表觀遺傳學(xué)研究方法范文

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>> 成癮相關(guān)記憶的表觀遺傳學(xué)機制 愈肝顆粒對大鼠肝癌的抵制作用及其表觀遺傳學(xué)機制 自身免疫疾病的表觀遺傳學(xué) 表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展 表觀遺傳學(xué)與人類健康 表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展 表觀遺傳學(xué)與食管癌相關(guān)性研究進(jìn)展 表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究現(xiàn)狀及其存在的問題 表觀遺傳學(xué)在抗腫瘤領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀及前景 研究生《表觀遺傳學(xué)》課程的教學(xué)改革與探索 表觀遺傳學(xué)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用 表觀遺傳學(xué)標(biāo)記在急性白血病微小殘留病檢測中的臨床意義 急性髓細(xì)胞白血病表觀遺傳學(xué)的靶向性和個體化治療策略 淺析表觀遺傳學(xué)在高中生物課程中的教育價值及其實現(xiàn) 神奇的遺傳學(xué) 遺傳學(xué)的未來 表觀遺傳學(xué)有助解釋妊娠高血壓 關(guān)于遺傳學(xué)教學(xué)的思考 遺傳學(xué)中的數(shù)學(xué)思想 遺傳學(xué)的概率計算 常見問題解答 當(dāng)前所在位置：l）。有很多基于亞硫酸氫鹽（bisulfite）處理DNA的檢測啟動子甲基化的方法，其原理是亞硫酸氫鹽修飾將去甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，但留下甲基化的胞嘧啶不變。在隨后通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增CpG區(qū)域時，尿嘧啶被轉(zhuǎn)化到胸腺嘧啶，而從甲基化的胞嘧啶則在此過程之中保持不變。甲基化和去甲基化的胞嘧啶之間的區(qū)別可能是胞嘧啶和胸腺嘧啶之間的區(qū)別，最初甲基化的程度可以由Pyrosequencing TM技術(shù)計算。最近亞硫酸氫鹽測序、（定量）甲基化特異性PCR（MSP， methylation-specific PCR）、甲基化敏感單克隆核苷酸引物延伸（Ms-SNuPE，methylation-sensitive single nucleotide primer extension）等技術(shù)也普遍用于基因的甲基化測定。另有一些技術(shù)可以用于研究全基因組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。例如利用特異性識別甲基化胞嘧啶的抗體進(jìn)行免疫沉淀實驗，后進(jìn)行質(zhì)譜測定；另一方面也利用DNA結(jié)合蛋白抗體或組蛋白的特異性修飾抗體，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP，chromatin immunoprecipitation）測定，后進(jìn)行DNA測序。更新的技術(shù)可以結(jié)合芯片，進(jìn)行高通量的實驗設(shè)定。

迄今為止，有關(guān)于神經(jīng)性疼痛模型的表觀遺傳學(xué)研究數(shù)量并不是很多。從以往的研究報道來看，DNA甲基化、組蛋白乙酰化和非編碼RNA的調(diào)控模式在神經(jīng)性疼痛的發(fā)生、發(fā)展及其維持的各個環(huán)節(jié)都有發(fā)生非常明顯的改變并發(fā)揮著極其重要的作用。在未來的研究中，我們將進(jìn)一步的探索表觀遺傳學(xué)參與神經(jīng)性疼痛的調(diào)控的分子機制，研究相關(guān)的修飾程序是如何帶來了持久而長期的痛覺異常和痛覺過敏的，并為以后進(jìn)一步的深入研究神經(jīng)慢性病理性疼痛是如何發(fā)生、發(fā)展與維持打下基礎(chǔ)，并為其后續(xù)的控制、治療提供新的作用靶點。

*通訊作者：陳恒玲

參考文獻(xiàn)

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基因組印記

基因組印記是一種不遵循傳統(tǒng)孟德爾遺傳規(guī)律的表觀遺傳現(xiàn)象。這是由于來源于某一親本的等位基因或其所在的染色體發(fā)生了表觀遺傳修飾，導(dǎo)致不同親本來源的兩個等位基因在子代細(xì)胞中表達(dá)不同。受印記機制調(diào)控而差異表達(dá)的基因稱之為印記基因（imprintedgene）。目前在植物、昆蟲和哺乳動物中均發(fā)現(xiàn)了基因組印記現(xiàn)象，而在鳥類、魚類、爬行類和兩棲類動物普遍認(rèn)為不存在印記現(xiàn)象。1991年Bartolomei等采用基因敲除技術(shù)在小鼠中首次確認(rèn)了類胰島素生長因子2型受體和非編碼RNAH19基因兩個母源印記基因及一個類胰島素生長因子2型父源印記基因。2007年，杜克大學(xué)的研究人員用機器學(xué)習(xí)的人工智能形式發(fā)現(xiàn)了156個新的印記基因，并以此為基礎(chǔ)創(chuàng)造了第一張人類基因組印記基因圖譜。

X染色體失活

X染色體失活是指雌性哺乳類細(xì)胞中兩條X染色體的其中之一失去活性的現(xiàn)象，X染色體會被包裝成異染色質(zhì)，進(jìn)而因功能受抑制而沉默化，這種現(xiàn)象也稱為X染色體的劑量補償（dosagecompensation）。X染色體失活的起始和選擇發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期，這個過程被X染色體失活中心（X-inactivationcenter，XIC）所控制，是一種反義轉(zhuǎn)錄的調(diào)控模式。這個失活中心存在著X染色體失活的特異性轉(zhuǎn)錄基因，當(dāng)失活命令下達(dá)時，這個基因產(chǎn)生1個17kb不翻譯的RNA與X染色體結(jié)合，介導(dǎo)DNA甲基化和組蛋白修飾，引發(fā)并維持X染色體的失活。X染色體失活中心還有“記數(shù)”功能，即保持每個二倍體中僅有1條X染色體有活性，其余全部失活。X染色體的失活狀態(tài)需要表觀遺傳修飾來維持，可以通過有絲或減數(shù)分裂遺傳給后代。

非編碼RNA

非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白質(zhì)的功能性RNA分子，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA等多種已知功能的RNA以及未知功能的RNA。按照它們的大小可分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA，前者在基因簇以至于整個染色體水平發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，后者在基因組水平調(diào)控基因表達(dá)并介導(dǎo)mRNA的降解，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，決定細(xì)胞的分化命運，還對外源的核酸序列有降解作用以保護(hù)本身的基因組。microRNA是一類內(nèi)源產(chǎn)生的長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA分子，廣泛存在于真核生物甚至病毒中，通過調(diào)節(jié)編碼蛋白的基因的表達(dá)或翻譯來發(fā)揮調(diào)控作用。microRNA的功能十分廣泛并且滲入到了生理病理學(xué)的各種調(diào)控途徑中，包括發(fā)育周期、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、新陳代謝、神經(jīng)調(diào)控、腫瘤發(fā)生以及病毒和宿主的相互作用等。在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，由于降解后的片段長度過小，不能進(jìn)行有效的PCR擴增，然而microRNA就能滿足降解檢材的PCR擴增，開始成為關(guān)注的熱點。

表觀遺傳學(xué)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1表觀遺傳學(xué)與親權(quán)鑒定

自1985年英國遺傳學(xué)家AlecJeffreys教授首次報道DNA指紋圖技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)DNA分析以來，DNA分析技術(shù)已經(jīng)在多起重大的刑事犯罪偵破和民事訴訟中發(fā)揮重要的作用。目前主要是以熒光標(biāo)記STR與SNP等傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記進(jìn)行個體識別和親權(quán)鑒定。但在法醫(yī)學(xué)親子鑒定中，尤其是子代為雜合子或者父（母）和子代為相同的雜合子的單親鑒定中，親代的必需等位基因可能無法確定，使基因座的鑒別能力下降。但通過使用親緣特異性甲基化遺傳標(biāo)記可以直接判定等位基因的親源，從而確定親代的必需等位基因。Zhao等應(yīng)用甲基化特異性PCR對被甲基化標(biāo)記的母系SNP位點rs220028進(jìn)行檢測證明了這一觀點。另外，Poon等報道，采用DNA甲基化標(biāo)記可有效識別孕婦外周血中的胎兒DNA，這也為產(chǎn)前的親權(quán)鑒定提供了一種非侵入性的檢測方法。

2表觀遺傳學(xué)與年齡推斷鑒定

個體年齡推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。目前實際工作中，個體年齡推斷主要依據(jù)人類學(xué)方法，通過測量與年齡相關(guān)的骨骼、牙齒標(biāo)志等，根據(jù)相關(guān)模型進(jìn)行推算。近年來，許多研究者發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)為個體年齡推斷的研究提供了一種新的思路。DNA甲基化隨年齡變化的特點為利用甲基化標(biāo)記進(jìn)行年齡推斷提供了可能。陳培利等利用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞（humanembryoniclungdiploidfibroblast，2BS）進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其p16基因啟動子區(qū)及外顯子Ⅰ處的DNA甲基化水平隨個體細(xì)胞代齡的增加而降低。Tra等用限制性標(biāo)記基因組掃描（restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS）技術(shù)對T淋巴細(xì)胞2000個基因座的甲基化年齡變化情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)29個基因座有變化，其中23個增加，6個降低。由于甲基化標(biāo)記數(shù)目眾多，從中可以篩選出一組適合于法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的、年齡變化有規(guī)律的座位，應(yīng)用于微量檢材的年齡推斷。尹慧等用高效液相色譜（HPLC）法對94個健康個體DNA甲基化水平的檢測發(fā)現(xiàn)，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）含量隨年齡增加而降低，50歲以上與50歲以下年齡組5mC含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2010年，Teschendorff等通過對261個絕經(jīng)后婦女全血樣本約14000個基因啟動子區(qū)超過27000個CpG的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，證實干細(xì)胞多梳蛋白家族（polycombgroup，PcG）靶基因比非靶基因更容易隨年齡發(fā)生甲基化，并且變化不依賴于組織類型、疾病狀態(tài)和甲基化水平。

Bocklandt等通過分析唾液中的DNA甲基化標(biāo)記，可以預(yù)測一個樣本組成員的年齡，結(jié)果與實際年齡相差大約在5歲范圍內(nèi)。這項技術(shù)如果被確證，可能會成為法醫(yī)取證方面很有用的一種工具。同時，它還表明了一種可能性：DNA甲基化修飾或許可以提供一種比計算生日更具醫(yī)學(xué)相關(guān)性的年齡測定方法。

2010年，NorenHooten等在外周血單核細(xì)胞中的800個microRNA標(biāo)記中篩選出9個與年齡相關(guān)的基因，但發(fā)現(xiàn)其中5個與疾病有關(guān)，該研究表明microRNA可以作為推斷年齡以及和年齡相關(guān)疾病的診斷指標(biāo)。

2011年，國內(nèi)Jin等首次報道了通過體細(xì)胞發(fā)揮功能的組蛋白修飾基因?qū)λダ线@一重要生物學(xué)過程的調(diào)控作用。這項研究通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)組蛋白H3K27me2/3去甲基酶UTX-1/UTX對衰老發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。在秀麗線蟲中，該基因的雜合突變體及野生型的RNAi敲降后都能極大地延長線蟲壽命，使其抗逆性也大大加強。遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其功能依賴于胰島素樣信號通路。這種通過重新建立組蛋白修飾模式的方式，揭示了細(xì)胞的重編程在抑制衰老過程中的重要作用，并提示其作用機制在哺乳動物細(xì)胞中同樣存在。

3表觀遺傳學(xué)與雙生子的鑒別

同卵雙生子（monozygotictwins，MZ）是由一個受精卵經(jīng)過卵裂產(chǎn)生兩個單獨的細(xì)胞，并發(fā)育為完全獨立的個體，因此同卵雙生兩個個體的遺傳背景完全相同，享有共同的DNA序列。在法醫(yī)DNA分析領(lǐng)域，現(xiàn)有的DNA分析手段尚不能有效鑒別同卵雙生個體。

但是近年來，眾多研究都已證實，同卵雙生子的表觀遺傳學(xué)水平存在一定的差異。Fraga等對西班牙的40對同卵雙生子個體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)他們在DNA甲基化、X染色體失活、組蛋白位點特異性乙酰化上存在差異，并且這種差異會隨年齡增長而增加。Kaminsky等對114對同卵雙生子個體的DNA甲基化的研究顯示，血白細(xì)胞、口腔黏膜上皮細(xì)胞和腸道組織中的甲基化狀態(tài)均存在差異。

此外，Ollikainen等對新生兒不同組織相關(guān)的4個差異甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)甲基化水平存在顯著差異。從上述研究成果中可以看出，研究人員已經(jīng)把目光投入到了法醫(yī)DNA分析的全新領(lǐng)域，尤其是DNA甲基化在同卵雙生子中的研究。這些都為采用DNA甲基化這一表觀遺傳學(xué)標(biāo)記進(jìn)行同卵雙生子個體甄別的可能性提供了強有力的理論支撐。

4表觀遺傳學(xué)與組織來源鑒定

在常見的法醫(yī)學(xué)案件中，有時需要對生物檢材的組織來源進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)和生化方法信息含量少，容易受各種條件的影響，因此常常受到限制。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，以表觀遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的組織鑒定方法存在明顯優(yōu)勢，越來越為人們所關(guān)注。

例如，富含CpG的Alu重復(fù)序列，在體細(xì)胞中是甲基化的，在生殖細(xì)胞中卻是低甲基化的，有一個在進(jìn)化上比較年輕的Alu亞族在中幾乎是完全沒有甲基化的。通過對這一Alu亞族甲基化的分析，就可以判斷檢材是否含有。范光耀應(yīng)用聯(lián)合亞硫酸氫鹽的限制酶法，調(diào)查、常見體液、分泌液和組織的DEAD盒多肽4［DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）boxpolypeptide4，DDX4）］基因啟動子甲基化水平，發(fā)現(xiàn)中的甲基化水平顯著高于非組織。因此，選擇一個合適的界值，可以根據(jù)DDX4甲基化水平有效地鑒別（斑）的種屬來源。

Hanson等運用RT-PCR技術(shù)，根據(jù)microRNA的細(xì)胞組織特異性對血液、、唾液、陰道分泌液和經(jīng)血進(jìn)行來源鑒別，并通過與21種人體組織比對驗證了各種斑痕microRNA表達(dá)的特異性，用于檢測RNA的模板量最低可達(dá)50pg。Zubakov等運用微陣列和Taqman定量PCR技術(shù)確證了一些能運用于法醫(yī)學(xué)實踐識別血痕和精斑的穩(wěn)定的microRNA標(biāo)記。該項研究不僅將靈敏度提高到相當(dāng)于單細(xì)胞水平的0.1pgRNA模板量，而且在新鮮與陳舊樣本的比對中發(fā)現(xiàn)其microRNA分子絕對含量未發(fā)生明顯變化。

5其他

近年來，隨著學(xué)者們對RNA在法庭科學(xué)領(lǐng)域的研究逐漸廣泛和深入，發(fā)現(xiàn)microRNA在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價值也日益重要。2007年王芬等發(fā)現(xiàn)有6個microRNA分子在H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡后表達(dá)顯著下調(diào)，這一結(jié)果為法醫(yī)病理學(xué)者研究腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機制提供了理論依據(jù)。2010年李文燦等在研究大鼠心肌組織microRNA降解與死亡時間的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，其含量在機體死后120h內(nèi)保持相對穩(wěn)定的水平，可作為內(nèi)參指標(biāo)反映其他生物指標(biāo)的變化水平。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，法醫(yī)工作者又面臨一項新的挑戰(zhàn)，即如何在日常的親緣鑒定和個體識別工作中有效甄別偽造DNA。用于偽造DNA常使用PCR擴增的方法，因此使用親緣特異性甲基化遺傳標(biāo)記，可以在進(jìn)行親子鑒定和個體識別的同時，檢測樣本的甲基化狀態(tài)，從而鑒別樣本是否為人工偽造DNA。因此DNA甲基化遺傳標(biāo)記在鑒定DNA是否人工偽造中發(fā)揮著重要的作用。

篇3

關(guān)鍵詞 硒 表觀遺傳修飾 表觀標(biāo)志物抑制劑 抗癌藥 開發(fā)

中圖分類號：R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）03-0075-04

Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*

ZHU Huiqiu1**， HUA Yan1， WANG Mingli2***

（1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd.， Hefei 230000， China； 2. Anhui Medical University， HeFei 230032， China）

ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.

KEy WORDS selenium； epigenetic modification； inhibitors of epigenetic markers； anti-cancer drugs； development

硒最重要的生物學(xué)功能是抗癌，并以多種機制發(fā)揮其抗癌作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，硒又可對表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制異化產(chǎn)生干預(yù)影響，特別是對在腫瘤發(fā)生機制中的特異性靶點進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而阻抑腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。硒化物是某些腫瘤特異性表觀標(biāo)志物有效的抑制劑。硒的這個功能不僅對臨床腫瘤診斷、治療、預(yù)防具有現(xiàn)實意義，更為“含硒表觀靶向抗癌藥物”開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。“含硒表觀靶向抗癌藥物”是期待開發(fā)的新型抗癌藥。現(xiàn)就近些年在這些方面的相關(guān)研究作一簡要介紹。

1 表觀遺傳學(xué)

什么是表觀遺傳學(xué)？從孟德爾遺傳規(guī)律講，親代（一代）把遺傳信息傳遞給子代（二代），主要由攜帶遺傳信息的脫氧核糖核酸（DNA）分子中堿基的排列順序（即堿基序列）來決定，并在細(xì)胞核內(nèi)遺傳。但人們在研究中發(fā)現(xiàn)，在DNA堿基序列以外還有一套調(diào)控機制，包括 DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA等，它們在不涉及改變DNA堿基序列的情況下，影響轉(zhuǎn)錄活性并調(diào)控基因的表達(dá)，改變機體的性狀，并且是一種可以預(yù)和逆轉(zhuǎn)的遺傳機制。這種非孟德爾遺傳現(xiàn)象，稱作表觀遺傳學(xué)[1-2]。

2 硒對表觀遺傳修飾異常產(chǎn)生干預(yù)及逆D作用

腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要生物學(xué)原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究顯示，DNA甲基化水平同這些基因的表達(dá)密切相關(guān)。通常情況下，甲基化水平同基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，甲基化程度越高，基因表達(dá)活性越低，甲基化程度越低，基因表達(dá)越活躍[4]。

DNA甲基化主要表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平降低和局部CpG島[在哺乳動物中富含胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）二核苷酸的一段DNA稱為CpG島]甲基化程度的異常升高，人類基因組的甲基化主要發(fā)生在CpG島[5]。

研究表明，實體瘤普遍存在基因組廣泛低甲基化現(xiàn)象，低甲基化使原癌基因活化，癌細(xì)胞異常增殖；低甲基化還使腫瘤轉(zhuǎn)移增加，例如胃癌的甲基化水平越低，癌細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的傾向越明顯[6]。

CpG島的甲基化程度異常升高，會導(dǎo)致某些抑癌基因表達(dá)沉默，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在正常情況下，CpG島為非甲基化。當(dāng)腫瘤抑癌基因的啟動子區(qū)域（CpG島）過度甲基化，就會使抑癌基因的表達(dá)沉默。其間DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）家族中的DNMT1發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它的高表達(dá)導(dǎo)致抑癌基因在CpG島失活。所以，CpG島高甲基化成了多種腫瘤特異性表觀標(biāo)志物，已成為臨床多種腫瘤早期診斷的依據(jù)和指標(biāo)[7]。

近年來，作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制之一的組蛋白修飾在腫瘤研究領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。組蛋白乙酰化由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同調(diào)控，而編碼HAT或HDAC的基因如果發(fā)生染色體易位、擴增等突變會導(dǎo)致某些腫瘤的發(fā)生。

可見，DNA甲基化和組蛋白乙酰化等表觀遺傳修飾異常是腫瘤發(fā)生的另外一個機制。而近年研究發(fā)現(xiàn)，硒通過靶向干預(yù)可逆轉(zhuǎn)甲基化和乙酰化異常的過程，從而抑制腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。硒化物成了潛在的治癌新藥物，是亟待開發(fā)、臨床應(yīng)用前景可觀的“含硒表觀靶向抗癌藥物”。

2.1 硒對DNA甲基化產(chǎn)生干預(yù)作用

研究表明，膳食硒通過干預(yù)表觀遺傳過程顯示出其抗癌潛力，膳食缺硒時組織呈現(xiàn)整體低甲基化[8]。Davis等[9]早些時候研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠喂食缺硒膳食，其肝臟和結(jié)腸都出現(xiàn)顯著DNA低甲基化，而經(jīng)硒處理的人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2 DNA甲基化水平顯著高于未經(jīng)硒處理的對照組，據(jù)此研究者認(rèn)為，膳食缺硒會增加肝臟和結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。Remely等[8]研究表明，膳食硒營養(yǎng)缺乏會引起動物組織和人體結(jié)腸癌DNA低甲基化。我國學(xué)者徐世文等[4]通過實驗也發(fā)現(xiàn)，飼料硒缺乏可導(dǎo)致雞肌肉組織 DNA甲基化水平降低。硒對DNMT有抑制作用，缺硒會導(dǎo)致DNMT活性增加，使原癌基因活化，引起結(jié)腸癌等多種腫瘤發(fā)生。保持硒等營養(yǎng)素均衡攝入，有利于維持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。

CpG島DNMT1的高表達(dá)是使抑癌基因失活的重要機制。抑制DNMT1靶酶活性，使失活的抑癌基因復(fù)活，是腫瘤治療中探索的新途徑。硒在多種腫瘤中有去甲基化的生物學(xué)功能，能誘導(dǎo)失活的抑癌基因重新活化和表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，硒可以直接干預(yù)DNA甲基化，抑制腺癌細(xì)胞株DNMT的高表達(dá)[8]。膳食硒干預(yù)DNA甲基化的方式之一是通過去甲基化過程來調(diào)節(jié)DNMT1活性的；研究還證實，亞硒酸鈉和苯甲基氰酸硒（BSC）、1，4-苯雙（亞甲基）氰酸硒（p-XSC）兩種合成硒化物對人大腸癌細(xì)胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。

各方面的研究驗證，硒對DNA甲基化產(chǎn)生干預(yù)影響，是靶酶DNMT有效的抑制劑。

2.2 硒干預(yù)影響組蛋白的乙酰化

近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰化酶與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。HDACs家族中的HDAC1高表達(dá)可明顯增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力。在食管鱗癌、前列腺癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)HDAC的高表達(dá)，靶酶HDAC已成為首選的攻擊靶點。

目前，人們通過體內(nèi)、體外的研究鑒定出了硒、丁酸鹽、曲古抑菌素A（TSA）等一些HDAC的抑制劑，這些抑制劑可在體外誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的生長停滯、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通過臨床試驗表明，HDAC抑制劑對人體白血病及實體瘤進(jìn)行治療，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤增殖效果，研究者認(rèn)為，各類HDAC抑制劑是另一類新型抗癌藥物、“癌癥治療的新工具”。

Xiang等[12]的研究證明，硒可以通過下調(diào)DNMT和抑制HDAC活性，活化人前列腺癌LNCaP細(xì)胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1， APC和CSR1。這些基因是具有保護(hù)免受氧化損傷的抗癌活性物質(zhì)、化學(xué)致癌物解毒劑或腫瘤抑制劑。

甲基硒酸（MSA）是近年來新研制成的一種人工低分子量有機硒化合物，是很具潛力的抗癌制劑。Kassam等[13]通過對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系（DLBCL）w外研究首次發(fā)現(xiàn)，MSA可以抑制該細(xì)胞系HDAC的活性。研究者認(rèn)為，有關(guān)MSA抑制HDAC活性的作用以前從未報道過，從而為人們提供了硒元素一種新的機制，MSA是日后臨床試驗中可以使用的硒化物。

我國科研人員胡琛霏[2]通過蛋白質(zhì)免疫印跡的方法，檢測到MSA可抑制食管鱗癌細(xì)胞系HDAC的活性，降低HDACl和HDAC2的蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙酰化水平顯著升高；同時，還檢測到硒甲硫氨酸（SLM）對食管鱗癌細(xì)胞系KYSEl50細(xì)胞和MCF7細(xì)胞的作用，在SLM處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中組蛋白去乙酰化酶的活性也顯著降低。

這些年，越來越多的含硒組蛋白去乙酰化酶抑制劑被發(fā)現(xiàn)和驗證。亞硒酸鈉、酮C甲基硒丁酸鹽（KMSB）、甲基硒代半胱氨酸（MSC）、甲基硒丙酮酸（MSP）等硒化物都可以抑制HDAC活性，提高組蛋白乙酰化水平，作為潛在的HDAC抑制劑，發(fā)揮其抗腫瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介紹，KMSB 和 MSP在體外作為HDAC的競爭性抑制劑發(fā)揮抗癌作用；還報道，合成的SAHA含硒類似物（5-苯甲酰戊氰硒）二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒對不同肺癌細(xì)胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸類HDAC抑制劑，是目前在臨床上以皮膚T淋巴細(xì)胞瘤（CTCL）為適應(yīng)癥而廣泛應(yīng)用的表觀靶向抗癌藥物。這也提示，含硒類抑制劑對靶酶HDAC抑制效果優(yōu)于無硒類抑制劑。

為何上述各種硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性，研究發(fā)現(xiàn)不管其結(jié)構(gòu)如何改變，硒都是這些化合物生物活性的中心元素，發(fā)揮著關(guān)鍵作用，硒的這一生物學(xué)功能對含硒抗癌藥物的開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義[16]。

2.3 硒對非編碼RNA調(diào)控機制產(chǎn)生干預(yù)效應(yīng)

表觀遺傳學(xué)的一個重要調(diào)控機制是非編碼RNA。非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白質(zhì)的RNA分子。近年來，非編碼RNA一族中的微小RNA-200（miR-200）受到人們的高度關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族中的成員微小RNA-200a（miR-200a）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，miR-200a在腫瘤組織中呈現(xiàn)明顯低表達(dá)。因此，miR-200a的表達(dá)下調(diào)是腫瘤發(fā)生的重要因素之一，miR-200a也成了腫瘤特異性表觀標(biāo)志物[17]。

胡琛霏[2]通過TaqMan芯片，檢測了MSA處理食管鱗癌細(xì)胞后細(xì)胞中微小RNA（miRNA）的變化情況，發(fā)現(xiàn)MSA可以上調(diào)細(xì)胞中miR-200a 的表達(dá)水平，miR-200a 表達(dá)升高后，負(fù)性調(diào)控Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）的表達(dá)，使Keap1蛋白水平下降，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白水平并提高其轉(zhuǎn)錄活性（Nrf2活性受其細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白Keap1的調(diào)控），從而活化Keap1-Nrf2信號通路。而Keap1-Nrf2信號通路在抗氧化、預(yù)防腫瘤發(fā)生等諸多方面有重要作用[18]。

體外研究顯示[19] ，人腦膜瘤組織中miR-200a表達(dá)明顯低于正常組織，β-循環(huán)蛋白（β-catenin）和其下游靶基因細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)顯著增高，二者和miR-200a呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，上調(diào)miR-200a可降低β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而阻斷Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路來抑制腦膜瘤的生長。胡琛霏課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)MSA可以抑制食管鱗癌細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)[2] 。研究已證實，Wnt/β-catenin信號通路的激活和高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[20]。

由此可見，MSA可能介導(dǎo)、調(diào)控著miR-200a表達(dá)及參與復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而抑制腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。

3 展望

加強硒與表觀遺傳學(xué)之間關(guān)聯(lián)的研究，有著重要的生物醫(yī)學(xué)意義。它有可能解釋硒化學(xué)抗腫瘤的新機制，從理論上證明硒元素可能具有表觀遺傳學(xué)的效應(yīng)[21] 。綜上所述，硒在腫瘤形成中對表觀遺傳修飾異常產(chǎn)生干預(yù)影響，靶向抑制腫瘤特異性表觀標(biāo)志物，逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾發(fā)生異化過程，使我們認(rèn)識了硒化學(xué)抗癌的新機制、新作用，硒化物是潛在開發(fā)的新型靶向抗癌藥物。Fernandes 等[15]指出，硒化物都是癌癥治療藥。目前，非表觀類含硒靶向抗癌藥如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已進(jìn)入臨床研究[16]，展示出很有希望的臨床應(yīng)用前景。而含硒表觀靶向抗癌藥物是亟待開發(fā)的抗癌藥“富礦”，加快開發(fā)含硒表觀靶向抗癌藥物，可為臨床腫瘤治療增加一種“新的工具”，為癌癥患者戰(zhàn)勝病魔增添一份新的希望。人們熱切期盼“含硒表觀分子靶向抗癌藥物”早日問世。

致謝：本課題研究得到華中科技大學(xué)徐輝碧、黃開勛兩位教授和安徽醫(yī)科大學(xué)張文昌碩士的支持，在此表示衷心感謝。

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篇4

[關(guān)鍵詞]　表觀遺傳學(xué)；抑癌基因；DNA甲基化；胃癌

[中圖分類號]　R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]　A [文章編號]　1673-9701（2012）36-0012-02

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程。眾所周知，腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因為原癌基因的激活和抑癌基因的失活，目前越來越多的證據(jù)表明，其發(fā)生機制除遺傳學(xué)改變外，表觀遺傳學(xué)改變也占有非常重要的地位。目前在表觀遺傳學(xué)機制中研究最多的是DNA甲基化。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制與DNA甲基化狀態(tài)的改變密切相關(guān)。

1　表觀遺傳學(xué)與胃癌

表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）是指基于非基因序列改變所致的基因表達(dá)水平變化，主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)構(gòu)象改變和組蛋白修飾等[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶5位碳原子上[2]。

腫瘤中的表觀遺傳學(xué)改變是由Feinberg和Vogelstein兩位科學(xué)家于1983年首次描述的，他們發(fā)現(xiàn)在腫瘤中同時存在兩個互相矛盾的表觀遺傳現(xiàn)象，即全基因組低甲基化和局部高甲基化[3]。研究表明，全基因組的低甲基化可以導(dǎo)致ras、c-myc等原癌基因激活，而DNA啟動子區(qū)CpG島的高甲基化可以導(dǎo)致p16、APC等抑癌基因失活，兩者協(xié)同作用，從而促使腫瘤的發(fā)生。

胃癌（gastric　cancer，GC）由于其患病率高、預(yù)后差、有限的治療選擇等，仍然是全球范圍內(nèi)一個重要的臨床挑戰(zhàn)。雖然胃癌的發(fā)病率逐年下降，但它仍然是癌癥死亡的第二大原因和四個最常見的惡性腫瘤之一[4]。研究表明，相比其他類型的癌癥（如大腸癌），胃癌中基因突變的頻率相對較低，而以DNA甲基化為主的表觀遺傳改變卻發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

2　抑癌基因甲基化與胃癌

目前，DNA甲基化研究最深入的方向是抑癌基因（tumor　suppressor　genes，TSGs）的異常甲基化。Bird等研究發(fā)現(xiàn)DNA啟動子區(qū)CpG島甲基化可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抑癌基因失活。從此，表觀遺傳改變在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用受到了人們的高度重視，并成為了研究的熱點[4]。人類基因組中，約有50%基因的啟動子區(qū)5'端富含CpG，這種區(qū)域稱為CpG島（CpG　island），其長度不小于500　bp、GC含量不少于55%。CpG島在正常情況下一般處于非甲基化狀態(tài)，當(dāng)其發(fā)生甲基化時，基因的空間結(jié)構(gòu)也隨之改變，表達(dá)受到抑制。

越來越多的研究證實，胃癌的發(fā)生與抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的異常高甲基化密切相關(guān)[5，6]。目前已知胃癌中，包括p16、APC、CDH1、RASSF1A、CHFR、DAPK、PTEN和RUNX3等數(shù)十個抑癌基因，均是由于高甲基化而失活的[7]。這些基因參與DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個細(xì)胞生理過程，與胃癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。以下是幾個近年來研究較熱門且具有代表性的抑癌基因。

2.1　PTEN基因

PTEN基因定位于人染色體10q23.3，由9個外顯子組成，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有磷酸酯酶的活性。PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，PTEN基因在多系統(tǒng)惡性腫瘤中均表達(dá)下降，均與DNA異常高甲基化有關(guān)。Liu　S等[8]對56例胃癌標(biāo)本中PTEN基因mRNA表達(dá)及啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示胃癌組織PTEN基因表達(dá)較癌旁正常組織明顯下降（P　＜　0.01），甲基化率48.2%明顯高于癌旁正常組織3.6%（P　＜　0.01），說明PTEN基因甲基化可能是其低表達(dá)的原因。

2.2　RASSF1A基因

RASSF1A基因位于人染色體3p21.3區(qū)域位點，內(nèi)含編碼340個氨基酸的開放閱讀框，編碼相對分子質(zhì)量38　800　Da的蛋白多肽，通過參與抑制Ras/RASSF1/ERK通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞的凋亡、維持微血管穩(wěn)定性[9]。其表達(dá)失活，可以使胃黏膜細(xì)胞凋亡受抑，并向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究證實，RASSF1A基因在肺癌、胃癌、乳腺癌等多種實體瘤中均存在甲基化導(dǎo)致的表達(dá)失活。林海等[10]檢測出RASSF1A基因在62例胃癌標(biāo)本較56例正常組織中的mRNA表達(dá)明顯下降（P　＜　0.01），甲基化率分別為66.1%和23.2%，癌組織甲基化率是正常組織的2.80倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P　＜　0.01），表明RASSF1A基因高甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)降低的原因。

2.3　RUNX3基因

RUNX3基因定位于人染色體1p36區(qū)域位點，屬于RUNX基因家族，在哺乳動物發(fā)育和腫瘤中發(fā)揮重要作用，并已被證實與胃上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和胃癌的發(fā)生相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)比例的胃癌組織中由于RUNX3基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化而不表達(dá)RUNX3。何小兵等[12]分別對9種胃癌細(xì)胞系和35例胃癌患者手術(shù)切除腫瘤組織及其癌旁組織RUNX3基因啟動子區(qū)域甲基化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示在7種胃癌細(xì)胞系中RUNX3基因啟動子區(qū)域過度甲基化，RUNX3基因在35例胃癌及其癌旁組織中甲基化率分別為40.0%和8.6%。因此，RUNX3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化可能是導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄失活及其表達(dá)下調(diào)的主要原因。

3　CpG島甲基化表型與胃癌

腫瘤細(xì)胞中多個基因或DNA位點甲基化的狀態(tài)稱為CpG島甲基化表型（CpG　island　methylation　phenotype，CIMP）。如果有3個以上基因CpG島處于甲基化狀態(tài)稱為甲基化表型陽性（CIMP+），反之則稱為甲基化表型陰性（CIMP-）。多項研究表明，胃癌中存在甲基化表型陽性。例如Tahara　T等[13]檢測了146例胃癌標(biāo)本中p14、p16、DAPK、E-cadherin　4個抑癌基因的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示43.2%的病例表型為CIMP+。Kim等[14]檢測了40例早期胃癌中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP2K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示40%病例表型為CIMP+。這表明，甲基化表型陽性在胃癌的早期就已經(jīng)發(fā)生，可以作為早期胃癌的診斷指標(biāo)之一。

此外，有研究表明，CIMP+與胃癌的分期和侵襲轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與胃癌Borrmamm分型和預(yù)后相關(guān)。Park等[15]對196例胃癌標(biāo)本中16個腫瘤相關(guān)的CpG島或位點進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示CIMP+的胃癌患者預(yù)后較差。這表明甲基化表型陽性也可以作為胃癌預(yù)后判斷的一項指標(biāo)。

4　抑癌基因甲基化臨床應(yīng)用前景

檢測腫瘤抑癌基因的甲基化狀態(tài)可以用于癌癥的篩選、風(fēng)險的預(yù)測和治療的選擇。研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因的異常高甲基化在胃癌癌前病變階段（如慢性胃炎和腸上皮化生）也經(jīng)常檢測到，說明DNA甲基化的發(fā)生往往早于各類癌癥的腫瘤形成，這使得它尤其適用于癌癥風(fēng)險預(yù)測[16]。此外，若干報道指出，癌特異的、甲基化的DNA可以在微量的生物體液中被檢出[17]，這表明它可能是一個靈敏的非侵入性診斷的標(biāo)記物。

目前研究者認(rèn)為，DNA甲基化在一定程度上是一個可逆的過程。DNA甲基化需要DNMT的催化，因此應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑抑制DNMT的活性后，可使DNA甲基化逆轉(zhuǎn)，稱為去甲基化。目前研究較深入的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為5-氮雜-2-脫氧胞苷，大量體外研究證實，應(yīng)用5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后，抑癌基因表達(dá)缺失的胃癌細(xì)胞株均重新表達(dá)該基因[18]。故通過去甲基化恢復(fù)抑癌基因表達(dá)可恢復(fù)基因正常功能，有可能達(dá)到治療癌癥的目的。

綜上所述，抑癌基因甲基化是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，多基因甲基化狀態(tài)的檢測及去甲基化藥物的研究對胃癌的預(yù)防、診斷和治療均具有長遠(yuǎn)意義。而如何根據(jù)不同患者的實際情況選擇進(jìn)行檢測的抑癌基因從而提高早期胃癌檢出率，以及去甲基化藥物的選擇和臨床應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究。期待更加深入的科學(xué)實驗為臨床診療提供日趨完善的理論基礎(chǔ)，使得日漸成熟的甲基化檢測技術(shù)及去甲基化藥物早日廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的診治。

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篇5

[關(guān)鍵詞] Beckwith-Wiedemann綜合征；表觀遺傳學(xué)；DNA甲基化；印記基因；Wilms腫瘤

[中圖分類號] R726.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] C [文章編號] 1673-9701（2016）26-0155-03

表觀遺傳學(xué)是近年來醫(yī)學(xué)研究的新熱點，而Beckwith-Wiedemann 綜合征（BWS）是研究表觀遺傳學(xué)的代表性疾病之一。本病是一種罕見的先天性印記基因表達(dá)異常綜合征，印記基因最具特征的標(biāo)志是DNA 獲得甲基化和去甲基化，其致病基因位于第11 號的染色體短臂15.5 區(qū)域，以臍膨出、巨大舌和身體的一側(cè)生長過剩為主要表現(xiàn)，臨床上還可見短暫性低血糖、面部鮮紅斑痣、內(nèi)臟肥大、腫瘤等其他表現(xiàn)。本文通過介紹我院收治的1例Beckwith-Wiedemann 綜合征患兒情況，以提高臨床醫(yī)生對本病臨床表現(xiàn)、診斷、發(fā)病機制的認(rèn)識，現(xiàn)報道如下。

1 病例資料

患兒，女，36+1周早產(chǎn)，于2014年9月25日9：35于我院產(chǎn)科出生，患兒系第1胎第1產(chǎn)，順產(chǎn)，其母胎膜早破5 h，產(chǎn)前無宮內(nèi)窘迫，生后Apgar評分1 min、5 min均為10分，出生體重3600 g，羊水、臍帶未見異常，胎盤大，生后發(fā)現(xiàn)患兒舌大伴吐舌，為進(jìn)一步治療轉(zhuǎn)入我科。

母孕史：其母孕期規(guī)律產(chǎn)檢，孕29周時宮內(nèi)B超提示胎兒雙腎增大，孕34周時宮內(nèi)B超提示胎兒巨舌癥？家族史：父母體健，非近親結(jié)婚，否認(rèn)家族遺傳病病史及中毒、外傷史。

入院查體：體重：3550 g，身長：50 cm，頭圍：33 cm，神清，精神反應(yīng)可，眼裂稍小，鼻梁低平，舌大，吐舌，哭聲響亮，婉轉(zhuǎn)有調(diào)，顏面可見紅斑，前囟平軟約1.5 cm×1.5 cm，左頂部可觸及2 cm×2 cm×3 cm血腫，心音有力，律齊，心前區(qū)未聞及雜音，兩肺呼吸音清，腹軟，腹正中劍突下至臍部可見一條狀隆起，哭鬧時明顯，臍根部粗大，肝肋下2 cm，質(zhì)軟邊銳，脾肋下未及，雙側(cè)肢體對稱，無偏身肥大，四肢肌張力正常。

輔助檢查：血尿便常規(guī)無異常，血生化無異常，TORCH（-），血胰島素（空腹）3.35 μIU/L（3.3～19.5 μIU/L），超聲心動圖：房間隔缺損3 mm，繼發(fā)孔型。腹部B超：肝臟增大，雙腎增大，雙側(cè)腎盂分離。

小兒外科：臍疝，腹白線疝。皮膚科：面部鮮紅斑痣。口腔科：舌體良性肥大。

診治經(jīng)過：入院第2天出現(xiàn)血糖偏低（2.5 mmol/L），經(jīng)喂養(yǎng)糖水及奶、靜脈輸入葡萄糖，血糖恢復(fù)正常。住院期間每天均在空腹喂奶前有1～2次血糖偏低，經(jīng)加強喂養(yǎng)后血糖正常。

出院后隨訪：出生后40 d，混合喂養(yǎng)，血糖監(jiān)測正常。右側(cè)肢體較左側(cè)偏大（右上肢、下肢較左側(cè)長0.5 cm，右下肢較左側(cè)粗0.5 cm），活動好，肌張力正常，用力時腹中線部位膨隆。血AFP 257.6 ng/mL（

MS-MLPA結(jié)果：母源KvDMR去甲基化，母源H19甲基化或父源的單親二倍體。

2 討論

2.1 發(fā)病率及病因

篇6

【關(guān)鍵詞】胃癌；分型；進(jìn)展

胃癌是消化系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的癌癥之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織癌癥研究中心2002年的統(tǒng)計，我國胃癌發(fā)病率僅次于日本，位于全球第2位。2007年中國腫瘤登記提示：我國胃癌的發(fā)病居第二位，僅次于肺癌，死亡據(jù)第三位，僅次于肺癌、肝癌。胃癌在演進(jìn)過程中隨著附加的基因突變會產(chǎn)生不同的亞克隆，使其不斷異質(zhì)化導(dǎo)致其侵襲和轉(zhuǎn)移能力不斷加強，而這是胃癌治療困難和致死的主要原因。國內(nèi)外學(xué)者都在尋求能指導(dǎo)臨床方案選擇及判斷預(yù)后的胃癌分型，傳統(tǒng)的癌癥診斷對病理學(xué)依賴性較大，有時會因為腫瘤的不典型或臨床信息的不完整而造成診斷困難。應(yīng)用基因分析技術(shù)所產(chǎn)生的信息，特別是應(yīng)用高通量芯片技術(shù)所產(chǎn)生的信息可以為胃癌分型提供更多的參考，因此對目前胃癌相關(guān)的分型予以綜述。

1 胃癌的傳統(tǒng)分型

胃癌病理分型是以組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)特性為基礎(chǔ)，不同類型的胃癌，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)行為各異，流行病學(xué)和分子機制亦不同，以致現(xiàn)有的胃癌分型系統(tǒng)眾多。目前，常用的是WHO型、Lauren分型，大體分型主要使用Borrmann分型。

1.1 WHO胃癌包括以下常見組織學(xué)類型

狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌、腺鱗癌、鱗癌、小細(xì)胞癌、未分化癌。此外，胃內(nèi)還可以發(fā)生類癌。WHO分型將Lauren分型的腸型、彌漫型納入腺癌之下。其管狀腺癌還可進(jìn)一步分成高分化、中分化與低分化腺癌。少見類型或特殊類型胃癌有：實體型變異、肉瘤樣變異等。

1.2 1923年德國病理學(xué)家Borrmann提出的一種胃癌大體形態(tài)分型方法，此分型主要根據(jù)癌瘤在黏膜面的形態(tài)特征和在胃壁內(nèi)的浸潤方式進(jìn)行分類，將胃癌分為4型：Ⅰ型（結(jié)節(jié)型），II型（潰瘍局限型），III型（浸潤潰瘍型），是最常見的類型，約占50%。Ⅳ型（彌漫浸潤型），由于癌細(xì)胞彌漫浸潤及纖維組織增生，胃壁呈廣泛增厚變硬，稱“革囊胃”。Borrmann分型是胃癌經(jīng)典的分型方法，既能反映胃癌的生物學(xué)行為，又簡潔實用，國際上廣泛采用。

1.3 Lauren分型將胃癌分成兩大主要類型，即腸型與彌漫型，當(dāng)腫瘤內(nèi)兩種類型成分相當(dāng)時就稱為混合型。胃癌發(fā)生是一個多步驟的過程，彌漫型和腸型在腫瘤發(fā)生各個階段會產(chǎn)生多種基因及表觀遺傳學(xué)方面的變異。常見的包括抑癌基因的點突變和雜合性丟失，常見的表觀遺傳學(xué)異常包括CPG島的甲基化引起的腫瘤抑制基因沉默和腫瘤促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄水平的增高。

2 胃癌分型與分子病理學(xué)

胃癌分型研究的意義在于探索其是否對判斷預(yù)后有價值或者對于今后的治療有指導(dǎo)意義。當(dāng)前，國內(nèi)張樹華采用組織病理與組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，兼顧宿主的免疫防御反應(yīng)，把胃癌分為兩型：限制生長型和促進(jìn)生長型。限制生長型預(yù)后較促進(jìn)生長型好。

根據(jù)黏蛋白標(biāo)記的差異，胃癌組織被分為4型：1）胃型：胃型黏蛋白標(biāo)記的胃癌細(xì)胞>10%；2）胃腸型：胃型黏蛋白標(biāo)記的胃癌細(xì)胞> 10%且腸型黏蛋白標(biāo)記的胃癌細(xì)胞>10%；3）腸型：腸型黏蛋白標(biāo)記的胃癌細(xì)胞>10%；4）未分類：胃腸黏蛋白標(biāo)記的細(xì)胃癌細(xì)胞

Solcia等對對294例平均隨訪時間長達(dá)150個月的胃癌進(jìn)行研究顯示，如果將胃癌的組織學(xué)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞異型性程度、p53基因突變、18q雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性以及有無脈管神經(jīng)浸潤等因素與預(yù)后綜合分析，可以將胃癌惡性程度分成三級。胃癌I級（預(yù)后良好型）包括：大量腫瘤內(nèi)/旁淋巴樣細(xì)胞反應(yīng)型、高分化管狀腺癌、黏液結(jié)節(jié)型和促纖維結(jié)締組織增生性彌漫型胃癌，I級胃癌約占全部胃癌病例的37%。胃癌III級（預(yù)后不良型）包括：高度異型性胃癌、浸潤型黏液腺癌、腫瘤細(xì)胞異型性中等但具有p53基因的第7或第8外顯子突變、伴有血管淋巴管浸潤以及神經(jīng)浸潤者，III級胃癌占全部胃癌病例的19%。其他胃癌則歸屬于預(yù)后中等的胃癌Ⅱ級，占全部胃癌的44%。這一關(guān)于胃癌惡性程度評價體系雖然是不依賴于臨床分期的胃癌預(yù)后判斷新標(biāo)準(zhǔn)，但實際操作中涉及到微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的分子遺傳學(xué)檢測、p53基因突變檢測以及EB病毒原位雜交檢測等實驗技術(shù)，在臨床普及以及操作流程標(biāo)準(zhǔn)化控制等方面均有待統(tǒng)一。

3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與胃癌分型

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[MSI]是胃癌發(fā)生過程中的一個常見事件，反應(yīng)了腫瘤潛在DNA錯配修復(fù)缺陷，常常由Hmlh1啟動子區(qū)甲基化引起，胃癌合并MSI者其臨床病理因素特別，預(yù)后相對良好，胃腸道腫瘤中MSI的測定是最先被廣泛利用的預(yù)后分子檢測之一。MSI的檢測常采用熒光定量多重PCR進(jìn)行，費用相對低，適用性廣。以往的很多觀察表明，胃癌中MSI的存在不僅僅是與已知的與組織病理特征強關(guān)聯(lián)的分子分型標(biāo)志，同時MSI能能區(qū)分預(yù)后良好好亞組。因此Simpson等建議將MSI作為一個有效的分子分型工具。葡萄牙的一項研究表明，胃癌患者并低度MSI五年生產(chǎn)率為30%相比，而高度MSI者則為70%。韓國的一項大型研究也表明在胃癌分期為II、III期的患者M(jìn)SI與預(yù)后良好有關(guān)。

4 胃癌的分子分型

以分子特征為基礎(chǔ)的新型分類體系即分子分型。高通量的基因分析可以是DNA水平的基因多態(tài)性分析、DNA甲基化分析和基因拷貝數(shù)分析.也可以是RNA水平的基因表達(dá)譜分析、微小RNA表達(dá)譜分析和蛋白表達(dá)水平的蛋白芯片分析等。

腫瘤分子分型的基礎(chǔ)：目前可以在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行腫瘤分子分型的研究。在DNA水平，可以依據(jù)基因突變、基因組的細(xì)胞遺傳學(xué)改變或甲基化差異進(jìn)行分型。根據(jù)基因表達(dá)譜（RNA水平）的差異實施分型，是目前分子分型的研究主體，以表達(dá)譜芯片為基礎(chǔ)的分子分型研究數(shù)據(jù)處理分二類：一是，unsupervised analysis；二是，supervised analysis。在蛋白質(zhì)水平，可以根據(jù)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白組成的不同或蛋白質(zhì)翻譯后修飾的改變來進(jìn)行分型。

分子分型的研究方法主要有：基因表達(dá)譜芯片技術(shù)：它可以同時觀察成千上萬個基因在不同個體、不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)狀況。它的原理是在已建立的cDNA或寡核苷酸組成的芯片或微陳列上，用不同顏色熒光標(biāo)記的cDNA制備的探針與之雜交，掃描及計算機處理所得的信號就代表了樣品中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。基因芯片技術(shù)在腫瘤的分子分型、基因功能、信號通路及代謝與調(diào)控途徑研究等方面有顯著的優(yōu)勢；比較基因組雜交（CGH）技術(shù)：是在染色體熒光原位雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究技術(shù)。它主要是用不同的熒光體系來標(biāo)記腫瘤組織DNA和正常對照DNA，與正常中期分裂象染色體進(jìn)行競爭性抑制雜交，熒光信號攝取及軟件分析所得的比值可判斷染色體區(qū)段的擴增、缺失還是正常。它僅需少量腫瘤組織DNA即可在整個基因組水平研究不同基因組間DNA拷貝數(shù)差異，并將這些異常定位在染色體上。CGH與微芯片技術(shù)結(jié)合的芯片CGH，以cDNA作為雜交靶，可使得基因組水平遺傳物質(zhì)異常的分辨率達(dá)到幾十個kb，并可對關(guān)鍵基因改變進(jìn)行精細(xì)定位；蛋白芯片技術(shù)：基因突變和基因表達(dá)差異不一定導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白表達(dá)，而且蛋白質(zhì)還存在磷酸化，乙酰化等復(fù)雜的翻譯后修飾過程，這些改變在轉(zhuǎn)錄水平上是無法檢測的。以高通量結(jié)合生物信息學(xué)為特點的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)可以從細(xì)胞整體水平上檢測到這種變化，為腫瘤分子分型以及治療標(biāo)志物的篩選帶來巨大的便利與可能。蛋白芯片技術(shù)主要包括雙向凝膠電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)。

篇7

【關(guān)鍵詞】組合數(shù)學(xué) 教學(xué)方法 生物醫(yī)學(xué) 生物信息學(xué)

【中圖分類號】G64 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-3089（2015）09-0132-02

伴隨著信息時代的來臨，特別是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的迅猛發(fā)展，尤其是生物信息學(xué)這門科學(xué)的出現(xiàn)使得原來的生物醫(yī)學(xué)研究向低通量的臨床數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)向高通量分子生物學(xué)數(shù)據(jù)。組合數(shù)學(xué)作為一門應(yīng)用性較強的數(shù)學(xué)分支，在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用廣泛，面對多因素高通量的生物醫(yī)學(xué)問題，增加高等學(xué)校，特別是生物信息學(xué)專業(yè)學(xué)生的組合數(shù)學(xué)知識，培養(yǎng)他們運用組合數(shù)學(xué)方法分析和解決生物醫(yī)藥科學(xué)問題的能力已經(jīng)成為必要。如何在教學(xué)過程中提高學(xué)生學(xué)習(xí)組合數(shù)學(xué)的興趣，建立組合數(shù)學(xué)的邏輯思維用于解決醫(yī)學(xué)問題是我們教育工作者需要思考的問題。

一、高等學(xué)校組合數(shù)學(xué)的特點及教學(xué)現(xiàn)狀

組合數(shù)學(xué)是一門研究離散對象的科學(xué)，在計算機科學(xué)、信息科學(xué)中具有重要的地位，是理科及工科院校的一門必修課，隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的日益發(fā)展，組合數(shù)學(xué)的重要性也日漸凸顯。組合數(shù)學(xué)對于生物醫(yī)學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)課有著直接的衍射作用。目前，部分開設(shè)組合數(shù)學(xué)課程的生物高等學(xué)校的主要面向生物信息學(xué)、統(tǒng)計學(xué)等等專業(yè)開設(shè)，講授學(xué)時30到60學(xué)時。在大部分生物高等學(xué)校并沒有該類課程的設(shè)置，也是導(dǎo)致高等學(xué)校組合數(shù)學(xué)教師隊伍的匱乏的主要原因。而且目前組合數(shù)學(xué)授課考核形式也比較單一。組合數(shù)學(xué)主要是以理論授課形式為主的教學(xué)方式，考試成績是考核學(xué)生的唯一標(biāo)準(zhǔn)，忽視了學(xué)生在學(xué)習(xí)過程中的考核。信息時代學(xué)科的交叉發(fā)展體現(xiàn)在組合數(shù)學(xué)在各個學(xué)科中不可替代的作用，因此提高生物高等學(xué)校學(xué)生的組合數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)他們運用組合數(shù)學(xué)的能力是目前迫切需要解決的問題。

二、改進(jìn)組合數(shù)學(xué)教學(xué)措施，提高學(xué)生興趣

（一）更新教學(xué)內(nèi)容，改進(jìn)教學(xué)方法

目前的組合數(shù)學(xué)內(nèi)容主要有： 鴿巢原理、排列與組合、容斥原理、遞推關(guān)系、生成函數(shù)等基本的組合數(shù)學(xué)知識及其在數(shù)學(xué)中的應(yīng)用。為了讓學(xué)生在有限的學(xué)時內(nèi)學(xué)完必要的知識，更新和精選教學(xué)內(nèi)容顯得尤為必要，將以組合數(shù)學(xué)內(nèi)容為主導(dǎo)的教學(xué)模式改進(jìn)成以生物醫(yī)學(xué)問題為導(dǎo)向的教學(xué)模式。由于面向醫(yī)學(xué)專業(yè)的特殊性，從內(nèi)容上應(yīng)著重選擇與醫(yī)學(xué)知識聯(lián)系緊密的內(nèi)容，采取精講和略講相結(jié)合的方式。根據(jù)不同專業(yè)背景更新組合數(shù)學(xué)的教學(xué)內(nèi)容往往能夠起到事半功倍的效果。以下是我們在講解排列與組合一章時的一個教學(xué)實例：“生物遺傳信息是由DNA分子中4個堿基核苷酸就像電報密碼似的以不同的排列順序記錄下來，它載著人類的全部基因或全部遺傳信息，人的DNA約有30億（3×109） 堿基對，按照排列的思想可知人類基因組可能的排列方式有N=4■=（4■）■≈（1.52）■種，然而人類僅從這無窮多的方式中選了一種作為全人類共同的遺傳密碼，可見我們的基因組是祖先們留給人類的最寶貴的財富！”。這樣的實例教學(xué)不僅可以讓學(xué)生熟悉課堂知識，還能讓學(xué)生對所學(xué)的知識進(jìn)行綜合的運用，更重要的與生物醫(yī)學(xué)問題的結(jié)合提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。通過興趣小組討論學(xué)習(xí)提高學(xué)生自主學(xué)習(xí)的主動性，變被動學(xué)習(xí)為主動學(xué)習(xí)，充分調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)組合數(shù)學(xué)的興趣，從而充分發(fā)揮學(xué)生學(xué)習(xí)的主觀能動性。

（二）加強多媒體輔助教學(xué)，提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣

組合數(shù)學(xué)傳統(tǒng)的授課方式是在黑板上將定義、定理的內(nèi)容進(jìn)行逐步嚴(yán)密的推導(dǎo)證明，這在一定程度上讓學(xué)生緊跟授課教師的思維和建立學(xué)生的邏輯思考能力。然而隨著多媒體技術(shù)的不斷進(jìn)步，利用多媒體和板書相結(jié)合的策略成為下一階段組合數(shù)學(xué)教學(xué)模式的主要教學(xué)手段。對于繁瑣的定理公式例如容斥原理避免推導(dǎo)證明，結(jié)合多媒體的幾何圖形使學(xué)生更加直觀的理解和應(yīng)用。以我們在教授容斥原理時的一個實例，容斥原理的根本思想是將難的問題分解成若干簡單問題，通過間接計數(shù)來解決直接計數(shù)不容易解決的問題，我們用多媒體幻燈片分別展示兩集合和三集合的容斥原理（圖1A和B），并按照容斥原理的邏輯順序利用多媒體動畫技術(shù)控制每一部分的出現(xiàn)順序，不僅避免了大量繁重枯燥的板書推導(dǎo)，最重要的是圖形式教學(xué)可以幫助學(xué)生對容斥原理建立更直觀的理解。可見在組合數(shù)學(xué)的教學(xué)過程多媒體的充分利用可以起到事半功倍的效果。

圖1 多媒體在組合數(shù)學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用――容斥原理實例

（三）增設(shè)組合數(shù)學(xué)實驗課，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新性思維

組合數(shù)學(xué)除了基本理論課之外還應(yīng)該開設(shè)適當(dāng)?shù)膶嶒炚n，在實驗課上讓學(xué)生自己動手解決一些與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的實際問題。通過讓學(xué)生自己編程實現(xiàn)排列組合的算法，不僅可以增進(jìn)學(xué)生對排列與組合的深入認(rèn)識，也能夠培養(yǎng)學(xué)生利用排列組合思想解決實際問題的能力。以下是我們的一個實驗教學(xué)實例：“任選一種排列生成算法，編程實現(xiàn)自動生成n個（如n=6）不同元素中取r個元素的排列，并輸出指定任意n和r的所有排列。”，不僅讓學(xué)生掌握了課堂上講解的排列原理，還鍛煉了編程能力，初步體驗了科研的樂趣，由消極的被動學(xué)習(xí)升級為積極的主動學(xué)習(xí)。可見通過組合數(shù)學(xué)實驗課更能培養(yǎng)學(xué)生自己動手自己學(xué)習(xí)的能力，進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新性思維。

（四）精挑細(xì)選課后練習(xí)，培養(yǎng)學(xué)生獨立解決問題的能力

組合數(shù)學(xué)作為一門應(yīng)用性較強的數(shù)學(xué)課，需要學(xué)生掌握其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，這就必須加強組合數(shù)學(xué)課堂后練習(xí)。因此習(xí)題是組合數(shù)學(xué)課程重要的教學(xué)環(huán)節(jié)，也是理論教學(xué)必不可少的補充。然而習(xí)題課并不意味著單純地大量做題，教師應(yīng)根據(jù)課堂內(nèi)容，精挑細(xì)選出質(zhì)量比較高的少量題目，供學(xué)生課余時間認(rèn)真研究，要在習(xí)題中體現(xiàn)組合數(shù)學(xué)的知識點，激發(fā)學(xué)生獨立給出解決問題的新觀點和新方法。設(shè)置習(xí)題時，應(yīng)以問題為導(dǎo)向，即給定一個實際的有興趣的問題，讓學(xué)生利用所學(xué)的組合數(shù)學(xué)理論進(jìn)行解決，進(jìn)一步加強學(xué)生對知識細(xì)節(jié)的理解和掌握，并讓學(xué)生舉一反三熟練掌握所學(xué)內(nèi)容，使學(xué)生的理解更加深刻。如我們在教學(xué)過程中的一個課后習(xí)題實例：“一位國際象棋大師有11周的時間備戰(zhàn)一場錦標(biāo)賽，他決定每天至少下一盤棋，但是為了使自己不過分疲勞他還決定在每周不能下棋超過12盤。證明存在連續(xù)若干天，期間這位大師恰好下了21盤棋。”，該實例引起了學(xué)生在課余時間學(xué)習(xí)組合數(shù)學(xué)的一個熱潮。

總之，面對高等學(xué)校生物信息學(xué)學(xué)生的專業(yè)特點，傳統(tǒng)的單一的純理論的組合數(shù)學(xué)教學(xué)方法已經(jīng)不再適用。應(yīng)該考慮改進(jìn)教學(xué)內(nèi)容和方法，發(fā)揮學(xué)生學(xué)習(xí)的主觀能動性，使學(xué)生在快樂進(jìn)取的氛圍里學(xué)習(xí)組合數(shù)學(xué)，具體的教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方法的改進(jìn)仍有待教學(xué)工作者進(jìn)一步探討和研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]盧開澄，盧華明.組合數(shù)學(xué)[M].北京：清華大學(xué)出版社，2002.

[2]蘇建忠，張巖，劉洪波，王芳，崔穎.組合數(shù)學(xué)在生物信息學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用[J]. 科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2012，6，142-143.

作者簡介：

劉洪波（1983-），男，漢族，山東德州人，博士，講師，主要研究方向：生物信息學(xué)，計算表觀遺傳學(xué)。

王芳（1982-），女，漢族，吉林松原人，博士，副教授，主要研究方向：生物信息學(xué)，計算表觀遺傳學(xué)。

篇8

[關(guān)鍵詞] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06

Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅位于肺癌和前列腺癌（女性為乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率約占全部惡性腫瘤死亡總?cè)藬?shù)的8%，在惡性腫瘤死因中居第4位[1]。CRC的發(fā)生與發(fā)展與癌基因和抑癌基因的缺失、擴增或突變有關(guān)。有些基因在染色質(zhì)水平上發(fā)生表型遺傳修飾改變也會導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)。表型遺傳修飾最多見的是CpG島（CpG island）的甲基化改變。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人類染色體12q14.3上，由10個外顯子組成，全長約200 kb。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路是調(diào)控細(xì)胞生長增殖的重要途徑之一，其異常激活已發(fā)現(xiàn)與多種人類腫瘤密切相關(guān)[2]。Wif-1基因是這條通路的下游區(qū)基因也是這條通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多種腫瘤中都已證實是存在的，它作為一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其啟動子的高甲基化參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗通過研究5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-CdR）對HT-29和LoVo細(xì)胞株作用后Wif-1基因的DNA層面、mRNA層面和蛋白層面的改變，探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中Wif-1基因失活的甲基化機制及藥物恢復(fù)Wif-1基因表達(dá)的可能性，以期尋找CRC的腫瘤標(biāo)志物及新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部107實驗室）；DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司），DNA甲基化修飾試劑盒及甲基化陽性/陰性對照（美國ZYMO公司）；qPCR反應(yīng)試劑ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海輝睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR擴增儀（美國Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美國Sigma公司），以DMSO溶劑充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分裝后-80℃保存；Wif-1和內(nèi)參β-actin（美國Santa Cruz公司），Western blot相關(guān)試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)

結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、鏈霉素的RPMI1640的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化傳代。取貼壁生長良好的細(xì)胞以RPMI1640調(diào)整細(xì)胞密度至2×106/mL，接種于六孔培養(yǎng)板。干預(yù)的LoVo和HT-29細(xì)胞分別加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培養(yǎng)液，每24小時更換新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)作用72 h；以HT-29和LoVo分別加入等量DMSO溶劑培養(yǎng)作為對照（0 μmol/L）。

1.3 Methylight方法

取對數(shù)生長期的HT-29和LoVo細(xì)胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）說明提取上述兩種細(xì)胞不同濃度梯度的細(xì)胞DNA，用紫外分光光度儀（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司）測DNA濃度，以DNA濃度在25 ng/μL為最低濃度，使用DNA修飾試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，按照試劑盒說明書操作，Wif-1基因甲基化引物和探針設(shè)計：Wif-1基因序列參照GenBank。甲基化引物和探針由Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探針：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，內(nèi)參β-actin基因甲基化按文獻(xiàn)[3]設(shè)計，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探針：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探針FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作為陽性、陰性對照，水為空白對照。

1.4 實時熒光定量PCR分析結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表達(dá)情況

取對數(shù)生長期的HT-29和LoVo細(xì)胞，胰酶消化后抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行實時熒光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反應(yīng)體系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40個循環(huán)；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。實驗重復(fù)3次，取均值。擴增完畢后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表達(dá)。ΔΔCt=（Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）。

1.5 Western blot分析結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表達(dá)情況

取對數(shù)生長期的HT-29和LoVo細(xì)胞，在上述兩種細(xì)胞株各個濃度梯度的每管細(xì)胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制劑PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃離心，10 min后取上清液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。總蛋白100℃變性5 min后，配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，蛋白電泳分離后經(jīng)電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至PVDF膜。BSA室溫封閉2 h后，PVDF膜置于1∶200稀釋的Wif-1單克隆抗體稀釋液中4℃冰箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋液中37℃培養(yǎng)2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL發(fā)光液顯影，采集并分析處理圖像。凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析各條帶吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）為基準(zhǔn)，設(shè)置為1。以目的基因條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）作為Wif-1蛋白的相對表達(dá)強度。實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.6 MethyLight結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

同時擴增目的基因（Wif-1）和內(nèi)參基因（β-actin），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到兩者的原始拷貝數(shù)，計算標(biāo)準(zhǔn)甲基化指數(shù)（the normalized index of methylation，NIM）。其定義為：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，Wif-1 positive指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，β-actin sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，β-actin positve指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)。NIM≥4為甲基化，NIM

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），行配對t檢驗，并設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化狀況

將陽性對照按10的倍數(shù)稀釋成1×100～1×10-6 7個濃度梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（其拷貝數(shù)為103～109/mL）。各濃度梯度反應(yīng)均做復(fù)孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.907。實時熒光定量PCR得出數(shù)據(jù)按MethyLight結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，在DMSO對照組、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。見表1、圖1。

表1 HT-29和LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀況

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表達(dá)狀況

實時熒光定量PCR得出的數(shù)據(jù)檢驗擴增效率（E）通過公式E=2-1/斜率-1計算，Wif-1基因mRNA為0.945，GAPDH基因mRNA為0.977，兩個基因的擴增效率相差

表2 HT-29和LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因mRNA表達(dá)狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.3結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表達(dá)狀況

Western blot結(jié)果運用Image J軟件進(jìn)行條帶圖像分析，獲得HT-29和LoVo細(xì)胞株各條帶光密度值，并計算出兩種細(xì)胞在各組中的平均光密度比值，進(jìn)行半定量分析及統(tǒng)計學(xué)分析，并以各實驗分組為橫坐標(biāo)，將測出相應(yīng)的平均光密度比值為縱坐標(biāo)，繪出柱狀圖后發(fā)現(xiàn)0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細(xì)胞株中Wif-1蛋白表達(dá)水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因的蛋白表達(dá)水平較DMSO對照組略微上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。見表3、圖3。

表3 HT-29和LoVo細(xì)胞株中Wif-1蛋白表達(dá)狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

A：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細(xì)胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；B：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細(xì)胞株Wif-1蛋白柱狀圖；C：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細(xì)胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；D：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細(xì)胞株Wif-1蛋白柱狀圖

圖3 各組HT-29細(xì)胞株及LoVo細(xì)胞株Wif-1蛋白表達(dá)

3討論

CRC是最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年全球新發(fā)病例達(dá)123萬，病死率約為發(fā)病率的1/2。我國CRC發(fā)病率雖低于西方發(fā)達(dá)國家，但近20年來CRC的發(fā)病率仍在逐漸上升，同時，其發(fā)病年齡有增高趨勢。近年研究表明CRC的發(fā)病是多因素、多階段、多基因連續(xù)累積發(fā)生的過程，除遺傳學(xué)改變外，表觀遺傳學(xué)改變亦參與CRC的發(fā)生、發(fā)展過程。表觀遺傳學(xué)是指不涉及DNA序列改變，但基因表達(dá)卻發(fā)生可遺傳的改變，DNA甲基化、組蛋白修飾、MicroRNA等是表觀遺傳學(xué)的主要形式。與腫瘤發(fā)生關(guān)系最密切的是DNA甲基化修飾異常，其中包括基因組去甲基化及部分區(qū)域高度甲基化兩種形式。DNA甲基化可以導(dǎo)致癌相關(guān)基因沉默，病變迅速進(jìn)展為癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能認(rèn)識CRC中基因異常DNA甲基化，將可能獲得CRC診斷的腫瘤標(biāo)志物及新的治療靶點[5-7]。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路發(fā)現(xiàn)迄今已數(shù)十年，作為一條高度保守的信號通路在動物胚胎的器官發(fā)育各個階段均發(fā)揮異常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的拮抗基因之一，屬SFRP拮抗家族，在種族間高度保守，最早在人類視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)[8]。它主要通過捆綁Wnt信號蛋白，阻止其與Frizzled受體相互作用，從而抑制通路的異常激活。Nosho等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在早期CRC中伴有Wif-1表達(dá)的下調(diào)，可能通過引起經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的激活，導(dǎo)致通路下游靶基因的過度表達(dá)，伴隨細(xì)胞過度的增殖和失控的分化從而引起腫瘤的發(fā)生。表觀遺傳學(xué)改變?nèi)缁?′端CpG島甲基化是Wif-1基因失活的重要機制。已有一系列研究證實在各系統(tǒng)腫瘤中，啟動子區(qū)甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究顯示，Wif-1啟動子區(qū)的甲基化率都很高，分別為82.0%和74%。齊健等[15]的研究結(jié)果與國外基本一致，Wif-1甲基化率為84.7%。Wif-1基因的啟動子中存在T細(xì)胞相關(guān)因子（T cell factor，TCF）的反應(yīng)元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核內(nèi)靶因子，Wnt信號活化可使β-catenin在胞漿內(nèi)累積并進(jìn)入核內(nèi)識別淋巴結(jié)增強因子/T細(xì)胞相關(guān)因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等轉(zhuǎn)錄因子，激活Wnt信號的靶基因，控制胚胎發(fā)育及細(xì)胞生長、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究結(jié)果顯示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的積聚及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的激活。

本實驗研究中筆者采用去甲基化藥物5'-Aza-CdR處理兩個結(jié)直腸癌細(xì)胞株：MSS細(xì)胞株HT-29和MSI細(xì)胞株LoVo后通過實時熒光定量PCR檢測，筆者發(fā)現(xiàn)DNA層面上DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)都為未甲基化，說明去甲基化藥物5′-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)Wif-1基因甲基化狀態(tài)，同時在mRNA層面上筆者發(fā)現(xiàn)在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細(xì)胞株中Wif-1基因的mRNA表達(dá)水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因的mRNA表達(dá)水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通過Western blot在蛋白層面上發(fā)現(xiàn)在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細(xì)胞株中Wif-1蛋白表達(dá)水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因的蛋白表達(dá)水平較DMSO對照組略微上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。

本實驗研究顯示甲基化酶抑制劑5′-aza-dC可通過啟動子甲基化而失活的Wif-1基因的異常甲基化狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，而使該抑癌基因恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，以使該基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮可能的抑制腫瘤的作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多種途徑和多種基因的改變，其中表觀遺傳學(xué)的變化逐漸受到醫(yī)學(xué)研究的重視。異常甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的一個重要內(nèi)容，往往是導(dǎo)致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通過對異常甲基化的進(jìn)一步研究，來尋求結(jié)直腸腫瘤診斷的新標(biāo)志物和治療的新靶點。

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篇9

宋慧慧，鮑文，陸祖宏

【摘要】 目的：研究p16基因在K562/A02細(xì)胞株的表達(dá)情況及其與耐藥的關(guān)系。方法：用PCR法對慢性髓系白血病細(xì)胞株K562及其耐藥細(xì)胞株K562/A02進(jìn)行p16基因缺失檢測。結(jié)果：K562及K562/A02細(xì)胞株經(jīng)PCR擴增后，均未擴出相應(yīng)條帶。結(jié)論：K562/A02細(xì)胞株與K562細(xì)胞株一樣，均表現(xiàn)為p16基因缺失。

【關(guān)鍵詞】 p16基因； K562細(xì)胞株； K562/A02細(xì)胞株； 表達(dá)； 缺失

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟的過程，其中抑癌基因的失活扮演了重要角色。抑癌基因的失活可以通過多種途徑，如缺失、突變、啟動子區(qū)域的異常甲基化等。p16基因是1994年由Kamb等［1］發(fā)現(xiàn)的多種腫瘤抑制基因（multiple tumor suppressor gene，MTS1），在細(xì)胞增殖周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。p16的失活與多種血液系統(tǒng)惡性疾病有著密切的關(guān)系，失活的主要方式包括基因缺失、點突變、甲基化、基因重排等。Quesnel等［2］報道了p16基因在K562細(xì)胞株中是缺失的，而p16基因在K562的耐藥細(xì)胞株K562/A02中的表達(dá)情況目前尚未見報道。本試驗擬研究p16基因在K562/A02細(xì)胞株的表達(dá)情況及其與耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

K562細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物研究所，用RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品）加10％胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h傳代1次，培養(yǎng)中的細(xì)胞均保持在(0.1～0.5)×106 ml-1的密度。K562／A02細(xì)胞株系K562細(xì)胞株經(jīng)阿霉素(ADM)逐步誘導(dǎo)形成，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供，培養(yǎng)及傳代過程同K562細(xì)胞株。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 實驗用細(xì)胞為對數(shù)生長期細(xì)胞，用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，TE溶解，經(jīng)紫外分光光度計定量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物 根據(jù)p16基因的核酸序列自行設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成。引物序列:上游5′-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3′，下游5′-TACCTGATTCCAATTCCCCTGCAAACT-3′，β-Globin基因擴增產(chǎn)物為664bp。若擴增出內(nèi)參照片段而無目的片段，則判為基因缺失。擴增條件:反應(yīng)體系30μl，其中含10倍PCR緩沖液3μl，Mg2+1.6 mmol·L-1，dNTPs 200μmol· L-1，引物各 1μmol·L-1，模板DNA1μl，Taq DNA 聚合酶 2U。PCR在Gene Amp2400PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行:于95℃預(yù)變性5min;95℃變性60s，62℃退火60s，72℃延伸30s，共30 個循環(huán)。

1.2.3 電泳觀察 PCR擴增結(jié)束后取5μl PCR產(chǎn)物與1μl電泳上樣緩沖液混合后進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，條件為200V電泳15min，在凝膠成像系統(tǒng)(Syngene，Gene Genius)觀察PCR結(jié)果。

2 結(jié)

果

如圖1，從左往右（1～4）依次為對照組（正常人外周血DNA）、Marker、K562細(xì)胞株DNA、K562/A02細(xì)胞株DNA。顯示對照組可擴出內(nèi)參條帶（664bp）及p16基因條帶（320bp），K562細(xì)胞株和K562/A02細(xì)胞株均擴出內(nèi)參條帶而無p16基因條帶，證實K562與 K562/A02細(xì)胞株均為p16基因表達(dá)缺失。

3 討

論

p16基因位于人染色體9P21區(qū)，全長8.5kb，編碼1個含156個氨基酸殘基、相對分子質(zhì)量為15800的蛋白產(chǎn)物，即P16蛋白，它是細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)的抑制蛋白。正常情況下P16蛋白與細(xì)胞周期蛋白D（Cyclin D）競爭結(jié)合CDK4、CDK6，抑制兩者的活化，未活化的CDK4、CDK6不能解除視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRB)對轉(zhuǎn)錄因子的抑制，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制DNA的合成和細(xì)胞增殖。當(dāng)P16蛋白丟失時，Cyclin D和CDK4、CDK6結(jié)合就會增多，使腫瘤細(xì)胞逃避負(fù)性調(diào)控，成為惡性生長的重要環(huán)節(jié)［3］ 。

p16抑癌基因是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)RB途徑中重要的成分，也是該途徑受到損害時最易發(fā)生遺傳學(xué)改變的基因之一。在血液系統(tǒng)腫瘤中，p16基因主要在淋巴系統(tǒng)腫瘤中發(fā)生改變，在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)特別是兒童ALL中p16基因的缺失可達(dá)26％～75％，在急性髓系白血病（AML）中缺失率很低，在慢性髓細(xì)胞白血病原始細(xì)胞危象期特別是原始淋巴細(xì)胞危象期時缺失率可達(dá)35％［4］。

目前血液系統(tǒng)惡性疾病的治療以化療為主，但是原發(fā)性或獲得性耐藥仍然是影響化療效果的重要因素。近年來越來越多的證據(jù)證明，腫瘤的耐藥不僅與腫瘤基因的擴增、易位、缺失、突變有關(guān)，而且與表觀遺傳學(xué)改變也有著密切的關(guān)系。表觀遺傳學(xué)最常見的改變就是啟動子區(qū)域的CpG島甲基化狀態(tài)的改變，很多抑癌基因啟動子的異常甲基化所致的基因沉默亦可以導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。此外一些促進(jìn)藥物外排基因的甲基化異常也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥。

轉(zhuǎn)貼于

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是化療失敗的主要原因之一，7號染色體上MDR1編碼的P-糖蛋白表達(dá)增強是MDR的主要機制之一。MDR1基因啟動子區(qū)域因富含胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G），故根據(jù)Gardiner-Garden 的定義屬于CpG島。1997年Kusaba等［5］率先提出甲基化可能是調(diào)控MDR1基因表達(dá)的開關(guān)，他們將攜帶有人MDR1基因的酵母人工染色體轉(zhuǎn)染至小鼠細(xì)胞中，用長春新堿誘導(dǎo)成耐藥株，與敏感株比較，耐藥株的MDR1基因選擇性表達(dá)增高，同時該基因的5′端呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，推測用化療藥物后MDR1基因編碼的P-糖蛋白表達(dá)增高可能與該基因的5′啟動子區(qū)或其它區(qū)域的去甲基化狀態(tài)有關(guān)。

一些藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)基因啟動子的甲基化可以阻礙化療藥物在腫瘤細(xì)胞中聚集，從而降低腫瘤細(xì)胞中的藥物濃度。如編碼還原型葉酸轉(zhuǎn)運體基因啟動子的甲基化可以阻礙乳腺癌細(xì)胞對氨甲喋呤(MTX)的聚集［6］。Nakayama等［7］對AML的MDR1基因甲基化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MDR1基因表達(dá)和啟動子5′末端甲基化狀態(tài)間存在負(fù)相關(guān)。朱燕等［8］發(fā)現(xiàn)ALL及多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者骨髓MDR1基因表達(dá)水平與基因轉(zhuǎn)錄起始點上游-110和150處兩個CCGG位點的甲基化程度呈負(fù)相關(guān)。

Lu等［9］在對206名卵巢癌患者M(jìn)DR1表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，MDR1的表達(dá)與p16有著密切的關(guān)系。有文獻(xiàn)表明，p53基因突變后腫瘤細(xì)胞凋亡受阻，導(dǎo)致對化療藥物敏感性減低［10］。

本試驗采用PCR法檢測到K562阿霉素耐藥株K562/A02的p16基因表達(dá)缺失，同時檢測了K562細(xì)胞株p16基因表達(dá)情況，證實了其p16基因也表達(dá)缺失，與文獻(xiàn)報道［11］一致。K562和K562/A02細(xì)胞株p16基因缺失是否與其過度甲基化有關(guān)，與耐藥又是否存在關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步試驗和探討。

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篇10

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞外基質(zhì)；間質(zhì)毛細(xì)血管；腎纖維化；巨噬細(xì)胞；成纖維細(xì)胞

[中圖分類號] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（a）-0045-04

The cellular and molecular basis of renal fibrosis

XIAO Chengcheng ZHANG Jie

Department of Urology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] The destruction of normal kidney parenchyma caused by fibrosis is a common cause of chronic kidney disease. Understanding the pathogenesis of renal interstitial fibrosis can provide a better treatment option for chronic kidney disease. Although complex， it can be mainly summarized as the following four aspects： ①Interstitial inflammatory reaction， which participates in the pathogenesis and repair process. ②Myofibroblast mainly derived from the renal interstitial cells （fibroblasts） forms a unique cell mass， which participates in the formation of extracellular matrix （ECM） and interstitial scars. ③Renal tubular epithelial cells participate in early kidney injury， and in the late kidney injury， they become the victim of fibrosis for the loss of the regenerative ability. ④The damaged integrity of interstitial capillaries results in the disruption of oxygen transport， and the incidence of a malignant cascade of hypoxia and oxidative stress aggravates renal injury and fibrosis. Due to the lack of sufficient blood vessel formation， the healthy capillary network can not be maintained. The importance of genetic and epigenetic factors has also been paid more attention. The incidence and development of cardiac syndrome is closely related to the high morbidity and mortality of renal fibrosis.

[Key words] Extracellular matrix； Interstitial capillaries； Renal fibrosis； Macrophages； Fibroblasts

慢性腎臟病的高發(fā)病率給社會和患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。普遍認(rèn)為纖維化造成的正常腎實質(zhì)破壞是導(dǎo)致慢性腎臟病漸進(jìn)性損傷的常見致病因素。盡管大量研究已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞和分子介質(zhì)，但尚未得到臨床驗證[1-4]。目前13%～16%的慢性腎臟病患者需行血液透析治療，遠(yuǎn)期他們可能需進(jìn)行腎移植治療，而慢性腎臟病所致的心血管疾病高患病風(fēng)險更使患者生存率明顯降低[5]。基礎(chǔ)科學(xué)研究的快速發(fā)展為研究新的治療方法提供了平臺。參與纖維化主要介質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，更為靶向治療的發(fā)展打下基礎(chǔ)。本文對腎纖維化的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)進(jìn)行綜述，為基礎(chǔ)研究及臨床工作提供參考。

1 腎纖維化的細(xì)胞與分子介質(zhì)

1.1 炎性細(xì)胞

慢性腎疾病的共同特點是巨噬細(xì)胞參與的間質(zhì)浸潤，其密度與移植腎存活率呈負(fù)相關(guān)[1]。在不同環(huán)境下，巨噬細(xì)胞可合成和分泌多種產(chǎn)物，包括生長因子和細(xì)胞因子[轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、血小板衍生生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子-α、γ-干擾素、肝細(xì)胞生長因子]，酶及其抑制劑（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、纖溶酶原激活因子、纖溶酶原激活物抑制物-1、膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑），基質(zhì)蛋白（膠原蛋白、纖連蛋白、凝血酶敏感蛋白）和許多其他產(chǎn)物（補體蛋白、凝血因子、生物活性脂質(zhì)、活性氧、一氧化氮、內(nèi)皮素等）[6]。已有實驗表明減少間質(zhì)中巨噬細(xì)胞的數(shù)量可減輕腎纖維化程度[7]。

多功能巨噬細(xì)胞與組織潛在損傷的關(guān)系已被公認(rèn)，其分子基礎(chǔ)在過去十年的重要科學(xué)進(jìn)展中已被闡明[8]。經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞與替代激活的M2型巨噬細(xì)胞來源于局部刺激下暴露的單核細(xì)胞。誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞形成的主要是γ-干擾素、脂多糖、腫瘤壞死因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，主要與組織損傷相關(guān)；而白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-13、糖皮質(zhì)激素、維生素D、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和TGF-β誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞形成，其可能促進(jìn)組織損傷的修復(fù)。當(dāng)務(wù)之急是確定兩者之間的微妙聯(lián)系。這依賴于基因、蛋白質(zhì)和代謝分析研究。例如Ⅰ型甘露糖受體，精氨酸酶-1的出現(xiàn)將抑制M2細(xì)胞。在可逆性肝損傷模型中，巨噬細(xì)胞的功能已被闡明。損傷誘導(dǎo)期抑制巨噬細(xì)胞可減輕纖維化[9]。纖維化是傷口愈合的重要組成部分，但還需要進(jìn)一步研究M2型巨噬細(xì)胞應(yīng)答后修復(fù)形成的正常腎實質(zhì)與導(dǎo)致慢性腎臟病的不良瘢痕的關(guān)系。這突出了體外介導(dǎo)巨噬細(xì)胞修復(fù)腎組織的治療潛力，有待動物實驗進(jìn)一步證實[10]。

1.2 肌成纖維細(xì)胞

肌成纖維細(xì)胞是最開始出現(xiàn)在纖維化腎間質(zhì)中的細(xì)胞群[2]，其出現(xiàn)是瘢痕形成必不可少的條件，已有研究表明，其數(shù)量與預(yù)后密切相關(guān)，其特征為由具有成纖維細(xì)胞形態(tài)特征的間質(zhì)細(xì)胞所分泌的α-平滑肌肌動蛋白（αSMA）。有研究證實肌成纖維細(xì)胞是瘢痕中基質(zhì)蛋白的主要來源，這表明肌成纖維細(xì)胞的存在是纖維化必不可少的條件。肌成纖維細(xì)胞的來源已在動物模型中被廣泛研究，但仍未達(dá)成共識。譜系追蹤研究采用了遺傳工程策略和不同的細(xì)胞追蹤方法，最終出現(xiàn)了相悖的結(jié)果[2，11-13]。αSMA本身可能不是促進(jìn)纖維化的蛋白，據(jù)報道，αSMA遺傳缺陷的小鼠會發(fā)生更嚴(yán)重的腎纖維化[14]。最近的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞亞群表達(dá)的甘露糖受體-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)[15]。不同細(xì)胞起源的肌成纖維細(xì)胞存在的功能異質(zhì)性還有待探索。

大部分肌成纖維細(xì)胞來源于內(nèi)源性腎細(xì)胞的遷移、增殖和轉(zhuǎn)化。腎成纖維細(xì)胞和微血管管周細(xì)胞是原始肌纖維母細(xì)胞的主要來源[16]。當(dāng)少量基質(zhì)產(chǎn)生時，成纖維細(xì)胞也可來源于髓質(zhì)細(xì)胞，然而在腎臟嚴(yán)重?fù)p害時，腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其總體數(shù)量較小，并持續(xù)存在至病程后期[17]。

1.3 腎小管上皮細(xì)胞

在慢性腎損傷誘導(dǎo)期，腎小管上皮細(xì)胞通過產(chǎn)生合成產(chǎn)物（活性氧、炎癥介質(zhì)等）主動參與損傷過程。多種來源于血漿或腎小球異常過濾的尿蛋白參與損害腎小管上皮細(xì)胞[3]。尿蛋白可以通過結(jié)合其相關(guān)受體激活特定的細(xì)胞反應(yīng)。替代激活途徑可被生化修飾或共軛尿白蛋白激活，包括近端小管受體介導(dǎo)蛋白的內(nèi)吞作用和激活其受體具體信號的反應(yīng)[18]。后一種途徑與刺激炎癥趨化因子（由正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌所調(diào)節(jié)的單核細(xì)胞趨化蛋白-1、IL-8、趨化因子、TGF-β、內(nèi)皮素）的合成有關(guān)。在何種程度上尿蛋白會激活腎小管上皮的細(xì)胞反應(yīng)尚不清楚，但這可解釋蛋白尿的程度與慢性炎癥及纖維化密切相關(guān)這一無可爭議的事實。

隨著纖維化的進(jìn)展，腎小管上皮細(xì)胞會加速凋亡和衰老，這使其失去再生能力。這一轉(zhuǎn)變可能涉及細(xì)胞周期的多種具體因素，例如自噬失敗、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和信號缺失等[19-21]。腎小管上皮細(xì)胞死亡是腎實質(zhì)損害的重要特征，非功能性腎小管和腎小球的出現(xiàn)會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。腎小管上皮細(xì)胞的組織學(xué)指標(biāo)與腎功能密切相關(guān)[22]。保護(hù)并再生功能性上皮細(xì)胞，維持腎單位的完整性和功能性是有效治療慢性腎疾病不可或缺的組成部分。新一代測序技術(shù)已經(jīng)揭示導(dǎo)致人類腎性營養(yǎng)不良的基因突變，如無翅型MMTV整合家族成員4，其為腎功能的再生研究奠定了堅實基礎(chǔ)[23]。

1.4 間質(zhì)毛細(xì)血管

腎臟代謝活動是高耗氧過程，已有研究對漸進(jìn)性纖維化與缺氧所致的慢性腎臟病進(jìn)行比較[4]。慢性腎損傷的早期，間質(zhì)微血管通透性增加[24]。因此，當(dāng)血漿蛋白如纖維蛋白原和白蛋白結(jié)合物漏入間質(zhì)（腎毛細(xì)血管滲漏綜合征）時，會發(fā)生炎癥和纖維化反應(yīng)。在慢性腎疾病中，致病的關(guān)鍵血漿蛋白尚未被確定，最可能是纖維蛋白，因為當(dāng)腎間質(zhì)中纖維蛋白減少時，αSMA含量會相應(yīng)降低[25]。雖然許多慢性疾病的特點是血管過度增生，但慢性腎臟病卻發(fā)生相反的變化――血管生成受阻，有效間質(zhì)毛細(xì)血管數(shù)量顯著下降。這使研究人員考慮使用血管生成因子或阻滯抗血管生成因子治療慢性腎臟病，但在進(jìn)行性腎瘢痕形成過程中，其作用被證實為無益的[26]。

缺氧-氧化應(yīng)激與腎纖維化緊密相關(guān)。腎小管細(xì)胞氧化應(yīng)激是慢性腎臟損傷的普遍特征，這可能是由于活性氧過度生成和抗氧化能力不足的后果。活性氧的特異性分子靶點對腎纖維化的作用還有待被探索，在將來我們可能會對其有更多的了解，因為代謝組學(xué)研究可以確定正常及纖維化腎臟中糖、核苷酸、氨基酸和脂類的具體分布。氧作為細(xì)胞信號分子的作用已被證實，也已證實其與纖維化途徑有關(guān)[27]。高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)使通過改善受損腎臟氧化還原能力的治療藥物出現(xiàn)成為可能。最近有實驗表明半胱胺具有抗腎纖維化的作用，其作用機制可能與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[28]。

2 纖維化反應(yīng)的遺傳和表觀遺傳學(xué)調(diào)控

同類原發(fā)性腎臟病患者的長期預(yù)后存在高度差異性是公認(rèn)的。毫無疑問，遺傳學(xué)起著重要的作用，最好的例子是腎臟病結(jié)局與種族的相關(guān)差異性。非裔美國人載脂蛋白L1基因型（G1和G2的風(fēng)險等位基因）與腎臟病預(yù)后密切相關(guān)，這是基因影響腎纖維化嚴(yán)重程度的最新例證[29]。

通過全基因組研究，探索慢性腎臟病的風(fēng)險與嚴(yán)重程度的關(guān)系，盡管無法確定其因果關(guān)系，并且基因的多態(tài)性未必導(dǎo)致蛋白功能改變，但人類慢性腎臟病全基因組關(guān)聯(lián)研究提供了鑒別新目標(biāo)人群的無偏方法，其潛在作用值得進(jìn)一步研究。在最近的幾項人全基因組關(guān)聯(lián)研究中，尿調(diào)節(jié)素（UMOD）被確定為慢性腎臟病的風(fēng)險及嚴(yán)重程度的重要決定因素[30]。UMOD基因編碼一N蛋白質(zhì)，在亨利髓袢升支和早期遠(yuǎn)端小管特異表達(dá)。盡管目前UMOD的基本功能未知，但其在正常人尿液中含量很高，蛋白編碼基因突變是以慢性腎小管間質(zhì)腎炎為特點的家族性腎臟病的已知誘因。隨著人類遺傳研究水平的提高，我們可以預(yù)見，在慢性腎臟病遺傳學(xué)領(lǐng)域?qū)⒂兄卮笸黄啤?/p>

非蛋白編碼基因序列的改變也可能影響纖維化過程，其機制可能包括DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA活動等。這些機制都有改變腎纖維化進(jìn)程的潛能，例如，在腎纖維化的實驗?zāi)Ｐ椭校褂萌ゼ谆瘎⒔M蛋白去乙酰化酶抑制劑和抗miRNA-21治療后，間質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞數(shù)目顯著減少。此外，已有研究證據(jù)表明在一些患病動物和人類組織樣本中，microRNA-21出現(xiàn)失調(diào)控[31-34]。反應(yīng)性纖維化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控為我們研究環(huán)境對基因調(diào)控通路的影響提供了新思路。

3 心腎綜合征

大多數(shù)慢性腎臟病患者沒有達(dá)到需要腎臟替代治療維持生命的地步，但他們中很多卻早卒于心血管疾病。慢性I臟病風(fēng)險的上升與心功能衰竭的發(fā)生幾乎呈指數(shù)級關(guān)系。在DuBose等[5]的一項研究中，eGFR60 mL/（min?1.73 m2）的人群高17倍。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、炎癥、平滑肌細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、血管鈣化等多種因素都可促進(jìn)心腎綜合征的發(fā)生。在減輕腎纖維化、高血壓和/或蛋白尿的同時，也應(yīng)減少心血管疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，提高患者的生存率。

在過去的20年中，基礎(chǔ)科學(xué)研究提高了我們對纖維化細(xì)胞和分子基礎(chǔ)的理解，使我們了解到正常結(jié)構(gòu)和功能的腎通過纖維化逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ軔夯哪I的過程。

盡管許多問題還有待解答，但我們必須從現(xiàn)在做起，將已有的研究成果轉(zhuǎn)變成有效預(yù)防、治療甚至治愈人類慢性腎疾病的策略。

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