結合. 無論用什么樣的方法，都是圍繞教學目標而進行的，達到目標就可以說這節課有效率.

四、以課堂目標來檢測學生們對知識的掌握程度

上完一節課，學生們對知識的掌握程度一般來說可以通過練習的形式來反饋，但其實也可以用一種更加直接的方式，就是根據教學目標來檢測學生們對是否已經掌握本節課所學習的知識. 比如可以通過提問的方式，用教學目標中具體的內容來進行提問，學生們可以答出來的話，那么這節課的目標就算是達成了. 如果有些學生沒有很好地完成學習的任務，那么對照著教學目標，他也可以很清楚地知道自己還有哪一點是不明白的，這樣也方便學生進行復習或尋求其他同學的幫助. 學生對自己的學習效果和學習情況也可以有個清楚的了解. 這些都是通過教學目標才能體現出來的.

綜上所述，讓目標貫穿課堂的全部，有了具體的課堂教學目標可以更好地組織上課內容和上課過程. 這樣無論是教師還是學生，在教與學的過程中都有了明確的方向，師生們有了共同的目標，課堂也將更加和諧順利地進行，真正提高課堂的效率.

【參考文獻】

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據介紹，黃瓜源自喜馬拉雅山脈南麓，本是印度境內土生土長的植物。野生黃瓜果實和植株都比較矮小，果實極苦，原本在印度被作為草藥使用。經過人類的馴化，黃瓜果實和葉片都變大了，果實也失去了苦味，由一種草藥變成了品種多樣的可口蔬菜，如今在世界范圍內廣泛種植。在科研上，黃瓜常被用來作為研究植物性別決定、維管束形成的重要模式系統。

科研團隊通過對115 個黃瓜品系重測序和1 個野生黃瓜從頭（de novo）測序共發現了330多萬個單核苷酸多態性位點（SNPs）、33萬多個小插入和刪除（small insertion and deletions）和594 個獲得/缺失變異（PAVs）。基于這些數據，研究人員構建了1 個單核苷酸分辨率的黃瓜遺傳變異圖譜。

所挑選的115 個黃瓜品系分為印度類群、歐亞類群、東亞類群和西雙版納類群等4大類，其中印度類群主要來自于野生變種，而其余3 個品種均來自栽培變種。通過比較分析發現，印度類群遺傳多樣性遠遠超過其它3 個類群。這一結果證實了印度是黃瓜的發源地，也意味著野生資源中尚有很多待挖掘的基因資源。

科研團隊還對3 種果蔬（黃瓜、西瓜和番茄）和3 種谷物（大米、玉米和大豆）的馴化過程進行了比較研究，結果發現在馴化過程中，果蔬比谷物的遺傳多樣性下降趨勢更大，這就解釋了為何經馴化的黃瓜群體比谷物要小得多。研究人員推斷果蔬在進化過程中的“瓶頸期”相對要更窄些。

研究發現，黃瓜基因組中有100多個區域受到了馴化選擇，包含2000多個基因。其中7 個區域包括控制葉片和果實大小的基因，果實失去苦味的關鍵基因已經明確地定位在染色體5上包含67 個基因的一個區域里，為下一步克隆這一重要蔬菜馴化基因打下了基礎。

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關鍵詞 硒 表觀遺傳修飾 表觀標志物抑制劑 抗癌藥 開發

中圖分類號：R979.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）03-0075-04

Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*

ZHU Huiqiu1**， HUA Yan1， WANG Mingli2***

（1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd.， Hefei 230000， China； 2. Anhui Medical University， HeFei 230032， China）

ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.

KEy WORDS selenium； epigenetic modification； inhibitors of epigenetic markers； anti-cancer drugs； development

硒最重要的生物學功能是抗癌，并以多種機制發揮其抗癌作用。近年來的研究發現，硒又可對表觀遺傳學調控機制異化產生干預影響，特別是對在腫瘤發生機制中的特異性靶點進行干預，進而阻抑腫瘤的發生及轉移。硒化物是某些腫瘤特異性表觀標志物有效的抑制劑。硒的這個功能不僅對臨床腫瘤診斷、治療、預防具有現實意義，更為“含硒表觀靶向抗癌藥物”開發提供了科學依據。“含硒表觀靶向抗癌藥物”是期待開發的新型抗癌藥。現就近些年在這些方面的相關研究作一簡要介紹。

1 表觀遺傳學

什么是表觀遺傳學？從孟德爾遺傳規律講，親代（一代）把遺傳信息傳遞給子代（二代），主要由攜帶遺傳信息的脫氧核糖核酸（DNA）分子中堿基的排列順序（即堿基序列）來決定，并在細胞核內遺傳。但人們在研究中發現，在DNA堿基序列以外還有一套調控機制，包括 DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及非編碼RNA等，它們在不涉及改變DNA堿基序列的情況下，影響轉錄活性并調控基因的表達，改變機體的性狀，并且是一種可以預和逆轉的遺傳機制。這種非孟德爾遺傳現象，稱作表觀遺傳學[1-2]。

2 硒對表觀遺傳修飾異常產生干預及逆D作用

腫瘤發生發展的主要生物學原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究顯示，DNA甲基化水平同這些基因的表達密切相關。通常情況下，甲基化水平同基因表達呈負相關，甲基化程度越高，基因表達活性越低，甲基化程度越低，基因表達越活躍[4]。

DNA甲基化主要表現為基因組整體甲基化水平降低和局部CpG島[在哺乳動物中富含胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）二核苷酸的一段DNA稱為CpG島]甲基化程度的異常升高，人類基因組的甲基化主要發生在CpG島[5]。

研究表明，實體瘤普遍存在基因組廣泛低甲基化現象，低甲基化使原癌基因活化，癌細胞異常增殖；低甲基化還使腫瘤轉移增加，例如胃癌的甲基化水平越低，癌細胞浸潤、轉移的傾向越明顯[6]。

CpG島的甲基化程度異常升高，會導致某些抑癌基因表達沉默，進而參與腫瘤的發生發展。在正常情況下，CpG島為非甲基化。當腫瘤抑癌基因的啟動子區域（CpG島）過度甲基化，就會使抑癌基因的表達沉默。其間DNA甲基轉移酶（DNMT）家族中的DNMT1發揮著重要的調控作用，它的高表達導致抑癌基因在CpG島失活。所以，CpG島高甲基化成了多種腫瘤特異性表觀標志物，已成為臨床多種腫瘤早期診斷的依據和指標[7]。

近年來，作為表觀遺傳學調控機制之一的組蛋白修飾在腫瘤研究領域受到越來越多的關注。組蛋白乙酰化由組蛋白乙酰轉移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同調控，而編碼HAT或HDAC的基因如果發生染色體易位、擴增等突變會導致某些腫瘤的發生。

可見，DNA甲基化和組蛋白乙酰化等表觀遺傳修飾異常是腫瘤發生的另外一個機制。而近年研究發現，硒通過靶向干預可逆轉甲基化和乙酰化異常的過程，從而抑制腫瘤的發生及轉移。硒化物成了潛在的治癌新藥物，是亟待開發、臨床應用前景可觀的“含硒表觀靶向抗癌藥物”。

2.1 硒對DNA甲基化產生干預作用

研究表明，膳食硒通過干預表觀遺傳過程顯示出其抗癌潛力，膳食缺硒時組織呈現整體低甲基化[8]。Davis等[9]早些時候研究發現，給大鼠喂食缺硒膳食，其肝臟和結腸都出現顯著DNA低甲基化，而經硒處理的人結腸癌細胞株Caco-2 DNA甲基化水平顯著高于未經硒處理的對照組，據此研究者認為，膳食缺硒會增加肝臟和結腸腫瘤的發生。Remely等[8]研究表明，膳食硒營養缺乏會引起動物組織和人體結腸癌DNA低甲基化。我國學者徐世文等[4]通過實驗也發現，飼料硒缺乏可導致雞肌肉組織 DNA甲基化水平降低。硒對DNMT有抑制作用，缺硒會導致DNMT活性增加，使原癌基因活化，引起結腸癌等多種腫瘤發生。保持硒等營養素均衡攝入，有利于維持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。

CpG島DNMT1的高表達是使抑癌基因失活的重要機制。抑制DNMT1靶酶活性，使失活的抑癌基因復活，是腫瘤治療中探索的新途徑。硒在多種腫瘤中有去甲基化的生物學功能，能誘導失活的抑癌基因重新活化和表達[3]。研究發現，硒可以直接干預DNA甲基化，抑制腺癌細胞株DNMT的高表達[8]。膳食硒干預DNA甲基化的方式之一是通過去甲基化過程來調節DNMT1活性的；研究還證實，亞硒酸鈉和苯甲基氰酸硒（BSC）、1，4-苯雙（亞甲基）氰酸硒（p-XSC）兩種合成硒化物對人大腸癌細胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。

各方面的研究驗證，硒對DNA甲基化產生干預影響，是靶酶DNMT有效的抑制劑。

2.2 硒干預影響組蛋白的乙酰化

近年來，國內外學者研究發現，組蛋白去乙酰化酶與腫瘤的發生密切相關。HDACs家族中的HDAC1高表達可明顯增加腫瘤細胞的增殖能力。在食管鱗癌、前列腺癌等多種腫瘤中均發現HDAC的高表達，靶酶HDAC已成為首選的攻擊靶點。

目前，人們通過體內、體外的研究鑒定出了硒、丁酸鹽、曲古抑菌素A（TSA）等一些HDAC的抑制劑，這些抑制劑可在體外誘導多種腫瘤細胞的生長停滯、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通過臨床試驗表明，HDAC抑制劑對人體白血病及實體瘤進行治療，表現出明顯的抗腫瘤增殖效果，研究者認為，各類HDAC抑制劑是另一類新型抗癌藥物、“癌癥治療的新工具”。

Xiang等[12]的研究證明，硒可以通過下調DNMT和抑制HDAC活性，活化人前列腺癌LNCaP細胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1， APC和CSR1。這些基因是具有保護免受氧化損傷的抗癌活性物質、化學致癌物解毒劑或腫瘤抑制劑。

甲基硒酸（MSA）是近年來新研制成的一種人工低分子量有機硒化合物，是很具潛力的抗癌制劑。Kassam等[13]通過對彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞系（DLBCL）w外研究首次發現，MSA可以抑制該細胞系HDAC的活性。研究者認為，有關MSA抑制HDAC活性的作用以前從未報道過，從而為人們提供了硒元素一種新的機制，MSA是日后臨床試驗中可以使用的硒化物。

我國科研人員胡琛霏[2]通過蛋白質免疫印跡的方法，檢測到MSA可抑制食管鱗癌細胞系HDAC的活性，降低HDACl和HDAC2的蛋白表達，引起細胞內組蛋白乙酰化水平顯著升高；同時，還檢測到硒甲硫氨酸（SLM）對食管鱗癌細胞系KYSEl50細胞和MCF7細胞的作用，在SLM處理細胞24 h后，細胞中組蛋白去乙酰化酶的活性也顯著降低。

這些年，越來越多的含硒組蛋白去乙酰化酶抑制劑被發現和驗證。亞硒酸鈉、酮C甲基硒丁酸鹽（KMSB）、甲基硒代半胱氨酸（MSC）、甲基硒丙酮酸（MSP）等硒化物都可以抑制HDAC活性，提高組蛋白乙酰化水平，作為潛在的HDAC抑制劑，發揮其抗腫瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介紹，KMSB 和 MSP在體外作為HDAC的競爭性抑制劑發揮抗癌作用；還報道，合成的SAHA含硒類似物（5-苯甲酰戊氰硒）二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒對不同肺癌細胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸類HDAC抑制劑，是目前在臨床上以皮膚T淋巴細胞瘤（CTCL）為適應癥而廣泛應用的表觀靶向抗癌藥物。這也提示，含硒類抑制劑對靶酶HDAC抑制效果優于無硒類抑制劑。

為何上述各種硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性，研究發現不管其結構如何改變，硒都是這些化合物生物活性的中心元素，發揮著關鍵作用，硒的這一生物學功能對含硒抗癌藥物的開發具有重要的指導意義[16]。

2.3 硒對非編碼RNA調控機制產生干預效應

表觀遺傳學的一個重要調控機制是非編碼RNA。非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白質的RNA分子。近年來，非編碼RNA一族中的微小RNA-200（miR-200）受到人們的高度關注。研究發現，miR-200家族中的成員微小RNA-200a（miR-200a）與腫瘤的發生發展關系密切，miR-200a在腫瘤組織中呈現明顯低表達。因此，miR-200a的表達下調是腫瘤發生的重要因素之一，miR-200a也成了腫瘤特異性表觀標志物[17]。

胡琛霏[2]通過TaqMan芯片，檢測了MSA處理食管鱗癌細胞后細胞中微小RNA（miRNA）的變化情況，發現MSA可以上調細胞中miR-200a 的表達水平，miR-200a 表達升高后，負性調控Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）的表達，使Keap1蛋白水平下降，上調轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）蛋白水平并提高其轉錄活性（Nrf2活性受其細胞質接頭蛋白Keap1的調控），從而活化Keap1-Nrf2信號通路。而Keap1-Nrf2信號通路在抗氧化、預防腫瘤發生等諸多方面有重要作用[18]。

體外研究顯示[19] ，人腦膜瘤組織中miR-200a表達明顯低于正常組織，β-循環蛋白（β-catenin）和其下游靶基因細胞周期蛋白D1表達顯著增高，二者和miR-200a呈現負相關，上調miR-200a可降低β-catenin的表達，進而阻斷Wnt/β-catenin信號傳導通路來抑制腦膜瘤的生長。胡琛霏課題組前期研究也發現MSA可以抑制食管鱗癌細胞系中β-catenin的表達[2] 。研究已證實，Wnt/β-catenin信號通路的激活和高表達可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及抑制腫瘤細胞的凋亡[20]。

由此可見，MSA可能介導、調控著miR-200a表達及參與復雜的分子調控網絡，從而抑制腫瘤發生及轉移。

3 展望

加強硒與表觀遺傳學之間關聯的研究，有著重要的生物醫學意義。它有可能解釋硒化學抗腫瘤的新機制，從理論上證明硒元素可能具有表觀遺傳學的效應[21] 。綜上所述，硒在腫瘤形成中對表觀遺傳修飾異常產生干預影響，靶向抑制腫瘤特異性表觀標志物，逆轉表觀遺傳修飾發生異化過程，使我們認識了硒化學抗癌的新機制、新作用，硒化物是潛在開發的新型靶向抗癌藥物。Fernandes 等[15]指出，硒化物都是癌癥治療藥。目前，非表觀類含硒靶向抗癌藥如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已進入臨床研究[16]，展示出很有希望的臨床應用前景。而含硒表觀靶向抗癌藥物是亟待開發的抗癌藥“富礦”，加快開發含硒表觀靶向抗癌藥物，可為臨床腫瘤治療增加一種“新的工具”，為癌癥患者戰勝病魔增添一份新的希望。人們熱切期盼“含硒表觀分子靶向抗癌藥物”早日問世。

致謝：本課題研究得到華中科技大學徐輝碧、黃開勛兩位教授和安徽醫科大學張文昌碩士的支持，在此表示衷心感謝。

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篇6

    心肌缺血時,有氧代謝發生障礙,葡萄糖利用減少,脂肪酸利用增多,使氧利用率下降,心臟供能不足;同時,無氧代謝導致的酸性代謝產物增加,引起細胞內酸中毒。此外,心肌缺血還能引起氧自由基及鈣離子超載,誘導心肌細胞凋亡,導致嚴重的臨床癥狀。因此,改善能量代謝,清除自由基,減輕鈣超載,抵抗細胞凋亡,實現心肌保護作用成為改善心肌缺血的重要途徑[10]。研究表明,針灸在實現心肌保護方面具有自身的優勢。一方面,針灸可通過改善能量代謝,實現心肌保護。心肌缺血時,能量代謝相關酶發生改變,電針能提高心肌組織糖原、琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶的活性,糾正心肌相關酶的異常,增強能量代謝,改善心肌缺血。另一方面,針灸可減少自由基,緩解心肌缺血癥狀。熱休克蛋白(HSP)屬應激蛋白,能減少氧自由基釋放,減輕心肌缺血損傷,從而保護機體[11]。研究證明電針“內關”穴可以增強缺血心肌細胞HSP90和HSP70mRNA表達,以減少氧自由基的釋放,從而緩解家兔心肌缺血癥狀[12-13];而且,針刺“內關”穴能抑制細胞內Ca2+超載,實現心肌細胞保護,電針“內關”通過上調心肌鈣泵和鈉泵基因表達,增強鈣泵和鈉泵活性,降低心肌細胞內Ca2+含量,從而達到抑制鈣超載,實現對心肌組織的保護作用,表現為促進心電活動、改善心肌組織形態和超微結構[14]。大量研究表明,針刺可以調控凋亡基因的表達水平,延長細胞周期,減少細胞凋亡,保護缺血心肌細胞。有研究指出電針可以調節誘導細胞凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在家兔缺血心肌中的表達,即抑制凋亡基因Bax和促進抗凋亡基因Bcl-2的表達,抑制心肌細胞凋亡,從而達到保護心肌細胞的作用[15]。c-fos基因是一種原癌基因,參與調節體內許多過程,如細胞周期、細胞分化、腫瘤轉化及細胞凋亡等,正常情況下細胞內c-fos表達呈低水平狀態,心肌缺血可激活c-fos基因的表達從而啟動心肌細胞凋亡。研究表明,電針可降低c-fos基因表達,改善急性心肌缺血的過程[16-17]。所以不難看出,針灸能通過多種途徑實現心肌細胞保護。總之,針灸干預心肌缺血的療效和機制已初步得到證實和揭示,但尚未完全闡明,在一定程度影響了針灸治療心肌缺血在臨床的應用和推廣。因此,需要引進新的理念、新的方法技術進行深入探索。

    2表觀遺傳調控在針灸治療心肌缺血的機制研究中的應用

    目前主要涉及的表觀遺傳調控包括CG輔酶甲基化、組蛋白轉錄后修飾、RNA干擾等,具體可分為DNA甲基化、蛋白質共價修飾、染色質重塑、微小RNA調控4個方面[18-19]。越來越多的研究表明,表觀遺傳調控在心肌缺血過程中扮演重要角色,參與了疾病的發生、發展及預后的全部過程,因此,我們探討從該角度開展針灸治療心肌缺血機制研究的新方向。2.1表觀遺傳調控與心肌缺血的相關性以動物和人為載體的研究都表明,心肌缺血與表觀遺傳調控密切相關。表觀遺傳標記物在心肌缺血發生發展過程中的變化,反映出DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑及微小RNA是調控心肌缺血的關鍵因素。大鼠神經甲基化系統在心肌缺血中受到抑制,可導致缺血部位的兒茶酚胺濃度升高,作用于心臟,使心率加快,收縮力增強,心輸出量增加;懷孕期間的營養不良會改變DNA甲基化,增加成年后患心血管病的風險,且DNA甲基化在6個特殊位點對產前環境很敏感,可能提高婦女患心肌缺血的風險[20-22]。同時,有研究認為,組蛋白H3賴氨酸4甲基化(H3K4me)轉移酶和它們的輔助因子是調控胚胎發育及細胞特異性的重要因素[23];而Smyd2作為一種組蛋白甲基轉移酶,介導H3K4甲基化,改變心肌細胞組蛋白甲基化修飾和心肌細胞靶基因的轉錄調控,促進心肌細胞分化和發育[24-25]。最新研究報道組蛋白H3賴氨酸27去甲基化酶賴氨酸K特異性脫甲基6A(UTX)可以促進心肌細胞生長發育,UTX基因敲除小鼠因心臟發育障礙死于胚胎發育早期[26]。除甲基化之外,組蛋白的乙酰化在心肌缺血中的作用受到廣泛關注。發生心肌缺血后,心肌細胞蛋白發生了去乙酰化,抑制去乙酰化則能減少其損傷,組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑通過組蛋白去乙酰化酶Sirt1介導,后者含量增加,能有效促進心肌缺血耐受,誘導心肌保護[27-29]。HDAC-7抑制劑可與缺氧誘導因子(HIF)結合影響基因轉錄,增強HIF活性,從而促進心臟血管新生[30-31]。同時,HDAC抑制劑曲古柳菌素A可降低缺血心肌凋亡基因Caspase3表達,抑制心肌細胞凋亡,也可促進干細胞向心肌細胞分化,介導心肌細胞再生[32-33]。進一步研究發現,組蛋白H3賴氨酸9乙酰化(H3K9ace)與缺血心肌保護密切相關,通過調節血管再生因子、細胞凋亡因子和HSP基因表達達到抗缺血性損傷效果。其中VEGF、Sirt1與組蛋白賴氨酸乙酰化關系最為密切[34-39]。除組蛋白修飾之外,microRNA上調或下調通過作用于靶基因激活相應的分子信號通路參與心肌保護,調控心肌缺血損傷。染色體重塑也被證明與心肌細胞生長發育相關[40-41]。

    總之,DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA等表觀遺傳調控在心肌缺血過程中具有重要意義。2.2表觀遺傳調控與針灸防治心肌缺血機制研究從上述表觀遺傳調控與心肌缺血的相關研究成果可知,表觀遺傳調控介導細胞凋亡、心肌細胞保護和心臟血管再生,在心肌缺血發生發展過程中具有特殊地位,是目前醫學研究的熱點。從該角度切入進行針灸防治心肌缺血研究,必然是今后研究的一個新方向。同時,結合表觀遺傳調控自身特性,即強調除了DNA和RNA序列以外,還有許多調控基因信息,雖然本身不改變基因的序列,但其通過基因修飾、蛋白質與蛋白質、DNA和其它分子的相互作用,多層次、多途徑影響和調節遺傳基因的功能和特性,這些調節同時存在可逆性。這與針灸作用整體性、綜合性、雙向性、多靶點的特點具有一定的相似性。因此,將表觀遺傳學的理念和技術引入針灸抗心肌缺血機制研究,乃至整個針灸研究領域,都具有較強的可行性。結合針灸自身優勢特點,以及其抗心肌缺血研究現狀,融合上述表觀遺傳調控在心肌缺血發生發展過程的作用特點,我們認為,今后的研究可從兩個方面進行,一是針灸對心肌缺血疾病的預防。治未病思想歷來是中醫理論的核心,早在《黃帝內經》中就強調“不治已病治未病”。現代研究證實,針刺具有提高機體機能的作用,如實施心肌缺血再灌注手術前針灸“內關”穴,能提高心肌細胞耐缺血能力,延長動物生存期,這無疑為心肌缺血患者贏得了寶貴的搶救時間[42]。而表觀遺傳調控與之密切相關,HDAC直接參與耐缺血,如果以此進行深入研究,一旦得以證實,將為臨床進行再通手術前實施針灸干預的應用提供科學依據[43]。另一方面,則是在現有的研究基礎上,繼續深入探討針灸抗心臟缺血機制研究。根據心肌缺血的不同階段,有重點地開展相應研究。如急性期、亞急性期,主要圍繞針灸促心肌細胞存活、抑制細胞凋亡,以及改善能量代謝,從而實現心肌細胞保護進行研究。針灸能有效調控心肌組織中Sirt1、HSP70、Caspase3、c-fos、Bcl-2等物質的表達,實現保護心肌目的,但其背后的調控機制如何,尚未得到證明。研究表明,HDAC能有效調控Caspase3表達,H3K9ace能影響HSP70水平等,從這些角度深入揭示針灸促心肌保護機制,將為針灸的更廣泛應用提供基礎。在慢性期,則主要圍繞促進血管新生開展。已有的研究證實針灸能促缺血區域的血管新生,且與VEGF密切相關,但調控VEGF表達發生改變的機制并未得到證明。腫瘤存在大量的新生血管,研究中發現,H3K9ace在此過程中扮演重要角色,我們可以推測,在針灸促VEGF表達,介導血管新生過程中,H3K9ace可能具有重要意義。同時,也可以充分結合針灸抗心肌缺血機制研究成果,著重篩選出相應優勢靶點,進行新藥開發,或許可能成為新藥開發的新靶點。除此之外,還可進行相應的拓展。研究表明,心臟中存在心肌干細胞,在某些影響因素干預下,能不斷增殖、分化形成新的心肌干細胞。這個過程中表觀遺傳調控發揮重要作用[44]。針灸有促體內干細胞增殖、分化的能力,比如促腦內神經發生,實現腦保護[44-45]。那么針灸是否也能促進心臟干細胞增殖、分化,實現心肌保護?從表觀遺傳學的角度研究,也將成為我們關注的方向。

篇7

【關鍵詞】 輔助生殖技術；妊娠早期；染色體異常

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.04.042

近年來， 助生殖技術（assisted reproductive technology， ART）V泛用于治療不孕問題， 相關研究顯示[1]， 發達國家每年有≥3%的輔助生殖技術出生兒， 輔助生殖技術為不孕家庭帶來了福音。自然流產是一種人類優勝劣汰的自然選擇結果， 發生自然流產的幾率為15%， 在全部流產中占75%的比例， 導致自然流產的主要原因是染色體異常（夫妻染色體異常與胚胎染色體異常）。近30年來， 輔助生殖技術得到了高速發展， 但有相關報道指出[2， 3]， 輔助生殖技術致早期妊娠流產率較高， 為此， 本院對400例流產患者進行了絨毛細胞分離和染色體分析， 現做如下報告。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年1月～2016年1月本院收治的孕早期流產患者400例， 將其中320例自然妊娠孕早期自然流產患者作為對照組， 80例因輔助生殖技術致妊娠的孕早期自然流產患者作為觀察組。觀察組患者年齡22～43歲， 平均年齡（33.6±3.3）歲， 孕周7～12周；對照組患者年齡25～44歲， 平均年齡（31.2±5.2）歲， 孕周7～12周。兩組患者一般資料比較， 差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。在告知兩組患者實驗過程及目的后， 均表示愿意參加實驗并簽署知情同意書， 實驗獲得了醫院倫理委員會批準同意。

1. 2 方法 先提取絨毛細胞， 對流產的患者進行子宮清宮術， 備好負壓吸引管， 清宮時嚴格遵守無菌操作規程， 采用負壓吸引管利用負壓原理， 吸附絨毛組織5～20 mg。將這5～20 mg絨毛組織作為標本， 放入生理鹽水中浸泡， 并立即送入中心實驗室備檢。標本送達后， 立對絨毛組織標本進行分離培養， 采用雙抗清洗法清洗標本， 去污物（血塊、蛻膜組織）， 保留典型的絨毛組織約10 mg， 將清洗后的標本放入離心管置入離心機進行離心操作， 離心結束后觀察管內分層， 去除上層的液體， 在下層滴入生物酶（膠原酶、胰酶）， 將標本放入保溫箱， 仔細觀察并記錄， 待出現絨毛散開現象時， 立即滴入母牛血清， 采用電子顯微鏡觀察絨毛細胞形態。當視野中出現成片狀細胞， 將標本放入新鮮的培養液中并滴入生物堿（秋水仙素）， 再次放置在保溫箱內， 放置時間為4 h， 然后去掉上層清夜， 將標本置入水浴箱， 2 h后取出， 將標本放入離心機再次離心， 將離心后的標本去上清液制成懸液， 通過萊卡顯微鏡進行觀察， 選擇兩名醫生同時讀標本玻片， 每例計算20個分裂象， 分析2個核型（嵌合體加倍計數）。

1. 3 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P

2 結果

觀察組患者中

3 討論

輔助生殖技術是治療不孕不育的一種手段， 有體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵子體外成熟（IVM）、人工受精（AI） 等形式[4]。根據WTO的相關數據顯示[5-9]， 我國的不孕癥發病率高達15%， 傳統的治療遠遠不能滿足日益增長的不孕不育患者的治療需要。

自然流產是妊娠過程中常見的并發癥， 而染色體異常則是自然流產的主要原因之一， 包括夫妻染色體異常和胚胎染色體異常[10-12]。夫婦染色體異常常見的有平衡易位和羅伯遜易位， 胚胎染色體異常常見的有三倍體、多倍體及染色體平衡易位、嵌合體等。與自然流產相比， 輔助生殖技術妊娠不增加妊娠早期流產率， 但是與流產孕婦的年齡存在著一定的關系。本研究通過對流產的患者進行子宮清宮術， 清宮時采用負壓吸引管利用負壓原理， 取出絨毛組織5～20 mg作為實驗標本， 將其放入生理鹽水中浸泡， 然后對絨毛組織標本進行分離培養， 采用雙抗清洗法清洗標本， 去除血塊及蛻膜組織， 保留典型的絨毛組織， 進行離心操作， 觀察標本現象。發現自然妊娠孕早期自然流產患者的絨毛細胞染色體異常率與輔助生殖技術致妊娠早期自然流產患者的絨毛細胞染色體異常率無明顯差異（P>0.05）， 但是不同年齡間差異具有統計學意義（P

相關研究顯示[2]， 輔助生殖技術能影響表觀遺傳（印記基因）的調控， 影響胚胎植入和胎兒生長等， 表觀遺傳學方面的異常能使胚胎停育， 基因印記缺陷會導致早期妊娠的不穩定易發生流產[1]。控制性招促排卵過程中， 大劑量促性腺激素的使用， 可能是引起配子及胚

胎印記異常， 輔助生殖技術實施時間正處于印跡重建的窗口期， 運用于當中的操作會對配子及胚胎的甲基化狀態發生一定的影響。

本文研究結果顯示， 觀察組患者中

綜上所述， 輔助生殖技術并不增加妊娠早期流產胚胎染色體異常的發生率， 但絨毛細胞染色體異常與育齡婦女的年齡有明顯的關系， 年紀≥40歲的患者采用輔助生殖技術妊娠更容易導致妊娠早期流產。

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篇8

【關鍵詞】 丙戊酸鈉 性粒細胞白血病 K562細胞 增殖 凋亡

of sodium valproate（VPA） on the proliferation of chronic myeloid leukemia cell line K562，and to explore possible mechanisms． 【Methods】 K562 cells were treated with VPA． Cell proliferation was determined by CCK-8 assay． Cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry （FCM）． 【Results】 VPA inhibited the proliferation of K562 cells in concentration- and time-dependent manners． The apoptosis rate was significantly higher in the cells treated with VPA than in untreated cells［（11．47％±0．25％）vs（4．77％±0．40％）， P ＜ 0．05］． After treatment of VPA， cell cycle was arrested obviously at G0／G1 phase （P ＜ 0．05）． 【Conclusions】 VPA could induce G0／G1 phase arrest， inhibit the proliferation and induce the apoptosis of K562 cells in vitro．

Key words： sodium valproate； chronic myeloid leukemia； K562 cell； proliferation； apoptosis

近年來研究發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACI）可誘導多種腫瘤細胞生長阻滯、分化及凋亡［1-3］。丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）是一種傳統的抗癲癇藥物，其在抗癲癇有效治療濃度時也表現出很強的HDACI活性［4］；慢性粒細胞白血病是臨床上一種比較常見的惡性血液病，t（9；22）形成Ph染色體是其特征性細胞遺傳學改變，由此形成的Bcr／Abl融合基因是其發病的分子機制和新藥物（如格列衛）作用靶點。盡管格列衛取得了極好的療效，但臨床仍然觀察到耐藥的情況［5］。所以為了克服耐藥，臨床上迫切需要開發新一代作用于Bcr／Abl融合基因的靶向藥物或其他不同機制的抗腫瘤藥物。本實驗探討了VPA對慢性粒細胞白血病急變期細胞株K562細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。

1 材料和方法

1．1 主要試劑

VPA購自法國賽諾菲安萬特公司。1640培養基為Gibco公司產品，胎牛血清（fetal calf serium， FCS） 購自杭州四季青生物公司。CCK-8試劑盒為碧云天公司產品，AnnexinV-FITC 凋亡和細胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson 公司產品。K562細胞株由中山大學腫瘤研究所提供。

1．2 方 法

1．2．1 細胞培養

K562細胞用含100 g／L滅活FCS的RPMI 1640培養液重懸后，置于37 ℃、體積分數5％ CO2飽和濕度培養箱中培養，每2 ～ 3天換液1次。

1．2．2 CCK-8方法分析細胞增殖活性

取對數生長期的K562細胞，調整細胞終密度為1 × 105／mL 接種于96 孔板，分別加入0．5、1、2、5、10 和25 mmol／L的VPA，每孔總體積為200 μL，另設空白孔和對照孔，每個濃度設3個復孔，于加藥后72 h檢測，每孔避光加入20 ?滋L CCK-8，繼續孵育2 h后用酶標儀檢測A值，波長450 nm。實驗重復3次，取平均值。以藥物濃度為橫坐標，生長抑制率為縱坐標，繪制濃度-生長抑制率曲線。生長抑制率＝［（A對照－A空白）－（A實驗－A空白）］／（A對照－A空白） ×100％。另外，通過上述試驗結果計算出IC50值，然后以接近IC50值的濃度的VPA處理K562細胞，分別于加藥后0，12，24，36，48，60和72 h檢測，并計算出生長抑制率，以分析作用時間對細胞增殖的影響。

1．2．3 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數生長期的K562細胞以5 × 106／mL種于6孔板中，分為對照組、VPA（2 mmol／L）組，加藥48 h后，收集各組細胞，PBS洗2次，離心棄上清，700 mL／L冷乙醇4 ℃固定過夜后。離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min，400目的篩網過濾1次，離心5 min，棄去PBS。用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min。上機檢測，進行結果分析。

1．2．4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期的K562細胞以5 × 106／mL種于6孔板中，分為對照組、VPA（2 mmol／L）組，加藥48 h后，收集各組細胞，PBS洗2次，離心棄上清，懸溶于結合緩沖液中，調整細胞濃度為1 × 106個／mL。加10 μL異硫氰酸熒光素（ FTIC） 標記的連接素（Annexin） 和10 μL的20 mg／ L的普匹碘氨（ PI） ，混勻，避光室溫孵育10 min。用結合緩沖液洗1次后用Coulter Elite 流式細胞儀（Coulter 公司） 進行分析。Annexin V（－） PI （－） 為活細胞，Annexin V（－） PI （＋） 為機械損傷細胞， Annexin V（＋） PI（－） 為早期凋亡細胞， Annexin V（＋） PI （＋） 為晚期凋亡細胞， 實驗中以Annexin V（＋） 作為凋亡細胞。

1．2．5 統計分析

用SPSS 11．5統計軟件包進行統計分析，結果用x±s表示，多組間比較進行單因素方差分析，兩組間均數比較采用t檢驗，P ＜ 0．05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2．1 VPA對K562細胞的增殖抑制作用

不同濃度（0．5 ～ 25 mmol／L）的VPA均可抑制K562細胞生長，差異有統計學意義（F＝15．32， P ＜ 0．05）；并且VPA對K562細胞生長的抑制作用在一定濃度范圍內呈濃度依賴性（圖1）。用接近IC50濃度（2 mmol／L）的VPA處理K562細胞不同時間后，結果顯示隨著孵育時間延長其生長抑制作用明顯增強，差異有統計學意義（F＝103．77， P ＜ 0．05）。這反映VPA對K562細胞生長的抑制作用在一定時間內也具有時間依賴性（圖2）。

2．2 流式細胞儀檢測K562細胞凋亡

用2 mmol／L的VPA處理K562細胞在48 h后，以Annexin V／PI雙標記后通過流式細胞儀檢測，結果顯示VPA處理組細胞凋亡率高于未處理對照組，差異有統計學意義（t ＝ 24．375， P ＜ 0．05， 表1）。

2．3 流式細胞儀分析K562細胞周期

用2 mmol／L的VPA作用K562細胞48 h后，細胞周期進程被阻滯，G0／G1期細胞明顯較未處理組增加（t ＝ 7．561，P ＝ 0．002），而S期細胞較未處理組明顯減少（t ＝ 8．70， P ＝ 0．001），差異均有統計學意義（表1， 圖3）。

3 討 論

表觀遺傳學修飾是基因表達的主要調節方式，包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化和RNA干擾等。表觀遺傳在轉錄調控上起著極為重要的作用，組蛋白高乙酰化和DNA啟動子序列低甲基化可促進基因表達，而組蛋白去乙酰化和DNA啟動子序列高甲基化可抑制基因的表達，這兩種機制相互協調，共同實現對基因表達的精細調控［6］。近年來研究表明，表觀遺傳學改變在腫瘤發生中扮演一個重要角色。腫瘤發生的主要表觀遺傳學改變是抑制腫瘤生長的基因發生DNA啟動子序列過甲基化和染色質中的組蛋白去乙酰化修飾。惡性腫瘤的發生、發展過程中常涉及組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC）的異常聚集，引起在細胞發育、分化、凋亡過程中起重要作用的基因表達受抑，導致腫瘤的發生［7］。HDACI可以通過抑制HDAC活性，誘導組蛋白高乙酰化，調節基因表達，從而發揮抗腫瘤效應［8］。目前已有多種HDACI 進入了Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗。VPA是一種傳統的抗癲癇藥物，毒副作用輕微，長期使用患者耐受性好，其在抗癲癇有效治療濃度時也表現出很強的HDACI活性，可通過誘導細胞周期停滯、凋亡和分化而抑制腫瘤細胞的生長增殖［4，9］；對腫瘤細胞有選擇性細胞毒性，而對正常造血細胞無嚴重毒性，且與多種化療藥物有協同作用［10］。HDACI的應用標志著一種全新的腫瘤治療途徑，因此研究HDACI 是通過何種機制來發揮抗腫瘤作用有著積極的實際意義。

慢性粒細胞白血病是臨床上一種比較常見的惡性血液病，盡管近幾年來以Bcr／Abl融合基因的產物P210蛋白作為靶點的新藥——伊馬替尼（格列衛）取得了極好的臨床效果，但是在加速期和急變期患者中仍然觀察到了原發性和繼發性耐藥的現象［5］。所以臨床上需要開發新一代作用于P210融合蛋白的靶向藥物或其他不同機制的抗腫瘤藥物。

本實驗結果證實了傳統的抗癲癇藥物同時也是一種HDACI的VPA對K562細胞的生長具有劑量－時間依賴性的抑制作用；同時2 mmol／L的VPA作用48 h后K562細胞凋亡較對照組增加。這說明VPA可能是通過誘導細胞凋亡來抑制K562細胞增殖的。VPA引起細胞凋亡的具體分子機制現在尚未完全闡明。Caspase-3是凋亡效應分子之一，其可以被多種內外源性凋亡誘導因子激活從而引起細胞發生凋亡。有研究發現VPA可引起多種白血病細胞株發生caspase-3依賴性的凋亡，同時它還可以通過不依賴caspase-3活化的途徑引起細胞凋亡［11］。所以我們推測其引起K562細胞凋亡的分子機制也有可能比較復雜，需要進一步研究。

此外，現在發現HDACI對腫瘤細胞具有阻滯周期進程的作用。Sakura等［12］將VPA和SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）這兩種HDACI作用于14種淋巴系統腫瘤細胞株后，細胞發生了G1或G2／M阻滯及凋亡，并且與細胞周期調節有關的p53、p21和p27基因出現表達上調。本實驗中VPA處理后G0／G1期細胞比例增加，同時S期細胞比例下降。這說明VPA可以使K562細胞周期進程受到阻滯。其分子機制也可能是上調p21WAF1等細胞周期調節基因的表達，而增多的p21WAF1與CDK結合，抑制CDK活性，從而引起細胞周期停滯，最終可能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡。

本實驗結果表明，VPA能夠抑制慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞的生長，并可誘導其凋亡和細胞周期阻滯，這為慢性粒細胞白血病患者的治療提供了新的途徑及一定的理論依據。

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篇9

1.1方法

1.1.1細胞培養及藥物處理：MKN1細胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養、傳代。實驗用對數生長期細胞。細胞培養至60%匯合度時，分別加入2μmol/L或10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理液，對照組使用不含5⁃Aza⁃CdR的普通完全培養液。每隔24h換液1次，培養72h后處理細胞用于后續的相關檢測。

1.1.2亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應：采用Blood＆CellCultureDNAMiniKit試劑盒，按說明書步驟提取各組細胞基因組DNA。取500ngDNA按照試劑盒說明進行亞硫酸氫鹽修飾及純化。使未甲基化的胞嘧啶（C）轉化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用GoT⁃aqDNA聚合酶進行BNIP3基因啟動子擴增。用MethPrimer軟件設計甲基化引物，上游：5′⁃TTAAAGTGTTGAGATGAAAGATATG⁃3′，下游：5′⁃AATCCAAATCCAAATATCAAAATAC⁃3′，產物長度為288bp。反應條件為95℃10min，95℃30s、56℃30s、72℃30s進行35個循環，然后72℃延伸10min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，應用膠回收試劑盒回收，純化目的片段，連接pGEM⁃T載體，4℃孵育過夜。取6μL連接產物轉化JM109感受態大腸桿菌，藍白篩選陽性克隆，送菌液測序。

1.1.3RT⁃PCR檢測BNIP3基因表達：采用Axy⁃PrepTotalRNAMiniprepKit試劑盒提取各組細胞總RNA，逆轉成cDNA后進行PCR實驗，BNIP3引物序列：上游：5′⁃CCACCTCGCTCGCAGACACCAC⁃3′，下游：5′⁃GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC⁃3′，長度為317bp。作為內參的人β⁃actin引物序列：上游：5′⁃CCAGATCATGTTTGAGACCT⁃3′；下游：5′⁃TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT⁃3′，長度為480bp。擴增反應條件：95℃5min變性，95℃復性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，72℃延伸10min，4℃暫時保存。實驗重復3次。產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達情況。

1.1.4染色質免疫沉淀：采用ChIP試劑盒按說明書進行如下操作：用1%甲醛PBS交聯固定蛋白質－DNA復合物，加入交聯終止液5min，2500r/min、4℃離心10min，PBS洗脫2次；加裂解液冰上裂解5min，酶法消化切割至200~1000bp的染色質小片段；之后，染色質與DNMT1特異性抗體及DNA/Pro⁃teinGAgorose4℃顛轉過夜，洗脫蛋白/DNA復合物，純化回收DNA。針對BNIP3啟動子區的引物序列：上游：5′⁃CCGCGCCGCCTCCTCCGCCTCAC⁃3′；下游：5′⁃GCTCCGACCTCCGCTTTCCCACCGCC⁃3′。PCR擴增條件：95℃5min，95℃30s，59℃30s，72℃30s，72℃10min，30個循環。產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達情況。

1.2統計學分析數據用x±s表示，采用SPSS13.0統計軟件，組間比較采用t檢驗，甲基化率比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MKN1細胞中BNIP3基因啟動子區的甲基化狀態

2.1.1BNIP3基因啟動子區CpG島序列分析：在ENSEMBLE上找到BNIP3基因啟動子區的原始序列，利用MethPrimer分析，按照“長度超過200bp，GC含量大于50%，CpG出現率（觀察值／預測值比例）≥0.6”的參數定義［8］，可以找到BNIP3基因啟動子區自轉錄起始點上游966bp至下游86bp之間長度為1052bp的CpG島。圖1為BSP法擬分析其中長288bp、含14個CpG位點的DN段。

2.1.2BSP結果：以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板行PCR，將PCR擴增產物連接T載體，轉化增菌，PCR擴增鑒定陽性克隆。圖2為隨機挑取的5個克隆的菌液PCR鑒定結果，在約288bp處可見理想的目的條帶。

2.1.3測序結果分析：陽性克隆進一步測序，將亞硫酸氫鹽修飾后的序列與原序列進行對比，發現非CpG位點的“C”全部轉化為“T”，證明亞硫酸氫鹽修飾效果可信。擴增的BNIP3啟動子區片段包含有14個CpG位點，與原始BNIP3基因序列比對，各CpG位點甲基化概率分別為100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%、100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%。見圖3及圖4。

2.25⁃Aza⁃CdR對MKN1細胞中BNIP3表達的影響采用不同濃度5⁃Aza⁃CdR處理MKN1細胞，作用72h后，對照組、2μmol/L5⁃Aza⁃CdR處理組和10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA相對表達量分別為0.389±0.018，0.515±0.024，0.839±0.014。10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA表達量較對照組明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05），見圖5。

2.35⁃Aza⁃CdR對MKN1細胞中BNIP3基因啟動子甲基化的影響10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理細胞72h后，BNIP3基因啟動子甲基化狀態有所逆轉（圖6），啟動子區CpG位點甲基化率（74.2%±9.37%）與對照組（圖4）甲基化率（94.3%±19.80%）比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4BNIP3啟動子與DNMT1蛋白的結合用ChIP實驗檢測MKN1細胞中DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合。結果顯示，在對照組可以檢測到DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合，而10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理組與對照組相比DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合明顯減少。見圖7。

3討論

DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的重要作用方式之一，指在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價鍵結合一個甲基基團。越來越多的研究表明，DNA甲基化在癌癥的發生機制中扮演重要角色。正常生理條件下，人類基因組中位于啟動子區、富含CpG二核苷酸的CpG島處于非甲基化狀態，抑癌基因啟動子區CpG島過度甲基化可誘導基因轉錄失活、表達沉默。BNIP3是Bcl⁃2家族中BH3⁃only亞家族的成員，具有BH3結構域和跨膜區，屬于促凋亡蛋白，通過促進線粒體通透性、轉運開放和線粒體的損傷誘導凋亡。Murai等［3］在66%的結直腸癌和49%的胃癌中檢測到BNIP3表達缺失。Abe等發現在幾乎所有的胰腺癌組織和50%的胰腺癌細胞系中未檢測到BNIP3的表達，其失活機制和DNA啟動子區高度甲基化相關。

目前，國內關于BNIP3基因的甲基化研究基本都局限于甲基化特異PCR法，此方法的特點是靈敏度高，但只能對引物序列中少量CpG位點進行分析，具有一定的局限性。所以關于腫瘤細胞中BNIP3基因啟動子區甲基化的具點還不清楚。BSP克隆測序法具有能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態的優勢，是公認的DNA甲基化分析的金標準［7］。本研究利用MethPrimer軟件分析了MKN1細胞中BNIP3基因CpG位點分布情況。結果顯示，BNIP3基因啟動子區自轉錄起始點上游966bp至下游86bp之間CpG位點分布密集，存在長度為1052bp的CpG島。本研究中利用BSP克隆測序法對BNIP3基因啟動子區中（+21bp~-267bp）長288bp、包含14個CpG位點的DN段進行甲基化水平的檢測，甲基化率為80%~100%。因此，首次明確了胃癌MKN1細胞中BNIP3基因啟動子區的甲基化位點，并檢測到這些CpG位點呈現高度的甲基化。

我們進一步用去甲基化藥物處理MKN1細胞，以明確啟動子甲基化與BNIP3基因表達的關系。5⁃Aza⁃CdR是一種高效的DNMT抑制劑，它可與DNMT不可逆性結合，具有較強去甲基化作用，使表觀遺傳學沉默的基因去甲基化，逆轉其惡性表型。本研究發現，對照組MKN1細胞中BNIP3表達缺失，10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR可誘導BNIP3mRNA表達明顯增加，BNIP3基因的啟動子區CpG位點甲基化概率較對照組明顯下降，提示胃癌MKN1細胞中BNIP3基因表達缺失與啟動子區高甲基化關系密切，該區域的CpG位點甲基化在調控基因轉錄中發揮重要作用。

DNA甲基化是由DNMT催化完成的。DNMT1催化甲基基團與胞嘧啶環的結合，維持DNA復制過程中的甲基化模式，在表觀遺傳修飾中發揮重要作用，其活性及表達水平與腫瘤發生密切相關。近年研究報道，DNMT1通過與靶基因啟動子DNA序列結合，介導DNA甲基化，調節基因表達［12，13］。我們推測DNMT1是否參與介導BNIP3發生DNA甲基化的機制。我們利用ChIP技術檢測DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合狀態。結果顯示，MKN1細胞中DNMT1能與BNIP3啟動子區DNA結合。5⁃Aza⁃CdR能夠明顯抑制DNMT1與BNIP3啟動子的結合。提示5⁃Aza⁃CdR降低DNMT1與BNIP3啟動子區結合能力，部分逆轉BNIP3的甲基化狀態，是導致MKN1細胞中BNIP3表達上調的重要原因。

篇10

[關鍵詞]桔梗；同源四倍體；DNA甲基化；MSAP

[Abstract]In order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycodon grandiflorus.the diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 g?mL-1 dimethyl sulphoxide （DMSO）.The identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP）.The result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 g?mL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 32.0%.The diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexes.Totally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectively.The total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process.

[Key words]Platycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP

多倍體是指含有3套或3套以上完整染色體組的生物體[1]。由于多倍體將1個或多個整套染色體累加到基因組上，對生物體的基因組產生了一定沖擊，這種“基因組沖擊”使生物體的新陳代謝和基因調控等發生改變，從而使植株的形態器官、生理指標、遺傳特性等產生變異[2-5]，這些變異會增強植株的生態適應性和環境的抗逆性，降低蒸騰作用，提高光合效率等，對植株的生物量和某些次生代謝產物含量及品質有促進作用[6]。因此多倍體植物具有更大的生存潛能和更強的選擇優勢。研究表明，多倍化不僅能導致植物的基因組結構改變、堿基序列消除、轉座子激活等，還能影響表觀遺傳調控模式[7-8]。表觀遺傳變異是指不改變DNA堿基序的一種可遺傳的基因表達變化，包括DNA甲基化修飾、組蛋白的各種修飾等[9]，其中DNA甲基化修飾是研究多倍體表觀遺傳變異的最佳途徑之一[10]。DNA甲基化能在分子水平上對基因的表達進行調控，保護基因組結構的完整性，并控制冗余基因的表達，保持多倍體植物基因組的穩定性 [11-12]。多倍化能夠誘導DNA甲基化的改變，而DNA甲基化又在基因組調控和基因表達上起到一個樞紐的作用，因而用甲基化敏感擴增多態性技術（MSAP）研究不同倍性植株基因組DNA甲基化的表達水平及模式變化，在一定程度上對解釋多倍體植株出現的新的表型具有重要的意義。

目前多倍體方面的研究主要集中于異源多倍體的物種[13-16]，而對同源多倍體化后所產生的一系列變化方面的相關文章較少，這是因為異源多倍體化后較同源多倍體化后引起的變化更為明顯[17-18]。但是，異源多倍體帶來的雜交效應將混淆于倍性引起的后果[19]，因此，僅依賴于倍性調控變化方面的研究應通過同源多倍體來體現，揭示僅由基因組加倍而不涉及雜交等其他因素所造成的基因組沖擊以及隨后多個基因組趨于穩定的內在機制也需通過同源多倍體的研究來闡明。

桔梗為常用大宗藥材，具有開宣肺氣，祛痰排膿的功效[20]，在我國南北各地大面積栽培。但長期以來只種不選，導致品種退化，藥材產量和品質下降[21]。本研究在采用生物技術離體誘導并鑒定獲得桔梗同源四倍體的基礎上，采用甲基化敏感擴增多態性（MSAP）技術對二倍體和四倍體基因組DNA的甲基化變化情況進行分析，一方面為桔梗的品種選育提供材料，另一方面從表觀遺傳學的角度探討桔梗四倍體表型變化的分子機制，為多倍體育種提供一定的理論依據。

1材料

挑選籽粒飽滿的桔梗種子，經流水沖洗40 min后置于超凈工作臺，用75%乙醇消毒30 s后轉入0.1%升汞（HgCl2）中滅菌6 min，無菌水清洗3～5次，接入MS培養基，25～30 d后獲得桔梗無菌系。

2方法

2.1桔梗無菌快繁體系的建立和優化

以桔梗幼芽為材料，接種到增殖和生根培養基上，增殖培養基以MS為基本培養基，分別添加不同濃度6-BA（6-芐氨基嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）；生根培養基以1/2MS為基本培養基，并添加不同濃度NAA（α-萘乙酸）和IBA（吲哚丁酸）進行生根培養，試驗設計見表1，2。每個處理15個幼芽，5瓶重復，培養30 d后分別統計增殖系數和生根率。

2.2桔梗同源四倍體的離體誘導及鑒定

2.2.1桔梗同源四倍體的離體誘導具體方法參照王紅娟等[22]，并作適當調整。質量分數為0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液經20 mL的注射器和0.22 μm的水系濾頭抽濾滅菌后將桔梗不定芽浸泡在其中，置于震動搖床內處理12，24，36，48，60 h，然后用無菌水沖洗3次后接種到MS培養基中進行培養。以清水浸泡作為對照，共15個處理，每個處理15個幼芽，做5次重復。

2.2.2桔梗同源四倍體的鑒定采用形態鑒別、流式細胞儀分析和根尖染色體鑒定相結合的方法來確定倍性株系。先將形態變異明顯的植株進行流式細胞儀分析，具體方法參照張俊娥等[23]，稱取0.5 g組培苗葉片，用濾紙吸干水分后置于干凈培養皿中，加入2 mL預冷的組織解離液（80 mmol?L-1KCl，20 mmol?L-1NaCl，15 mmol?L-1Tris-HCl，20 mmol?L-1Na2EDTA，0.1% TritonX-100，2.0% PVP-K30，pH 7.5），用刀片一次性快速切碎葉片，過濾后于4 ℃環境下2 000 r?min-1離心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室溫下反應1 h后即可上樣測定。流式細胞儀鑒定的株系進一步采用根尖壓片法確定植株染色體數目。具體方法參照張振超等[24]，早上9：00～11：00點取幼苗根尖（0.5～1 cm），在0.002 mol?L-1的八羥基喹啉預處理2～3 h，于4 ℃冰箱中卡諾固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）處理24 h，在60 ℃的1 mol?L-1 HCL中解離8 min，卡寶品紅染色10 min，然后制片、鏡檢。

2.3總DNA提取

稱取0.5 g二倍體和四倍體桔梗試管苗幼葉，采用改良的CTAB法進行DNA提取，具體方法參照陳昆松等[25]，提取的DNA經紫外-可見分光光度計測定濃度和純度后用并1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，總DNA 置于-20 ℃冰箱待用。

2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.4.1酶切、鏈接反應MSAP試驗步驟參照Portis等[26]方法，用雙切酶組合EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoR Ⅰ/ MspⅠ對基因組DNA進行酶切，在酶切片段的兩端加上人工設計的與EcoRⅠ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切位點互補的人工接頭，然后用AFLP擴增體系進行擴增，接頭和引物序列見表3。引物由北京博友順生物科技有限公司合成。

2.4.2預擴增、選擇性擴增和電脈預擴增反應體系為20 μL，其中含有10 mmol?L-1 dNTPs 0.4 μL，10×Buffer 2 μL，5 U?μL-1Taq酶0.2 μL，10 μmol?L-1 E00-primer 0.5 μL，10 μmol?L-1 M00-primer 0.5 μL，其余用水補齊。反應條件為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26個循環，72 ℃延伸10 min。預擴增產物稀釋20倍，供選擇擴增用。

選擇擴增體系同預擴增體系，條件為：94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個循環，每個循環降0.7 ℃進行降式PCR 擴增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23個循環，72 ℃延伸10 min。

選擇性擴增完成后在擴增PCR產物中加入上樣緩沖液，94 ℃變性10 min 后然后立即轉移到冰上冷卻防止復性，取5 μL變性產物于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，銀染后觀察。

2.5條帶統計與數據處理

由于甲基敏感擴增多態性技術中分別用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ雙切酶對基因組DNA進行酶切。因此每個樣品同時擁有2條泳道：第1條泳帶采用EcoRⅠ/HpaⅡ進行酶切，記為H，第2條泳帶采用EcoRⅠ/ MspⅠ進行酶切，記為M。同一位點有條帶的記為“1”，無帶的記為“0”。

3結果與分析

3.1增殖及生根培養基優化

將長1.5～2 cm的桔梗不定芽接到7種增殖培養基中，經30 d培養后均出現不定芽增殖的現象，具體結果見表4，在4號培養基中，分化的芽數最多，增殖系數平均達9.3±0.24，且出芽整齊，生長健壯，葉色濃綠。因此，桔梗無菌苗增殖的最適培養基為MS+6-BA 1.5 mg?L-1+ NAA 0.3 mg?L-1。

生根培養基優化結果見表5，不同濃度的NAA和IBA對桔梗試管苗生根率、根生長狀況均有影響，隨著NAA和IBA濃度的增大，生根率逐漸降低，且出根不整齊，根細短。當培養基蔗糖含量為28 g?L-1，NAA質量濃度為0.6 mg?L-1時，平均生根率高達82.6±3.8，且根粗壯，整齊。由此可見，桔梗的最佳生根培養基為1/2MS+NAA 0.6 mg?L-1。

3.2桔梗同源四倍體的誘導結果

將桔梗不定芽用抽濾滅菌的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液浸泡處理后，成功得到了桔梗同源四倍體植株。誘導結果見表6，不同的質量濃度和處理時間對不定芽的誘導效果不同，低濃度和短時間處理下誘導率低，但成活率高，隨著質量濃度和處理時間的增加，誘導率逐漸提高，但不定芽成活率降低。根據四倍體植株的誘導率和成活率，篩選出最佳處理濃度和時間，即用0.1%的秋水仙素溶液處理48 h或0.2%的秋水仙素溶液處理12 h為桔梗同源四倍體誘導的最佳條件。

3.3桔梗同源四倍體的鑒定

一般而言，四倍體植株具有巨型化特征，將形態變異明顯的植株先經流式細胞儀分析后，再用根尖壓片法鑒定，見圖1。結果表明，桔梗二倍體植株根尖染色體數為2n=2x=18，DNA相對含量在100處有1個單峰；同源四倍體植株染色體數為2n=4x=36，DNA相對含量在200處有1個單峰，見圖2。

3.4桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化水平差異

MSAP技術中同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能識別并切割CCGG序列，但二者識別甲基化的位點不同，HpaⅡ能切割無甲基化和單鏈甲基化位點而不能切割雙鏈甲基化位點；MspⅠ能切割無甲基化和內甲基化位點而不能切割外甲基化位點，因此經HpaⅡ和MspⅠ切割后在聚丙烯酰胺凝膠電泳分析膠上能檢測出4種條帶類型，即：Ⅰ型，H，M都有帶，說明CCGG位點無甲基化；Ⅱ型，H有帶，M無帶，說明CCGG位點發生單鏈外甲基化，即半甲基化；Ⅲ，H無帶，M有帶，說明CCGG位點發生雙鏈內甲基化，即全甲基化；Ⅳ，H，M都無帶，說明CCGG位點有雙鏈內外側甲基化、雙鏈外甲基化或無CCGG序列[16]。桔梗二倍體和同源四倍體DNA經MSAP擴增的條帶數及甲基化水平見表7，用20對引物組合共擴增后共有1 586條條帶，其中二倍體764條，四倍體822條。二倍體總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為92.15%，61.52%，30.65%，而四倍體的為86.13%，54.38%，31.75%，與桔梗二倍體相比，其同源四倍體總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，這說明染色體加倍后其DNA甲基化水平發生了變化。

3.5桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化類型

二倍體和同源四倍體桔梗基因組DNA甲基化類型見表8，二倍體和四倍體共有15種條帶，見圖3。其中A型為單態性位點，包括3個亞類，表示二倍體與四倍體甲基化狀態相同；B型為去甲基化位點，包括5個亞類，說明在該位點二倍體存在甲基化，而四倍體發生了去甲基化；C型為過或超甲基化類型，也有5個亞類，即與二倍體相比，四倍體甲基化升高；D型為次甲基類型，有2個亞類，表示相比于二倍體來說，四倍體甲基化降低，但仍有甲基化現象[17]。與二倍體相比，桔梗試管苗染色體加倍后，其基因組DNA有23.54%發生了去甲基化現象，29.07%發生了過或超甲基化現象，2.97%發生了次甲基化現象，只有44.42%的基因組DNA未發生任何改變。

4討論與結論

4.1桔梗同源四倍體的離體誘導及鑒定

本研究中采0.2%抽濾滅菌的秋水仙素溶液浸P11～P20.其中的10對引物，每對引物下有4條泳道，從左往右依次為2H，2M，4H，4M；2H和4H分別表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切的擴增結果；2M和4M表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Msp Ⅱ酶切的擴增結果。

泡桔梗頂芽12 h，獲得了誘導率為32.0%的四倍體植株。高山林等[27]采用培養基中添加40 mg?L-1秋水仙素的方法誘導桔梗四倍體，誘導率達到37.5%；王小華等[28]采用0.1%秋水仙素處理桔梗嫩莖40 h，誘導率達到50%。前人誘導率較高的原因可能是在鑒定過程中僅用形態學和細胞學的方法鑒定倍性，并沒有排除嵌合體的干擾，從而將嵌合率也計算到誘導率中，出現誘導率較高的現象，本研究采用了形態鑒別、流式細胞儀分析和根尖染色體鑒定相結合的方法進行倍性鑒定，排除了嵌合體的干擾，提高了結果的可靠性，為進一步研究桔梗同源四倍體的遺傳穩定性和農藝性狀評價提供可靠的材料。

4.2桔梗二倍體與四倍體基因組DNA甲基化水平差異及模式變化

多倍體植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性強等優點，這可能是多倍化后植物體內基因組結構和表觀遺傳修飾發生了廣泛變化[3]，進而導致植物出現新的性狀。但在對擬南芥[5]、水稻[29]、白菜[18]的同源多倍體及二倍體的比較研究中發現這些植物同源多倍化后基因組結構并沒有發生明顯改變，且多倍化后多倍體的基因表達譜也與二倍體十分相似。表明同源多倍化后基因組并沒有同異源多倍化一樣發生大規模的基因組結構調整事件。本研究中，從圖1可以明顯看出桔梗同源四倍體比二倍體植株粗大，葉片增厚增大，葉柄葉脈粗大等現象，同源多倍體桔梗新出現的區別于親本的性狀則可能與表觀遺傳調控密切相關。

甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾形式，在基因表達中起著重要的調節作用，同源多倍化過程中，DNA甲基化會參與多倍體的適應性調整，并發生特異性的變化以調控基因表達和轉座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平會發生一定程度的改變[29]。楊嵐等[30]采用MSAP技術對甜葉菊同源四倍體與二倍體的表觀遺傳進行研究后發現四倍體基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以過和超甲基化為主；長春花[31]多倍化后基因組CCGG位點的 DNA的總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率較二倍體植株均有所提高，甲基化類型以C型即過或超甲基化類型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率有所降低，其中總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以過或超甲基化類型（C型）為主，占29.07%，其次是去甲基化（B型），占23.54%，最少的是次甲基化（D型），占2.97%。由此可推測同源四倍體出現新的表型與DNA甲基化模式的重新調整尤其是大量過或超甲基化變異有關，過或超甲基化就可能導致相應位點所在基因表達的關閉或抑制，進而維持四倍體植株這自身基因組的穩定性。有關染色體加倍后DNA甲基化模式調整的程度對多倍體性狀和表型改變的機制還有待進一步的研究。

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