基因重組范文

導語：如何才能寫好一篇基因重組，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

說起“電蟒云音響”這款產品，可以說是電蟒科技一群滿懷互聯網情懷的“大叔”們歷經三年潛心研究的成果，也是這群人嘗試跨界整合，用互聯網思維的方式，對音響市場、產品、企業價值鏈乃至整個商業生態進行重新審視，并集成大數據分析技術，為“不將就”的用戶們打造一個“越聽越懂你”的智能音樂平臺。

“6月舉行會，7月開始于京東接受預約，到7月16日為止，半月時間內電蟒云音響的預約數量達到樂51萬臺。”電蟒科技首席營銷官蔡偉杰說?！秷绦泄佟芬矠殡婒埔繇懰懔艘还P賬：按照1999元一臺計算，51萬臺意味著10.6億元的銷售！而在京東數碼產品當月的預約量排行榜看，第一名是華為的某款手機，第二名則是中興某款手機，而電蟒云音響緊隨其后。

對于這款產品為何受到市場如此熱捧，電蟒科技董事長趙輝曾對“電蟒云音響到底賣給誰”做了回應：“人在面對事情時，分三種本質：不將就、將就、猶豫。對于音樂需求，我們不考慮給猶豫的人做產品，搞來搞去不知道要什么，也不考慮給將就的人做產品，而這個市場很大，例如低端的藍牙音響、多媒體音響等，很多人已經做得很好了，我們就不要做小三了，我們只能為一種人做產品，就是不將就的人?！?/p>

好產品，不將就

電蟒的故事開始于2011年。喜馬拉雅廣告董事長趙輝跟國光電器的高管開始探討音響的發展，“如果我們可以把音響和音樂內容結合一起，甩掉播放器，那一定是一款很震撼的產品。”作為喜馬拉雅廣告的創始人，趙輝服務家電業十多年，深知行業發展之道。趙輝的想法與國光電器一位高管的想法一拍即合，便開始了這款顛覆性音響的嘗試。

3年前，以互聯網電視為突破口的互聯網產品的概念開始興起。對于第一代的電蟒音響，純屬于機緣巧合之做，或者說是整合資源的結果。電蟒科技首席營銷官蔡偉杰也對《執行官》表示，現在推出的電蟒云音響已經是他們團隊的第四代產品了。

“在之前的三代，第一代音質好，但是Linux系統兼容和擴展性差，系統體驗不好，被否定了；第二代系統使用安卓，卻沒有顯示屏幕；第三代有屏幕，體驗也好，但是觸控屏位置體驗差，原木外觀不接地氣，也被否定了；直到現在成型的鋁合金，過程中廢棄了上百萬的模具，應用現成的控制方案不易用，就自己開發了C-Play播放平臺?！辈虃ソ苷f，當時產品在第四代的時候，因為考慮到年輕人是否喜歡的問題，單是內部測試就征集了800多個年輕人的建議?！盎ヂ摼W產品需要突出‘人’，如果電蟒的使用需要復雜的過程才能實現，那么就是失敗的?！?/p>

據說，騰訊高級執行副總裁在試用電蟒云音響的軟件體驗和發燒音質后，對其有著極高的評價。電蟒云音響作為新的品類卻可以得到熱捧，的確有著其差異化優勢的一面?！皬漠a品上看，沒有一家企業在做云音響，因為同行都在做手機WIFI音響。而電蟒云音響不用連接手機或者其他播放器，一個音響滿足用戶所有播放需求。”作為一款智能化產品，電蟒的體驗性、友好性優勢十分突出。“電蟒的試用跟手機的使用一樣，非常容易操作，甚至不需要說明書。”蔡偉杰認為，電蟒在技術產異化、尖叫的價格和音質上贏得了市場的青睞，做到了“alin one”。

先后3年時間，從“大叔”可以接受的木質音響，到年輕人可以接受的金屬造型，電蟒的音質也隨著技術的成熟而不斷改進?！盎ヂ摼W產品就是實現客戶的‘尖叫’，這也是互聯網產品的核心?！倍麻L趙輝說。

對于“電蟒”的名字由來，也頗具互聯網味道?！拔覀兊漠a品在功能和外觀上可以讓人尖叫，但是名字卻太過普通。現在的互聯網品牌不是水果就是動物，于是我們想到了‘電蟒’，令人過目不忘?！睂τ凇疤祉崱边@個“好聽不好記”的名字，被這群“大叔”果斷放棄了。于是，第四代音響產品正式命名為“電蟒”。

基因重組，不用“饑餓”

作為電蟒科技的主導方喜馬拉雅廣告公司，在傳統家電行業服務了多年，積累了深厚的基礎。因此除了國光電器外，電蟒的背景也確實強大，不僅有廣晟資產、同方股份、喜馬拉雅廣告從研發到制造到組裝做一個強有力的技術支持，還有180萬首的云內容、DRA和DPS技術、智能軟硬件都使電蟒創造了一個比蘋果更純粹的閉環系統，更別說純藍牙智能音響BOSE，JBL之類的音響了。“他們所謂的自有ALL IN ONE云音響生態系統可稱得上絕對的自產?！币晃灰繇懡缛耸咳绱嗽u論電蟒。

從2011年開始，一批技術公司的加入，讓電蟒擁有了核心的技術能力。“任何數字音樂都有音質和壓縮的難題，為了保證音質和音頻細節的高質量，我們邀請了國內最成功的數碼公司加入?！辈虃ソ苷f，“華為的優勢在于有自己的核心技術，這是其他國產品牌手機無法比擬的。電蟒在成立之初也考慮到核心技術的問題，所以才想到了基因重組的方法，把最頂級企業的整合到供應鏈中?！?/p>

據了解，電蟒云音響之所以品質穩定，有賴于這些傳統制造業龍頭企業的支持?！耙驗楣湶淮嬖趩栴}，核心技術我們也掌握了，制造能力也很強大。對于我們基因中的傳統老牌企業，工藝領先，產品質量穩定可靠，這樣生產的產品才可以說互聯網產品。真正的互聯網產品不是尖叫一下，而是讓消費者尖叫一輩子！”蔡偉杰說。

篇2

【關鍵詞】基因重組 染色體 轉化

高中生物關于基因重組，有這樣的定義：基因重組是指在生物體進行有性生殖過程中，控制不同形狀的基因的重新組合。這樣的定義是依據高中學生的知識水平及教材的篇幅而給出的，雖說這句話本身不錯，但作為定義，卻又失嚴謹性和科學性，他易給高中生帶來片面的理解。

基因重組是自然界普遍發生的一種遺傳現象，它可發生在同種生物之間，也可發生在有一定關系的異種生物之間，且隨科學水平提高，人們可以打破物種間的限制，在人工條件下實現不同物種間的基因重組。因此，基因重組按其發生原因大致分為自然界的基因重組與人工條件下的基因重組兩大類。

一、自然界的基因重組

自然界發生的基因重組非常復雜，有同種生物間的基因重組，有不同種生物間的基因重組，有病毒與原核生物及真核生物間的基因重組。

1.真核生物的基因重組。高中生物學重點講述了有性生殖中的基因重組，主要表現在減數分裂時同源染色體間交叉時互換及非同源染色體間自由組合中的基因重組，它是導致同種生物多樣性的主要原因。

2.原核生物的基因重組。在原核生物中，其基因重組的方式主要有轉化、轉導和接合幾種形式。

（1）轉化。轉化是受體菌直接吸收來自供體菌DN段，通過交換，把它整合到自己的基因組中，在經過復制使其變成一個轉化子，它是同種或異種菌株間存在的普遍現象。

（2）轉導。通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體的媒介，把吧供體細胞DNA小片段攜帶到受體細胞，通過交換和整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現象稱為轉導。轉導現象在原核生物中普遍存在，在低等生物進化中，是一種產生新基因組合的重要方式。

3.轉座導致基因重組。在原核生物和真核生物中，還存在轉座現象，它是由可移位因子介導的遺傳物質重排現象。轉座中轉座單位稱轉座子，存在于DNA上并可自主復制與位移，根據轉座中轉座子是否復制把它分為復制型轉座子與非復制型轉座子，前者是通過復制而拷貝一個新的轉座子，而將原始轉座子常留在原來位置，拷貝轉座子出現于新位點而導致基因的重組；后者是不經復制，原始轉座子作為一個可移動實體直接被移到新位點，同樣導致基因重組。

轉座作用發生頻率低，但生物學意義很大，可說明細菌中發現許多基因缺失或倒轉現象，轉座現象出現于細菌、酵母、果蠅和玉米等不同生物中，導致這些生物體基因組中基因數目不固定。

二、人工條件下的基因重組

自然界的基因重組是生物體在長期進化過程中經過自然選擇過程而形成的，它體現在同種生物之間和有一定關系的不同生物之間。但隨科學水平的提高，人們已能超越生物體在長期進化中形成的基因重組，按人們的意愿來實現多數生物在自然界所不能完成的基因重組。

1.原生質體融合導致基因重組。通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發生融合，并進而發生遺傳重組以產生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩定的融合子的過程，成為原生質體融合。現在原生質體融合的重組頻率已大于1/10，可在屬間、種間甚至更遠緣的微生物或高等生物等生物體的細胞間實現融合，從而達到基因重組。

2.各種人工育種中體現基因重組。隨著科技水平的提高，自然界不能結合的異種性細胞，在人工條件下，使其結合而達到培育新品種的目的，這一切都是基因重組的結果。例如，無芒抗病類型水稻及三倍體西瓜的產生。誘變育種是通過基因突變而實現，因其產生新基因，相對于鄰近基因也發生了基因重組。例如，“黑農五號”“衛星87—2青椒”“航宇1號水稻”“豫麥13”的產生。

3.基因工程導致基因重組?；蚬こ淌侨藗冊诜肿由飳W理論指導下的一種自覺的、可事先設計與控制的育種新技術，是人工的、離體的、分子水平上的一種遺傳重組的新技術，是一種可完成超遠緣雜交的育種新技術。基因工程中有條件作為載體的，對原核受體細胞，有細菌質粒與噬菌體兩類；對真核動物細胞，主要有SV40病毒；對植物細胞來說，主要是Ti質粒。其中目的基因與載體DNA在體外完成重組，形成一個完整有復制能力的環狀重組載體—嵌合體，然后導入相應的受體細胞。

篇3

【關鍵詞】 乙型肝炎病毒；，RNA干擾；，腺病毒；，基因治療

Preparation of recombinant adenovirus mediated siRNA targeting HBVx gene and its suppressive effect on HBVx gene expression

【Abstract】 AIM: To construct the recombinant adenovirus vectors for siRNA targeting HBVx gene （HBx） and to evaluate the inhibitive effect on the expression of HBx gene in human hepatoma HepG2 cell line. METHODS: The shuttle vector pShuttleHBx was cotransfected into E. coli BJ5183 with adenovirus backbone plasmid. The homologous recombinants were transfected into HEK293 packaging cells and adenovirus was packaged and amplified， followed by infection of the HepG2 cells transfected with HBx gene. The expression levels of HBx were determined by RTPCR and Western Blot after the total RNA and protein were collected. RESULTS: The recombinant adenoviral vectors containing siRNA targeting HBx gene were successfully constructed， which were confirmed by restriction enzyme digestion. RTPCR results demonstrated that the HBx mRNA was markedly decreased and Western Blot results showed that the expression of HBx protein was also significantly reduced in HepG2 cell line. CONCLUSION: Adenovirusbased siRNA targeting HBx gene can inhibit HBx expression with great potency and specificity in vitro.

【Keywords】 hepatitis B virus; RNA interference; adenovirus; gene therapy

【摘要】 目的：構建針對乙型肝炎病毒x基因（HBx基因）的小干擾RNA (siRNA)重組腺病毒表達載體，并在能表達HBx基因的人肝癌細胞株HepG2中觀察其對HBx基因表達的抑制作用. 方法：重組腺病毒穿梭載體pShuttleHBx與骨架載體在大腸桿菌BJ5183中同源重組得到重組腺病毒載體，后者轉染HEK293細胞，包裝并擴增出病毒顆粒. 用獲得的病毒感染能表達HBx基因人肝癌細胞株HepG2，收集細胞總RNA和總蛋白，采用RTPCR和Western Blot方法檢測細胞中HBx基因表達的變化. 結果：經限制性內切酶酶切鑒定，證實針對HBx基因的siRNA重組腺病毒載體構建成功. RTPCR和Western Blot方法證實，在HepG2細胞中，HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低. 結論：腺病毒介導的針對HBx基因的siRNA在體外能夠高效、特異地抑制HBx基因的表達.

【關鍵詞】 乙型肝炎病毒；RNA干擾；腺病毒；基因治療

0　引言

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）基因組中，HBx基因編碼的HBX蛋白是HBV編碼蛋白中唯一具有多種調控功能的病毒蛋白質［1-2］，可以激活宿主細胞中受損DNA的修復［3-4］，并且同多種腫瘤相關分子有相互作用. 因此認為，HBX與肝細胞肝癌的發生和發展密切相關. RNA干擾(RNA interference， RNAi)是雙鏈RNA (doublestrand RNA， dsRNA)介導的、序列特異的轉錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing， PTGS）現象，其主要生物學功能在于抵抗病毒感染，維持基因組中轉座子的穩定性，清除異常RNA，并參與基因表達的調控［5-6］. 我們構建針對HBx基因重組腺病毒干涉載體，在人肝癌細胞株HepG2中檢測其對HBx基因表達的抑制效果，為乙型肝炎病毒感染以及感染后發生的肝細胞肝癌的基因治療提供新思路.

1　材料和方法

1.1材料

含有針對HBx基因的兩個干涉靶序列的干涉表達質粒pSUPERHBx2，pSUPERHBx5（干涉序列分別針對HBx基因的301~319位和198~216位），表達HBx基因的質粒pCNDA3.1HBxmyc，對照載體AdeasyH1，pCDNA3EGFP，大腸埃希菌DH5α，HEK293細胞以及人肝癌細胞HepG2（第四軍醫大學生物化學與分子生物學教研室）. pAdeasy1腺病毒重組系統（Stratgene公司）；限制性內切酶Xba I，Hind III和T4 DNA連接酶（ TaKaRa公司）；限制性內切酶Pac I和Pme I（New England Biolab公司）；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒（合肥優晶生物技術有限公司）；HDMEM培養基和RPMI 1640培養基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；LipofectAmineTM2000，RTPCR試劑盒和TRIZOLTM試劑（Invitrogen公司）； myc標簽， EGFP多克隆抗體（Santa Cruz公司）；兔抗人βactin多克隆抗體和辣根酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗（武漢博士德公司）；ECL化學發光試劑盒為（Pierce公司）. 用于擴增HBx基因的上游引物：5′TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3′，下游引物：5′TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′；用于擴增內參照βactin基因的上游引物: 5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′， 下游引物: 5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′；用于擴增EGFP基因的上游引物：5′ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3′， 下游引物：5′GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3′，上述引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成.

1.2方法

1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5載體的構建

經Xba I和Hind III雙酶切反應，從pSUPERHBx2，pSUPERHBx5質粒獲取RNAi表達框片斷HBx2和HBx5（大小300 bp左右），將兩目的片斷回收后亞克隆入同樣經Xba I和Hind III雙酶切的腺病毒穿梭質粒pShuttle，卡那霉素選擇性培養基篩選陽性克隆，提取質粒，用Xba I和Hind III雙酶切，10 mL/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定. 獲得含小干擾RNA (short interfering RNA， siRNA)表達框的腺病毒穿梭質粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.

1.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5載體的構建

將pShuttleHBx2，pShuttleHBx5質粒用Pme I酶切線性化，與pAdeasy1按10∶1的比例電轉化至BJ5183感受態細菌. 卡那霉素選擇性培養基篩選陽性克隆，挑取較小的克隆擴增培養，提取質粒. 用Pme I酶切鑒定質粒，將鑒定正確的重組質粒再次轉化DH5α感受態細胞，擴增陽性克隆并大量提取質粒，得到含針對HBx干涉表達框的重組腺病毒質粒. （陰性對照質粒AdeasyH1為帶有H1啟動子的pAdShuttle質粒，用Pme I酶切線性化后與pAdeasy同源重組得到）.

1.2.3重組腺病毒的包裝與病毒滴度測定

①包裝細胞培養：含100 mL/L胎牛血清的HDMEM培養基，37℃，50 mL/L CO2培養箱中培養HEK293細胞，當細胞匯合度達70%~80%時轉染. ②重組腺病毒質粒轉染HEK293細胞：重組質粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用Pac I酶切線性化后回收，按照LipofectAmineTM2000說明書轉染6孔培養板中的HEK293細胞，37℃，50 mL/L CO2培養箱中孵育，10~12 d后收集細胞，液氮與37 ℃兩個溫度下反復凍融4次，裂解細胞以收獲原始病毒，病毒感染HEK293細胞使病毒大量擴增. 重復上述步驟，最終收集3輪擴增的病毒液，分裝保存于-70℃. ③病毒滴度的測定：用 TCID法檢測病毒滴度后，得到1×1010 pfu/mL的病毒工作液.

轉貼于

1.2.4RTPCR檢測

重組腺病毒對HBx基因mRNA的降解作用制備的重組腺病毒感染人肝癌細胞株HepG2，同時轉染表達HBx基因的質粒pCNDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP，后者用來監測各組轉染效率，對照組轉染只含有H1啟動子的質粒AdeasyH1. 37℃，50 mL/L CO2培養箱中孵育，48 h后，分別收集細胞總RNA和蛋白. 通過RTPCR檢測HepG2細胞HBx轉錄水平的變化：提取實驗組和對照組HepG2細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，取5 μg總RNA按照SuperScriptTM Ⅱ說明書進行cDNA第一鏈的合成 ，以反轉錄得到的cDNA為模板在PE2400型DNA擴增儀上進行PCR反應. HBx PCR條件為：95℃變性5 min，再95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環，最后72℃延伸5 min. 反應產物為HBx基因片段，長度為464 bp；內參照βactin基因擴增條件為：95℃變性3 min后，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共20個循環，最后72℃延伸5 min，擴增片斷大小為438 bp；EGFP基因PCR反應參數為：95℃變性5 min，再95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，共27個循環，最后72℃延伸5 min，反應產物為538 bp. 10 mL/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，比較干涉組與對照組mRNA水平表達差異.

1.2.5Western Blot檢測

重組腺病毒對HBX蛋白表達的影響用100 μL的細胞裂解液裂解上述各組細胞，4℃ 10 000 g離心20 min，收集上清液，加入等量2×SDS Loading Buffer， 煮沸5 min， 每孔上樣30 μL， 蛋白樣品經SDSPAGE分離后， 電轉移到硝酸纖維素膜上. 依次加入5 g/L脫脂奶粉（室溫封閉2 h）， 1∶200 myc標簽抗體和EGFP抗體（室溫孵育2 h）， 1∶2000的HRP酶標羊抗兔二抗（室溫孵育1 h）. 用TBST緩沖液洗滌后，加入底物發光劑ECL 1 mL，反應5 min后吸干發光劑，用單層透明薄膜包裹后曝光，X光膠片顯影.

2　結果

2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5載體的鑒定

用Xba I和Hind III雙酶切構建的腺病毒穿梭質粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5，得到6300 bp及300 bp左右的片斷（圖1），與預期大小一致，證明穿梭質粒構建成功.

2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5載體的鑒定

用Pme I分別酶切重組質粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5，得到23 000 bp和4300 bp兩個片斷（圖2），結果與預期一致，證明骨架質粒同源重組成功.

2.3重組

pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5腺病毒的包裝含重組腺病毒的質粒轉染包裝細胞HEK293，培養1 wk后，顯微鏡下可見特征性圓球狀及葡萄串樣聚合的細胞病理性改變；電鏡下可見病毒感染后的死細胞，胞體腫脹，胞膜不完整，細胞內充滿病毒顆粒（圖3A，圖中箭頭所示即為病毒顆粒）， 以及感染細胞的胞核，內有成堆的病毒顆粒（圖3B，圖中箭頭所示為病毒顆粒）. 第10日，可見大部分包裝細胞腫脹脫落，細胞出現細胞病理反應（cytopathological effect，CPE）樣變化.

A： 病毒感染的包裝細胞 ×4000； B： 包裝細胞胞質內的病毒顆粒 ×40 000.

2.4共轉HepG2細胞觀察HBx基因表達情況

包裝完成的病毒顆粒以30 MOI感染人肝癌細胞株HepG2，48 h后，分別收集細胞總RNA和蛋白，檢測其變化. RTPCR結果表明，與未處理組和轉染空載體組細胞相比，感染腺病毒組細胞的HBx基因mRNA量明顯降低（圖4A）；Western Blot結果顯示，感染腺病毒可使細胞HBX蛋白的表達量顯著減少（圖4B）.

3　討論

目前，在我國廣泛應用的抗HBV藥物主要有兩類，即α干擾素和核苷類藥物如拉米夫定等. 但療效均不理想，新型有效的抗HBV藥物仍在探索中. RNAi用于HBV治療在理論上具有以下優點［7］：特異性降解HBV mRNA，從而阻止病毒復制，對已整合入宿主細胞基因組的前病毒及無復制活性的病毒，RNAi也可以起到有效的抑制作用，這是通常抗病毒藥無可比擬的. 其次，RNAi可以針對病毒基因保守區發揮作用，從而限制病毒產生逃避突變株的能力. 因而，RNAi技術為各類慢性HBV感染開辟了新的途徑. 有學者認為RNAi技術應用于抗HBV治療，有望成為治療乙型肝炎的革命性新方法，將有巨大的社會價值［8］. 腺病毒載體是目前基因治療研究和臨床試驗中應用最廣泛的病毒載體之一. 由于腺病毒載體宿主范圍廣，感染效率高，可插入外源基因片段大，可介導外源基因短時呈高水平表達和不整合到感染細胞的基因組中等特點［9］.

在本實驗中，我們采用He等［10］創建的pAdeasy腺病毒載體系統，通過細菌體內同源重組的方法，構建針對HBVx基因的兩個不同位點的siRNA重組腺病毒載體. 該方法不但發揮了重組腺病毒高效、安全等優點，同時，還具有重組效率高，包裝時間短等特點. 腺病毒載體介導的RNA干擾克服了以往用質粒作為siRNA輸送載體轉染效率低的缺陷.

實驗中我們使用RTPCR， Western Blot的方法在mRNA水平和蛋白質水平證實針對HBx基因的siRNA重組腺病毒有效地抑制了HBx基因的表達.

本實驗表明腺病毒是一種有應用前景的抗HBV感染的基因治療載體， 其可為慢性HBV感染以及HBV感染后發生的肝細胞肝癌的基因治療提供新思路.

【參考文獻】

［1］Birrer RB，Birrer D，Klavins JV，et al.Hepatocellular carcinoma and hepatitis virus ［J］. Ann Clin Lab Sci，2003，33(1):39-54.

［2］Hwang GY，Lin CY，Huang LM，et al.Detection of the hepatitis B virus X protein(HBX) antigen and antiHBX antibodies in cases of human hepatocellular carcinoma［J］. J Clin Microbiol，2003， 11(12): 5598-5603.

［3］Tang H， Delgermaa L， Huang F， et al. The transcriptional transactivation function of HBx protein is important for its augmentation role in hepatitis B virus replication［J］. J Virol， 2005，79(9): 5548-5556.

［4］彭紹華，厲浩，鄧紅，等.HBx蛋白和p53蛋白對細胞凋亡的調節及其在肝細胞癌發生中的作用［J］.腫瘤防治雜志，2003， 10（8）: 792-794.

［5］Novina CD，Sharp PA.The RNAi revolution［J］.Nature，2004，430:161-164.

［6］Dorsett Y， Tuschl T. siRNAs: Applications in functional genomics and potential as therapeutics ［J］. Nat Rev Drug Discov，2004，3:318-329.

［7］Shlomai A， Shaul Y. Inhibiyion of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference ［J］. Hepatology，2003，37(4):764-770.

［8］張巖，劉家云.RNA干擾技術抗乙型肝炎病毒的實驗研究進展［J］.醫學研究生學報，2005，18:454-457.

篇4

作者：姜立 馬文麗 柯杰兵 彭翼飛 李晉 徐兵 鄭文嶺

【摘要】 目的 構建人鳥氨酸脫羧酶抗酶（OAZ）突變基因，重組至原核表達載體中并表達出重組蛋白。方法 采用基因定點突變技術在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位堿基T堿基缺失，使核糖體的閱讀框+1移位，連續表達OAZ基因的ORF2部分。測序鑒定后，重組質粒轉化BL21菌，進行突變基因的蛋白表達。結果 重組質粒經測序后確認202位堿基T缺失，其余堿基序列無變化。重組的突變基因轉入BL21后在IPTG誘導下表達OAZ全長蛋白，SDS-PAGE分析在相對分子質量45 900左右出現新的蛋白條帶。結論 成功構建人OAZ突變基因重組質粒，轉化BL21后表達出融合的OAZ全長蛋白，為進一步研究其臨床應用打下基礎。

【關鍵詞】 鳥氨酸脫羧酶抗；突變；蛋白表達

鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的關鍵酶，催化多聚胺生物合成途徑中的第一步——鳥氨酸向腐胺的轉變。隨后，腐胺再轉變為亞精胺、精胺。ODC是該代謝途徑的限速酶，在此過程中扮演著重要的調控酶角色，其活性可在轉錄、翻譯和翻譯后水平受到精確的調控。鳥氨酸脫羧酶抗酶（ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）是在翻譯后水平的一種調控形式，它可以連接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，從而負性調控細胞內多聚胺含量。有研究表明，細胞內OAZ的過度表達在降低細胞內多胺水平的同時還能抑制細胞的生長。由此推測，OAZ在細胞的生長與分化過程中擔任著重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表達有一個非常有趣的移位翻譯現象，其表達受到精胺的一個稱之為frame-shifting的核糖體移位的調控。多聚胺通過這種較罕見的調控機制誘導OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在細胞內的濃度，使細胞在一個穩定的多聚胺水平進行正常生長分化。OAZ轉錄本的編碼存在兩個不同的閱讀框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其實是一個由短的非保守的ORF1產物和高度保守的ORF2產物的組合。在OAZ mRNA的閱讀框中，需要有一個+1的翻譯移碼過程。在ORF1的5′端終止密碼子處，通常序列為TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻譯框架達到TGA時，如果沒有精胺的存在，核糖體將接受TGA為終止密碼子，翻譯到此終止。當精胺濃度一定時，核糖體的翻譯即可受到精胺的調控進行+1移碼，躍過終止密碼子TGA上的T，以GAT指導的天冬氨酸為后續，翻譯合成ORF2［4-5］。翻譯框架移碼受到細胞內多聚胺水平上升的正調控，表達出的OAZ蛋白又能調節ODC的酶活性，反向調節細胞內多聚胺的水平，從而影響到細胞的生長及分化。在生長旺盛的腫瘤組織中，普遍發現了ODC的高表達，因此，OAZ蛋白特有的調控ODC活性的功能，就使之成為腫瘤免疫治療的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表達受到精胺的誘導，缺乏精胺時，核糖體將不能進行+1的移位，翻譯完整的全長OAZ蛋白。為此，本研究對OAZ基因進行了特定T堿基的缺失突變，成功構建至表達載體pET-32a中，測序確認后命名為pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表達出OAZ全長蛋白，將對進一步研究該基因的功能以及以OAZ為靶點的腫瘤核酸疫苗的制備，具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試劑 大腸桿菌DH5α、BL21和表達質粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild質粒由本實驗室保存。QuikChange定點突變試劑盒購自Stratagene公司。質粒純化試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒、T4DNA連接酶、XhoⅠ和EcoRⅠ內切酶均購自TaKaRa公司，其余生化試劑均為國產分析純。 引物根據OAZ基因所需點缺失堿基處進行設計2條反向互補引物對P1與P2。 P1：5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′；P2：5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。

1.2 方法

1.2.1 反向PCR擴增 以pET-32a-OAZ-wild質粒為模板進行PCR 反應: 將pET-32a-OAZ-wild質粒(10 mg/L) 1 μl、dNTP 1 μl、10×Buffer 5 μl、P1與P2 引物 ( 100 mg/L)各2.5 μl、PfuTurbo DNA多聚酶(2.5 ×106 U/L) 1 μl、雙蒸餾水37 μl 加入PCR 管; 95℃預變性30 s后， 95℃ 30 s、55℃ 1 min、68℃ 6 min ，共 18個循環。PCR 產物置于冰上2 min ， 加入1.5 μl DpnⅠ內切酶(106 U/L)， 37 ℃水浴2 h，酶解模板DNA。

1.2.2 轉化大腸桿菌DH5α 取感受態大腸桿菌50 μl， 加入上述DpnⅠ處理液10 μl， 輕輕混勻， 冰浴30 min 42℃熱休克45 s 冰上2 min，加入預熱的LB 培養液0.5 ml， 置于37℃恒溫搖床中， 200 r/min 振搖1 h。

1.2.3 質粒擴增、提取及鑒定 取200 μl 菌液鋪到LB 瓊脂培養板( 含Amp) 上， 37℃培養12～16 h。挑取單菌落，提取質粒。取質粒5 μl， 選取插入片段兩端的酶切位點XhoⅠ和EcoRⅠ 雙酶切，酶切產物經0.8%瓊脂糖凝膠進行分析鑒定。含目的基因的質粒經測序驗證目標堿基缺失后，命名為pET-32a-OAZ-mutation。

1.2.4 重組蛋白表達 將含有pET-32a-OAZ-mutation的質粒轉化BL21菌，鋪板挑陽性菌落并酶切鑒定為陽性菌落后，接種至含5 ml LB培養基中（含氨芐青霉素）振培過夜。次晨取100 μl接種至新的5 ml LB培養基中，37℃振培3～4 h，至D值約為0.6時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.5 mmol/L，繼續培養2 h和4 h后取菌液1 ml，進行15%的SDS-PAGE電泳鑒定表達產物，以轉染空pET-32a質粒的BL21菌在同等條件下用IPTG誘導為陰性對照。

2 結 果

2.1 pET-32a-OAZ-mutation測序圖 PCR擴增后，DpnⅠ酶切產物并轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，鑒定含有目的基因后，抽提質粒，以T7啟動子序列為測序引物序列于ABI3730測序儀進行DNA序列測定，確定OAZ基因的TGCTCCTGATGCC(196~208)處的202位T已缺失，其余序列沒有變化(測序圖中的第312~323號序列為TGCTCC GATGCC，顯示T已缺失)。見圖1。

2.2 重組pET-32a-OAZ-mutation在BL21宿主菌中的蛋白表達 SDS-PAGE分析結果顯示，經IPTG誘導的含重組質粒BL21與對照菌相比，在相對分子質量為45 900位置上出現1條新帶。見圖2。圖1 T7啟動子測序結果圖

圖2 表達產物SDS-PAGE圖

MMarker；1BL21菌；2轉化pET-32a質粒的BL21菌；3轉化pET-32a-OAZ-mutation質粒的BL21菌，經IPTG誘導后2 h；4轉化pET-32a-OAZ-mutation質粒的BL21菌，經IPTG誘導后4 h

3 討 論

細胞的生命活動需要多聚胺(polyamine)類物質，包括腐胺(putrescine)、亞精胺(spermidine)和精胺(spermine)。多聚胺幾乎是所有活細胞的必要組分，它們的缺失將導致細胞生長減少甚至死亡，但是當它們的含量升高時也會有致癌作用并且可以誘導細胞凋亡［6-7］。有研究表明，細胞內OAZ的過度表達除了能降低細胞內多胺水平，還能抑制細胞的生長。而OAZ能夠特異地拮抗ODC的催化活性，減少細胞內多胺的生成，因此成為研究抑制腫瘤細胞惡性增殖的切入點［8］。

從最初哺乳類動物細胞中克隆出OAZ基因至今，已陸續發現有OAZ1、OAZ2和特異性的OAZ3基因。其中OAZ1，也就是通常所說的OAZ基因，其表達的蛋白產物對于ODC有特異性的拮抗作用。OAZ的的抑制作用不是直接降解ODC，而是OAZ與ODC結合后，通過26S蛋白酶降解ODC，是一種在翻譯后水平調節酶活性的機制。ODC是一個二聚體酶，亞基間的聚合與解聚非常迅速。OAZ對于ODC單體蛋白有非常高的親和力，形成AZ∶ODC的蛋白聚合體，促進ODC被26S蛋白酶降解［7～11］。人OAZ蛋白是由兩段ORF的表達框所翻譯表達，在第一個表達框的終止密碼子處，有一個核糖體移位位點，在精胺誘導下，出現程序性的閱讀框的移位。越過終止密碼子，繼續住下游翻譯，直至第2個表達框的終止密碼子處。全部蛋白共由228個氨基酸所組成，其中ORF1編碼N末端68個氨基酸，ORF2編碼C末端160個氨基酸。ORF2編碼的C末端氨基酸序列是真正發揮抗酶活性的肽鏈區段，但是該區段的蛋白表達需要在精胺的誘導下才能出現，因此增加了對于OAZ全長蛋白調控機制的研究難度。

故此，本研究通過定點突變技術，成功地使OAZ基因ORF1與ORF2間的核糖體移位位點發生缺失，也就是使ORF1的終止密碼子的TCCTGATGCC的T發生缺失，使核糖體按照隨后GAT GCC的三聯體順序進行翻譯，無需精胺的誘導即可表達出完整的OAZ蛋白。由于選用質粒pET-32a作為原核表達載體，OAZ蛋白表達的同時，還在其C末端攜帶有多聚組氨酸的標簽，可通過His標簽蛋白進行純化，為進一步研究其在腫瘤細胞中的調控機制提供了條件，為開發其臨床應用奠定了基礎。

參考文獻

［1］ Schipper RG， Cuijpers VM， De Groot LH， et al. Intracellular localization of ornithine decarboxylase and its regulatory protein， antizyme-1［J］. J Histochem Cytochem， 2004，52(10):1259-1266. ［2］ Mangold U. The antizyme family: polyamines and beyond［J］. IUBMB Life， 2005，57(10):671-676.

［3］ Newman RM， Mobascher A， Mangold U， et al. Antizyme targets cyclin D1 for degradation. A novel mechanism for cell growth repression［J］. J Biol Chem，2004，279(40):41504-41511.

［4］ Schenkel H， Hanke S， Cecilia De Lorenzo， et al. P elements inserted in the vicinity of or within the Drosophila snRNP SmD3 gene nested in the first intron of the Ornithine Decarboxylase Antizyme gene affect only the expression of SmD3 ［J］. Genetics， 2002， 161(2):763-722.

［5］ Gerner E， Meyskens F Jr. Polyamines and cancer: old molecules， new understanding［J］. Nat Rev Cancer， 2004，4(10):781-792.

［6］ Fong LY， Feith DJ， Pegg AE， et al. Antizyme overexpression in transgenic mice reduces cell proliferation， increases apoptosis， and reduces N-nitrosomethylbenzylamine-induced forestomach carcinogenesis ［J］. Cancer Res，2003，63(14):3945-3954.

［7］ Sakata K， Kashiwagi K， Igarashi K. Properties of a polyamine transporter regulated by antizyme［J］. Biochem J， 2000， 347 Pt 1:297-303.

［8］ Hoffman DW， Carroll D， Martinez N， et al. Solution structure of a conserved domain of antizyme: a protein regulator of polyamines ［J］. Biochemistry， 2005，44(35):11777-11785.

［9］ Gandre S， Bercovich Z， Kahana C. Ornithine decarboxylase-antizyme is rapidly degraded through a mechanism that requires functional ubiquitin-dependent proteolytic activity ［J］. Eur J Biochem， 2002，269(4):1316-1322.

［10］ Murai N， Murakami Y， Matsufuji S. Identification of nuclear export signals in antizyme-1［J］. J Biol Chem， 2003，278 (45):44791-44798.

篇5

[關鍵詞]SFRP2；腺病毒；增生性瘢痕；成纖維細胞

[中圖分類號]R318 [文獻標識碼] [文章編號]1008-6455（2012）11-1981-04

成纖維細胞作為創傷愈合時的主要效應細胞，在包含增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在內諸多以過度增生為特征的病變中，常常表現為凋亡抑制，進而引發一系列連鎖反應造成創面修復失控并最終導致過度纖維化而形成增生性瘢痕[1]。我們過去運用從基因芯片中篩選出一個具有抑制細胞凋亡作用、在早期增生性瘢痕中呈顯著高表達的基因SFRP2[2-3]，該基因可能在增生性瘢痕形成的過程中起著重要作用。但是目前SFRP2調控增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的分子機制尚不明了，有必要進行進一步研究。

本實驗利用pAd-Easy腺病毒載體系統[4]，通過PCR擴增SFRP2基因，克隆到腺病毒載體pAdEasy共轉染293細胞，構建攜帶SFRP2基因的重組腺病毒，在體外感染人增生性瘢痕成纖維細胞以觀察SFRP2基因表達情況，為進一步研究該基因的功能奠定理論和實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料：pGBKT-SFRP2質粒（袁順宗博士惠贈）。感受態菌株及293細胞株（我院燒傷研究所）；RPMI-1640培養基、胎牛血清（美國Haclon公司）。限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶、pMD18-T載體、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000（Takara公司）。Lipofectamine2000（Invitrogen公司）。Trizol及RT-PCR試劑（美國Invitrogen公司）。逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司）。兔抗人SFRP2多克隆抗體（美國CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 增生性瘢痕成纖維細胞的分離培養：采用組織塊法[6]進行增生性瘢痕成纖維細胞的原代培養，具體方法如下：將手術中取下的增生性瘢痕標本仔細切除皮下脂肪組織和表皮，用加有青霉素和鏈霉素的消毒蒸餾水洗滌3次，再用消毒生理鹽水漂洗3次；在少量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中用鋒利的刀片將組織切割成約1mm大小的塊，并接種于25ml的培養瓶中，置于37℃，5% CO2的孵箱中培養，待長成致密層以后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化傳代，實驗所用的是第3～6代的細胞。

1.2.2 SFRP2編碼序列的擴增：采用Primer5.0軟件設計擴增人SFRP2基因氨基酸區域編碼序列的特異性引物，并在引物5'端引入保護性堿基和限制性酶切位點，其中，上游引物序列為：5'-GAAGATCT ATGCTGCAGGGCCCTGGC-3'，下游引物序列為：5'-TTGTCGAC CTAGCACTGCAGCTTGCGGATG-3'（畫線部分分別為BglII和SalI酶切位點）。以pGBKT-SFRP2質粒為模板進行PCR擴增，擴增體系組成為：5μl 10×PCR緩沖液、1μl 10mmol/L dNTPs、pGEX-IL-24重組質粒模板2μl、10μmol/L引物各1μl及DNA聚合酶1μl，用雙蒸水補足至50μl。擴增程序為：94℃變性5 min，然后用逐步程序94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min完成30個循環，最后72℃延伸7 min。

1.2.3 SFRP2重組腺病毒表達載體的構建：2%瓊脂糖凝膠回收SFRP2擴增產物，與pMD19-T載體連接并轉化到DH5α菌中，藍白斑初步篩選，挑取單菌落提粒，BglII和SalI雙酶切及PCR鑒定，鑒定正確的質粒經BglII和SalI雙酶切，膠回收SFRP2目的片段，與線性化的pAdTrack-CMV載體相連接，轉化DH5α菌，BglII和SalI雙酶切鑒定并進行測序。測序正確的重組載體命名為pAdTrack-CMV-SFRP2。PmeⅠ單酶切消化10μg pAdTrack-CMV-SFRP2重組質粒，純化回收后獲得線性化載體，然后與0.1μg骨架質粒pAdEasy-1在2.5 kV，200Ω，25μF條件下電穿孔共轉化20μl BJ5183感受態細胞，卡那霉素抗性平板37℃培養16 h，挑取針尖大小的克隆，PacⅠ酶切鑒定正確后，再轉化DH5α菌中擴增。鑒定正確的重組載體命名為Ad-SFRP2，進行掃描獲取圖像。

1.2.4 SFRP2重組腺病毒的包裝與制備：按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，取10μgPacⅠ酶切線性化的Ad-SFRP2轉染HEK293細胞。轉染后7～10天熒光顯微鏡觀察，根據綠色熒光蛋白GFP和細胞病變效應判斷病毒產生。收集細胞，磷酸鹽緩沖液重懸，-80℃和37℃反復凍融4次，12 000 r/min離心10 min，收集病毒上清，-80℃保存，取部分病毒上清液，再次感染HEK293細胞擴增腺病毒，按TCID法測定病毒滴度。

1.2.5 SFRP2重組腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細胞：原代培養的增生性瘢痕成纖維細胞經第3次傳代后，在150 mL/LDMEM中培養24h。將Ad-SFRP2純化病毒按其TCID50值加入到細胞培養基中，每15min輕搖1次，共4次，4h后換液。

1.2.6 RT-PCR檢測SFRP2表達水平：按Trizol試劑盒說明書分別提取Ad-SFRP2感染24h后的實驗組和陰性對照組增生性瘢痕成纖維細胞的總RNA。RT-PCR反應按照Fermentas反轉錄PCR試劑盒說明書進行操作，利用PrimerPrimer 5.0設計SFRP2的鑒定引物：上游5'-TGGGGGAAACGGTCGCACTC-3'，下游5'-GGCCACGAGACCATGAAGGAGG-3′。 PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃40s，35個循環；最后延伸72℃5 min。以GAPDH作為內參照（退火溫度55℃，25個循環），GAPDH上游引物5'-ACCCATCACCATCTTCCA GGAG-3'，下游引物5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'（上海生物工程技術服務有限公司合成），PCR反應結束后取10μL反應產物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶。

1.2.7 Western blot檢測SFRP2表達水平：分別收集感染Ad-SFRP2 24h后和對照組細胞，提取蛋白。BCA法進行蛋白定量，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水浴5min，按照蛋白定量結果進行加樣，行120g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素（NC）膜上。NC膜用50g/L脫脂奶封閉1h，加入SFRP2 pAb （1∶500）或GAPDH mAb（1∶1000）工作液，4℃過夜，兔抗人二抗（1∶4000）于室溫下孵育1h，用ECL發光，膠片顯色，分析結果，以GAPDH作為內參照。

2 結果

2.1 PCR擴增產物電泳結果：以pGBKT-SFRP2質粒為模板，PCR擴增產物為單一條帶，大小約904bp，見圖1。

2.2 SFRP2重組腺病毒載體的構建：將擴增產物克隆入pMD19-T載體，BglII和SalI雙酶切和PCR鑒定確認獲得陽性重組克?。▓D2）。進而將SFRP2片段亞克隆至pAdTrack-CMV載體，BglII和SalI雙酶切鑒定并經測序確認獲得陽性重組克隆，命名為pAdTrack-CMV-SFRP2（圖3、圖4）。線性化的pAdTrack-CMV-SFRP2質粒與骨架質粒pAdEasy-1在BJ5183菌中進行同源重組，PacⅠ酶切鑒定陽性重組子，可見1條約30 kb的片段和1條4.5 kb的小片段（圖5），表明同源重組成功，獲得SFRP2重組腺病毒載體，命名為Ad-SFRP2。同時，采用同樣方法，將pAdTrack-CMV空載體與骨架質粒pAdEasy-1進行同源重組，重組子命名為Ad-EGFP。

2.3 SFRP2重組腺病毒的包裝擴增及鑒定：用脂質體轉染293細胞有大量GFP表達，并可見細胞變圓呈串珠樣聚集（圖6），裂解粗提物中提取重組病毒DNA，PCR鑒定證實重組病毒基因組中含有目的基因SFRP2，提示重組質粒在293細胞轉染成功。收集病毒液，反復轉染293細胞最終得到滴度約為2.0×1010pfu/mL的重組腺病毒。

2.4 RT-PCR檢測結果：感染的增生性瘢痕成纖維細胞中提取mRNA的RT-PCR電泳結果顯示，以GAPDH為陽性對照，未感染病毒的增生性瘢痕成纖維細胞SFRP2、感染空病毒的增生性瘢痕成纖維細胞SFRP2與感染SFRP2腺病毒的增生性瘢痕成纖維細胞SFRP2表達一致。其產物為904bp特異條帶，且SFRP2腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細胞后SFRP2基因表達明顯增高（圖7）。

2.6 Western blot檢測結果：用SFRP2多克隆抗體進行Western blot檢測，以GAPDH為陽性對照，結果證實感染重組腺病毒載體在增生性瘢痕成纖維細胞中SFRP2有較高的穩定表達（圖8）。

3 討論

SFRP2是一個位于4號染色體q31.3，其全長約2kb，編碼大小約34kD的可溶性蛋白質，表達于胞漿，但也可分泌至胞外發揮作用。SFRP2蛋白所屬的SFRP家族具有富含半胱氨酸的結構域，該結構域同源于細胞表面卷曲受體（Frizzled receptors）的Wnt結合位點，但是SFRP2缺乏跨膜結構[5]。目前的研究表明，SFRP2通過調控Wnt信號為主要途徑的方式發揮其調節細胞抗凋亡的作用。表現為：①心肌修復過程中，SFRP2通過阻斷Wnt3a信號途徑、增加細胞核內β-catenin表達以對抗缺氧/復氧誘導的凋亡作用，從而調控心肌細胞修復[6]；②胃癌中過表達的SFRP2通過下調β-catenin-TCF/LEF的下游靶基因如LEF1，cyclin D1，MMP-7等來抑制Wnt信號，調節癌細胞的增殖與凋亡[7]；③乳腺癌中SFRP2主要通過活化NF-κB或抑制JNK信號來發揮其抗凋亡作用。同時SFRP2還可以通過與促進ECM中的纖維連接蛋白-整合素受體復合體（fibronectin-integrin receptor complexes）形成從而活化黏附斑激酶（FAK）及其下游信號途徑PI-3K-Akt來抑制細胞凋亡[8]。

除了抑制凋亡之外，SFRP2對細胞增殖、分化和運動也還具有一定的調節作用，并且SFRP2基因的甲基化被認為可用來作為糞便中結直腸癌的篩選標志[9-12]。文獻復習還提示SFRP2的高表達可以促進結締組織生長因子（CTGF）的基因表達水平增高[6]，而CTGF在HS組織中既可以促進Fb增生，又可以促進Fb-肌Fb轉分化和膠原合成[13]。

綜合上述內容，我們認為SFRP2在增生性瘢痕組織成纖維細胞中的高表達其主要作用可能在于引起成纖維細胞的凋亡抑制，同時還可能與成纖維細胞的增殖相關。根據既往文獻研究，我們進一步推測其調節增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的分子機制可能與Wnt信號相關，但也不排除還存在著新的信號途徑。然而以上推測尚需進一步的實驗證明。

本研究構建SFRP2重組腺病毒載體，在293細胞中表達、包裝、純化病毒后成功構建了攜帶SFRP2重組腺病毒。并且初步研究結果表明該重組病毒在體外能有效感染正常增生性瘢痕成纖維細胞，受感染細胞能高效穩定的表達重組蛋白，為下一步研究SFRP2對病毒自身的復制與增殖以及宿主細胞中基因表達與調控、細胞凋亡等過程的機制奠定了基礎。

[參考文獻]

[1]Desmouliere A， Darby IA， Gabbiani G. Normal and pathologic soft tissue remodeling： role of the myofibroblast， with special emphasis on liver and kidney fibrosis[J].Lab Invest，2003， 83（6）：1689-1707.

[2]Wu J， Ma B， Yi S， et al. Gene expression of early hypertrophic scar tissue screened by means of cDNA microarrays[J].J Trauma 2004， 57（6）：1276-1286.

[3]Chen W， Fu X， Sun X， et al. Analysis of differentially expressed genes in keloids and normal skin with cDNA microarray[J].J Surg Res 2003， 113（2）：208-216.

[4]Tong-chuan He，Shibin Zhou，Luis TD，et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J].Proc Nat1 Acad Sci USA，1998，95（6）：2509-2517.

[5]Melkonyan HS， Chang WC， Shapiro JP， et al. SARPs： a family of secreted apoptosis-related proteins[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997， 94pp：13636-13641.

[6]Mirotsou M， Zhang Z， Deb A， et al. Secreted frizzled related protein 2 （Sfrp2） is the key Akt-mesenchymal stem cell-released paracrine factor mediating myocardial survival and repair[J].Proc Natl Acad Sci USA ，2007， 104（5）：1643-1648.

[7]Nojima M， Suzuki H， Toyota M， et al. Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wnt signaling in gastric cancer[J].Oncogene，2007， 23（1）1-15.

[8]Lee JL， Chang CJ， Chueh LL， et al. Secreted frizzled related protein 2 （sFRP2） decreases susceptibility to UV-induced apoptosis in primary culture of canine mammary gland tumors by NF-kappaB activation or JNK suppression[J].Breast Cancer Res Treat，2006，100（1）：49-58.

[9]Lee HX， Ambrosio AL， Reversade B， et al. Embryonic dorsal-ventral signaling： secreted frizzled-related proteins as inhibitors of tolloid proteinases[J].Cell， 2006， 124（1）：147-159.

[10]Oshima T， Abe M， Asano J， et al. Myeloma cells suppress bone formation by secreting a soluble Wnt inhibitor， sFRP-2[J].Blood，2005， 106（12）：3160-3165.

[11]Muller HM， Oberwalder M， Fiegl H， et al. Methylation changes in faecal DNA： a marker for colorectal cancer screening[J]？ Lancet，2004， 363（5）：1283-1285.

[12]Roth W， Wild-Bode C， Platten M， et al. Secreted Frizzled-related proteins inhibit motility and promote growth of human malignant glioma cells[J].Oncogene，2000， 19（11）：4210-4220.

篇6

【摘要】

目的 構建含有膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)和加強型綠色熒光蛋白基因（EGFP）的逆轉錄病毒載體，將其導入包裝細胞PT67，檢測基因在細胞中的表達。方法 PCR法擴增GDNF基因及IRES2EGFP基因，測序驗證正確后與逆轉錄病毒載體pLXSN連接，構建重組逆轉錄病毒質粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。EcoR I酶切鑒定重組質粒。脂質體Lipofectamine 2000介導下轉染包裝細胞PT67，G418篩選并檢測病毒滴度。流式細胞儀和熒光顯微鏡分別檢測轉染效率和基因表達。結果 PCR擴增得到大小約558 bp和1 308 bp的特異性條帶，測序證實，獲得正確的人GDNF序列和EGFP序列。經EcoR I酶切鑒定，成功構建重組質粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。熒光顯微鏡檢測顯示GDNF基因獲得良好表達，流式細胞儀檢測轉染效率為24.4%。結論 正確克隆了人GDNF基因全序列并構建重組逆轉錄病毒pLXSNIRES2EGFPGDNF質粒?；蜣D染包裝細胞PT67獲良好表達。

【關鍵詞】 膠質細胞源性神經營養因子；逆轉錄病毒；脂質體；基因轉染

帕金森病(PD)臨床療效不佳，有學者將骨髓間充質干細胞（MSCs）定向移植入PD鼠模型的黑質紋狀體區，發現其能夠存活并分化為酪氨酸羥化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）表型神經元，從而改善PD大鼠癥狀，但不能阻止神經細胞的進一步死亡。于是有學者探索將神經營養因子體外轉染靶細胞，通過立體定向的方式移植入鼠的黑質紋狀體區，發現可促進PD大鼠的黑質紋狀體神經通路的結構和功能的恢復。本課題擬在以上研究的基礎上，應用人膠質細胞源性神經營養因子（glial cell linederived neurotrophic factor， GDNF）重組逆轉錄病毒體外轉染MSCs，立體定向移植入PD大鼠模型的黑質紋狀體區，通過對相應指標的測定，分析逆轉錄病毒介導GDNF基因轉染MSCs移植治療PD的可行性及其療效。本文為實驗的第一部分，旨在構建一個攜帶有治療基因GDNF同時攜帶報告基因加強型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein，EGFP)的逆轉錄病毒重組質粒，轉染包裝細胞PT67后，檢測基因的表達及轉染效率，為下一步轉染MSCs、進一步深入探討GDNF基因在神經系統疾病基因治療中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

人神經膠質細胞瘤標本，由山東省立醫院神經外科提供。逆轉錄病毒載體pLXSN質粒、攜帶pIRES2EGFP基因片段的質粒、PT67、NIH3T3細胞由山東省立醫院中心實驗室保存并提供。PCR試劑盒、pMD18T載體試劑盒、限制性內切酶Xho I、BamH I、Bgl Ⅱ、EcoR I、T4連接酶均購自大連TAKARA公司；中量質粒抽提試劑盒購自Omega公司；GDNF基因片段及pIRES2EGFP基因片段上、下游引物，由上海博亞生物技術有限公司合成；Lipofectamine 2000、OptiMEM無血清培養基購自Invitrogen公司；G418、DMEM培養液購自Gibco公司；Polybrene購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 GDNF基因、IRES2EGFP基因的克隆及測序

參照《分子克隆實驗指南》，從人神經膠質細胞瘤組織中提取總RNA后逆轉錄生成cDNA。以cDNA為模板，PCR擴增GDNF基因片段。同時，以含有IrES2序列及EGFP基因片段的質粒為模板，PCR擴增EGFP基因片段。擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，10個循環；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，20個循環；72℃ 7 min充分延伸；4℃，保持。GDNF基因引物序列（上游5′TACTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG3′，下游5′CGAGATCTTCAGATACATCCACACCTTTTAGC3′）；IRES2EGFP基因引物序列（上游5′TTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′，下游5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′）。引物設計時分別引入Xho I、BamH I、Bg Ⅲ酶切位點。擴增產物純化回收后克隆入T載體，篩選陽性克隆，使用測序儀進行測序。

1.2.2 pLXSNIRES2EGFPGDNF重組體的構建及鑒定

Xho I和BamH I分別雙酶切pLXSN質粒及pIRES2EGFP，T4連接酶連接酶切后產物，得到pLXSNIRES2EGFP；Xho I和Bgl Ⅱ分別雙酶切pLXSNIRES2EGFP及PMD18TGDNF，T4連接酶連接酶切后產物，構建pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質粒，EcoR I酶切鑒定。

1.2.3 病毒轉染包裝細胞PT67

酶切鑒定初步證實質粒構建成功后，按照質粒中量抽提試劑盒說明，中量抽提pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質粒，測量濃度及純度。復蘇并培養包裝細胞PT67，培養液為含10%胎牛血清的DMEM液。轉染前1 d，胰酶消化PT67細胞并計數接種于6孔板內，使用含血清不含抗生素的培養基培養，控制其在轉染當日密度達到90%左右。第2天，以OptiMEM I培養基各250 μl分別稀釋5 μg pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質粒和15 μl Lipofectamine 2000，將稀釋的DNA和稀釋的Lipofectamine 2000混合，室溫保持20 min后，轉染1孔，其他孔按此重復。37℃，5% CO2孵箱內培養24 h后，將細胞消化傳代，新鮮培養基繼續培養。2 d后加入G418篩選。按照預實驗結果，先從200 μg/ml G418濃度開始，根據細胞生長情況酌情增量，至500 μg/ml為止。當絕大多數細胞死亡，只余小部分有絲分裂相細胞時，將G418濃度下調至300 μg/ml繼續培養。當細胞達到50%左右匯合時，胰酶消化，按照1∶10比例傳代，300 μg/ml G418繼續培養。待出現單細胞克隆后，用克隆環挑出10個大而邊界清楚的克隆，收集病毒，-70℃凍存。

1.2.4 滴定病毒滴度

復蘇NIH3T3細胞并以含10%胎牛血清的DMEM液培養，用于測病毒滴度。測滴度前1 d，將NIH3T3細胞胰酶消化后重新鋪于6孔板，細胞密度保持在0.5×105～1×105/孔，每孔加入2 ml完全培養液。測滴度當日，將20 ml完全培養液與60 μl Polybrene（4 mg/ml)混合，簡稱溶液1。將方法1.2.3中得到的病毒儲存液經0.45 μm醋酸纖維膜濾器過濾。備6只1.5 ml EP管，做標記后分別加入1.35 ml溶液1，將過濾好的病毒儲存液150 μl加入第1管后混勻稀釋。將稀釋后的病毒液吸取150 μl加入第2管混合稀釋，依此類推加至第6管，病毒最終被稀釋106倍，第6管溶液簡稱溶液2。每孔加1 ml溶液2，最終孔內的Polybrene的終濃度為4 μg/ml。感染細胞24 h后，更換含300 μg/ml G418的完全培養基培養。1 w后，肉眼計數形成的抗性細胞克隆，計算滴度。病毒滴度=細胞克隆數×病毒液稀釋倍數（106）。將高滴度病毒液-70℃凍存備用。

1.2.5 熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測

將方法1.2.3中篩選出的細胞培養達到50%～60%融合后，胰酶消化接種于6孔板內，300 μg/ml G418繼續培養。6孔板內挑選2孔預先放入無菌載玻片。待細胞貼壁后，培養2～3 d，4%多聚甲醛固定。以未經轉染的PT67細胞為背景熒光標準，488 nm波長光線激發下熒光顯微鏡觀測并照相。其余孔內，胰酶消化細胞成單細胞懸液，PBS洗滌2遍。取109/ml的單細胞懸液1 ml以預冷的無水乙醇固定，以同時傳代未轉染細胞作為對照，行流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.1 pLXSN質粒圖譜 質粒大小約為5.9 kb，見圖1。

2.2 目的基因PCR擴增、測序

擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，結果示：擴增出一條約500～600 bp的GDNF基因條帶，和一條約1 200～1 500 bp的EGFP基因條帶，見圖2。

應用美國ABI全自動序列儀檢測GDNF（558 bp）和pIRES2EGFP DNA（1 308 bp）序列，結果通過DNASIS軟件與GenBank中的序列進行同源性序列分析，pIRES2EGFP的片段與GenBank中序列完全一致。GDNF片段在前蛋白的片段上出現了一個堿基突變，經查證屬同義突變，不會影響GDNF蛋白質的表達，與完整序列（636 bp）比對，有78 bp的堿基缺失(圖3中黑框部分)，見圖3。

2.3 pLXSNIRES2EGFPGDNF雙表達載體的構建

經酶切、連接等步驟，構建pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質粒。利用EcoR I進行酶切鑒定。酶切后電泳后可見2條帶，一條約250 bp，另一條約6 000～8 000 bp，與預期一致，可初步判斷重組質粒pLXSNIRES2EGFPGDNF已經構建成功，見圖4。

2.4 包裝細胞病毒滴度測定

挑選的10個陽性細胞克隆，其病毒滴度最高為2.5×106 cfu/ml，將其細胞擴增并凍存，以備后續實驗。

2.5 熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測

在熒光顯微鏡下可觀察到，電轉染PT67細胞后，大量的PT67細胞胞質內含EGFP的目的基因片段在藍色熒光激發下(波長408 nm)，發出明亮的綠色熒光(波長508 nm)，見圖5。經流式細胞儀檢測，以未經轉染的PT67細胞做空白對照，轉染效率約為24.4%，見圖6。

3 討 論

目前已證實GDNF對神經具有營養、保護作用，同時還可抑制由毒素、環境等原因誘發的神經元變性、壞死〔1〕。目前認為PD的主要病理特征為中腦黑質中多巴胺能（DA）神經元進行性變性減少，致紋狀體中DA含量下降。Smith等〔2〕發現GDNF可通過抑制活性氧損傷和細胞毒物質的生成來保護DA能神經元，Zeng等〔3〕研究發現：GDNF可以逆轉細胞凋亡所致的DA能神經元壞死，提高TH陽性神經元的存活率。于是，如何應用外源性GDNF治療PD成為人們研究的又一熱點。本研究從人腦膠質細胞瘤中提取GDNF基因片段，期望探索GDNF基因轉移高效率表達的方法，為今后進一步應用于臨床研究奠定基礎。

本研究最終得到GDNF基因片段為558 bp，測序后結果與GenBank中完整序列（636 bp）比對，有78 bp的堿基缺失。Grimm等〔4〕檢查了大鼠B49細胞系和人胚腎HEK293細胞系中GDNF的表達狀況，發現這些細胞均表達558 bp和636 bp片段。也有學者證實，兩種GDNF前體在胚胎鼠的表達部位一致，生物學活性相同。本實驗得到的GDNF基因，通過DNASIS軟件與GenBank中的序列進行同源性序列分析，發現在前蛋白的片段上出現了一個堿基突變，但屬于同義突變，故不影響GDNF蛋白質的表達。自此，人GDNF基因成功被克隆。

由于GDNF不能直接通過血腦屏障，故如何將其移植入生物體內且發揮作用是個關鍵的問題。有學者嘗試過不同的方法，如：GDNF直接向紋狀體、黑質或腦室內注射；將胚胎中腦組織用GDNF處理后植入腦內等。本研究采用將GDNF基因克隆入逆轉錄病毒載體的方法，同時克隆入載體的還有帶IRES序列的報告基因EGFP。這樣做的優勢在于：①逆轉錄病毒載體pLXSN，含有指導特異性整合的信號，插入的外源基因整合后仍是完整的，能保證基因插入質粒后正確表達，保留基因的生物特性〔5〕。②逆轉錄病毒載體轉染細胞后，能夠在逆轉錄酶的作用下形成與之互補的前病毒DNA，在int基因的作用下整合至靶細胞的基因組中，在子代細胞中形成穩定的基因表達。穩定的表達有利于持續觀察GDNF基因對神經元的修復、保護作用。③構建IRES序列連接的GDNF和EGFP基因的雙表達載體，同時轉錄，但翻譯各自獨立，由于兩者共用一個啟動子，因此所有表達EGFP的轉染細胞必然也同時表達目的基因GDNF，在熒光顯微鏡下觀測到亮綠色的熒光蛋白，即等于觀測到了GDNF的表達，為觀察提供方便。

本研究成功構建了pLXSNIRES2EGFPGDNF重組質粒，脂質體Lipofectamine 2000介導下轉染包裝細胞PT67，G418篩選出高滴度細胞克隆，為下一步轉染骨髓間充質干細胞奠定了基礎，在探索PD動物模型的基因治療方面又前進一步。

參考文獻

1 Bennett DL，Boucher TJ，Armanini MP，et al.The glial cell linederived neurotrophic factor family receptor components are differentially regulated within sensory neurons after nerve injury〔J〕.J Neurosci，2000；20(1):42737.

2 Smith MP，Cass WA.GDNF reduces oxidative stress in a 6hydroxydopamine model of Parkinson′s disease〔J〕.Neurosci Lett，2007；412(3):25963.

3 Zeng X，Chen J.An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection〔J〕.Neuropsychopharmacology，2006；31(12):270815.

篇7

【摘要】 目的: 觀察攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)體外轉染高轉移卵巢癌HO8910PM細胞后的表達，并研究其對卵巢癌細胞抑制增殖、誘導凋亡和抑制遷移的作用. 方法: 利用AdEasy腺病毒載體系統構建Adpten，體外轉染高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，熒光顯微鏡檢測Adpten的轉染效率. Western印跡檢測pten在HO8910PM細胞中的表達；MTT實驗觀察pten對細胞生長的影響；HE染色法觀察外源性pten基因表達對細胞形態學的影響；細胞劃痕實驗觀察pten對細胞遷移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色檢測pten基因對HO8910PM細胞凋亡的誘導作用. 結果: 外源性野生型pten基因經腺病毒介導成功轉入HO8910PM細胞，Western印跡檢測出有PTEN蛋白的表達，當感染復數MOI為100時，體外轉染效率高達90%以上. pten顯著抑制HO8910PM細胞增殖、誘導其凋亡并能抑制其遷移. 結論: 重組腺病毒是高效的基因轉移系統，能將pten目的基因高效地轉移到高轉移卵巢癌HO8910PM細胞中，對細胞產生強有力的生長抑制及凋亡誘導作用，并能抑制其遷移.

【關鍵詞】 卵巢腫瘤；基因治療；pten基因；腺病毒；細胞凋亡；遷移抑制

0引言

抑癌基因pten，即第10號染色體缺失的與張力蛋白同源的基因，是繼p53后又一個與多種腫瘤發生發展密切相關的抑癌基因，其編碼具有雙重特異磷酸酶活性的蛋白，可以反向調控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）/AKt信號傳導途徑，從而抑制細胞生長增殖. 其突變和缺失多發于乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌等［1-3］. 在某些pten基因突變或缺失的癌細胞中過表達PTEN蛋白能抑制細胞增殖和腫瘤的形成，使其細胞周期停滯在G1期并發生細胞凋亡［4-5］，而且在某些沒有pten基因突變的癌細胞中，使pten基因過表達也能抑制這些癌細胞生長，誘導其發生凋亡［6］；另外，pten基因還能抑制癌細胞的侵潤轉移，降低其遷移能力. 這就提示pten基因用于癌癥基因治療有著重要意義. 而基因治療載體的選擇最為重要，當今運用最多最廣泛的就是腺病毒(adenovirus， Ad)載體，其具有在哺乳動物及其他多種生物細胞上進行基因轉移和蛋白表達的高效性和不整合宿主細胞的性質，是一種比較安全，轉染效率又高的載體［7］. 本研究采用攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)，將pten基因導入人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，觀察其在卵巢癌細胞中的表達，研究其對卵巢癌細胞生長抑制、遷移抑制、誘導凋亡的作用，對卵巢癌的基因治療進行初步的探索并提供有意義的參考數據.

1材料和方法

1.1材料人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞和人胚腎細胞293T購自中國科學院上海細胞生物學研究所；野生型pten表達質粒（wtpten）為美國加州大學Frank Furnari教授惠贈；AdEasy腺病 毒表達載體系統由美國休斯霍華德醫學院及John Hopkins腫瘤中心Bert Vogelstein教授惠贈，其中穿梭載體pAdTrackCMV帶有綠色熒光蛋白報告基因(gfp)，在表達外源基因同時也能單獨表達gfp，用于重組腺病毒的快速篩選以及轉染率的測定；抗PTEN抗體為美國Santa Cruz公司產品; HRP標記羊抗鼠IgG抗體和馬抗山羊IgG均購自北京生物技術有限公司；MTT為美國Amerson公司產品. Hoechst33258 細胞凋亡染色試劑盒購于武漢碧云天生物技術公司.

1.2方法

1.2.1重組腺病毒載體的構建及細胞培養應用細菌內同源重組的方法，構建攜帶野生型pten基因的重組腺病毒Adpten及陰性對照Adgfp ［8］. HO8910PM細胞培養于含100 mL/L小牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養液中，置50 mL/L CO2， 37℃孵箱培養.

1.2.2Adpten轉染效率的測定取指數生長期的高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，以5×104/孔接種于6孔培養板中，24 h后吸棄培養基，換無血清RPMI1640培養基，用25，50，100感染復數(multiplicity of infection， MOI=病毒顆粒數/轉染的細胞數)的腺病毒感染， 培養6 h后，換完全培養液繼續培養. 24 h后在熒光顯微鏡下計數gfp陽性細胞百分率. 確定HO8910PM細胞轉染所需的MOI值，使得轉染效率＞90%.

1.2.3Western Blot檢測轉染細胞表達的PTEN蛋白取對數生長期細胞，按2×106接種于25 cm2培養瓶中. 常規條件培養24 h后，按MOI=100加入病毒，設Adpten 組和Adgfp 組，培養6 h后，換完全培養液繼續培養. 48 h后提取細胞總蛋白；以Bradford酶標儀蛋白定量法測定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12 g/L），于4℃冰箱中90 mA恒流電轉過夜，使目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，封閉液于4℃封閉過夜，將膜轉至新的封袋中，按0.1 mL/cm2加入適量的一抗稀釋液（小鼠抗人PTEN單抗按1∶300封閉液稀釋，山羊抗人Actin多抗按1∶500封閉液稀釋），封口后，室溫下平緩搖動反應4 h. TBS洗滌后加入二抗稀釋液（PTEN， Actin的二抗均按1∶2000封閉液稀釋），同條件反應1 h. 大量TBS洗滌去除未結合的二抗. ECL（化學發光）處理，暗箱中以X光膠片曝光，顯影、定影.

1.2.4MTT法測定HO8910PM細胞增殖抑制率取對數生長期細胞，以5×103/孔接種于96孔板培養，常規條件培養24 h后，吸棄培養基，換無血清RPMI1640培養基，按MOI=100加入病毒，設Adpten 組，Adgfp組，PBS空白對照組和本底對照組(只加完全培養液，不種細胞)，培養6 h后，換完全培養液繼續培養. 每個時間點設6個平行孔，在指定時間(24，48，72 h)加入MTT (5 mg/mL) 20 μL/孔，孵育4 h后，小心吸棄孔內上清液，加入DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，490 nm作為測定波長，570 nm作為參比波長，在酶標儀上測定各孔的光吸收值. 細胞增殖抑制率=［1-實驗組（A570 nm-A490 nm）/本底對照組（A570 nm-A490 nm）］×100%.

1.2.5HE染色觀察細胞形態取指數生長期高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，以5×104接種于35 mm培養皿中，24 h貼壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并設加PBS為空白對照；病毒感染方法同1.2.4，24 h后棄培養基，生理鹽水漂洗，950 mL/L乙醇固定15 min，蘇木素染色3～10 min，自來水沖洗5～8 min， 5～10 mL/L鹽酸酒精分化數分鐘，自來水沖洗5～8 min，然后加溫熱水5～10 min顯藍，自來水充分沖洗，伊紅復染2 min，再次用自來水充分沖洗，普通光學顯微鏡下觀察.

1.2.6細胞劃痕試驗取指數生長期高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，按2×104/孔接種于6孔培養板，用RPMI 1640完全培養基孵育24 h后，用移液槍槍尖在細胞培養基表面劃一條痕跡（長約2 cm），用PBS洗3次后加入無血清RPMI1640培養基，病毒感染方法同1.2.4，設加PBS為空白對照，繼續培養48 h后鏡下觀察.

1.2.7Hoechst33258凋亡染色取對數生長期HO8910PM細胞2×104/孔接種于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，設加PBS為空白對照，48 h后用固定液固定10 min，PBS洗2次，Hoechst33258 染色5 min，熒光顯微鏡下觀察.

統計學處理: 本實驗采用SAS 8.0統計軟件進行統計分析，用單因素方差分析(ANOVA)， P

2結果

2.1Adpten對HO8910PM細胞體外轉染效率的測定Adpten在體外感染人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞具有較高的轉染效率. 在MOI=100時可以達到90%以上（圖1）.

A: 熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達; B: 同一視野下光學顯微鏡觀察.

圖1Adpten(MOI=100)感染HO8910PM細胞的效果×200

2.2Western檢測轉染后PTEN蛋白的表達Western印跡分析結果表明，Adgfp感染后的HO8910PM細胞未見特異性條帶；而Adpten感染后的HO8910PM細胞，則見到特異性條帶，而且Pten蛋白表達量也較高（圖2）.

圖2Western Blot檢測PTEN蛋白的表達

2.3Adpten對HO8910PM細胞增殖的影響以MOI=100病毒感染后24，48，72 h，通過吸光度值計算，Adpten的抑制率分別為(89.76±1.49)%， (91.11±1.38)%， (92.38±1.78)%， 而Adgfp感染組分別為(8.14±2.16)%， (7.82±2.32)%， (6.16±2.86)%，二者比較，差異有統計學意義（P

2.4Adpten對HO8910PM細胞形態的影響重組腺病毒Adpten感染及非病毒感染(對照)的3組HO8910PM細胞， 經HE染色光鏡下觀察可見，正常對照及Adgfp處理組細胞成片生長，細胞間隙緊密，胞質舒展，核分裂現象明顯. Adpten處理組細胞則細胞間隙變大，胞質紅，核固縮，易見凋亡小體(圖3).

A: PBS對照組; B: Adgfp處理組; C: Adpten處理組.

圖3Adpten感染對HO8910PM細胞形態的影響HE ×400

2.5Adpten對HO8910PM細胞遷移能力的影響重組腺病毒Adpten感染后的指數生長期高轉移卵巢癌HO8910PM細胞與對照組(PBS空白組和Adgfp組)比較，Adpten能有效地抑制HO8910PM細胞的遷移（圖4）.

2.6Adpten誘導HO8910PM細胞凋亡Hoechst 33258熒光染色結果顯示， 重組腺病毒Adpten感染HO8910PM細胞48 h后，Adpten感染組出現典型的凋亡形態學改變，可見胞體縮小、胞漿濃縮、核染色質聚集、核固縮，還可見膜包裹的凋亡小體. 而PBS對照組和Adgfp組的細胞均未發生形態學的改變（圖5）.

3討論

隨著分子生物學及分子遺傳學的發展，癌基因的激活和抑癌基因的突變失活，是目前較為公認的腫瘤發生發展的重要原因之一. 本文研究的抑癌基因pten，其突變和缺失常見于多種惡性腫瘤，與腫瘤的發生發展有著密切關系. 目前普遍使用的腫瘤的基因治療方法是導入外源性野生型抑癌基因補充或替代突變的抑癌基因.我們選用重組腺病毒載體導入抑A0，A1: PBS對照組; B0，B1: Adgfp處理組; C0，C1: Adpten處理組; A0， B0， C0: 0 h; A1， B1， C1: 感染后48 h.

癌基因pten，其極少發生插入突變，載體操作方便、宿主廣泛、容易繁殖，并具有攜帶外源基因容量大，可表達接近翻譯后成熟水平蛋白質等特點，已廣泛用于多種疾病的體內基因治療. 國外報道的AdEasy系統［9］除具有腺病毒載體的一般優點外，還具備以下優點：①在細菌體內完成同源重組，重組效率高，周期短；②利用含不同抗生素篩選重組子，簡化了篩選工作；③經重組的腺病毒帶有gfp基因，可直接通過熒光顯微鏡監測病毒的生成，病毒滴度的測定和對宿主細胞的轉導效率的檢測都較傳統方法簡便易行. 我們利用AdEasy腺病毒載體系統構建了攜帶野生型pten基因的重組腺病毒，導入人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，證實pten 基因在HO8910PM細胞中能高效地表達. 通過MTT比色檢測，發現Adpten 對HO8910PM細胞具有顯著的增殖抑制作用，能有效地抑制該癌細胞生長. 細胞劃痕實驗證明Adpten能有效地抑制該癌細胞的遷移. Hoechst 33258 凋亡染色結果也表明pten具有誘導該癌細胞凋亡的作用.

本研究結果表明，攜帶野生型pten基因的重組腺病毒是一種高效的基因轉移系統，能將pten目的基因轉移到受體細胞中，對人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞產生強有力的生長抑制及凋亡誘導效應，并能抑制該癌細胞遷移，為進一步的基因治療卵巢癌的研究奠定了基礎.

【參考文獻】

［1］ 馬佳佳， 陳必良， 馬向東，等. 抑癌基因PTEN在子宮內膜癌組織中的表達 ［J］. 第四軍醫大學學報， 2004， 11:1015-1018.

［2］ Haiman CA， Stram DO， Cheng I， et al. Common genetic variation at PTEN and risk of sporadic breast and prostate Cancer ［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2006， 15:1021-1025.

［3］ Tsuruta H， Kishimoto H， Sasaki T， et al. Hyperplasia and carcinomas in Ptendeficient mice and reduced PTEN protein in human bladder cancer patients ［J］.Cancer Res， 2006，66:8389-8396.

［4］ Furnari FB， Huang HJ， Cavenee WK. The phosphoinositol phosphatase activity of PTEN mediates a serumsensitive G1 growth arrest in glioma cells ［J］. Cancer Res， 1998， 58(22): 5002-5008.

［5］ Zhu XY， Kwon CH， Schlosshauer PW， et al. PTEN Induces G1 cell cycle arrest and decreases cyclin D3 levels in endometrial carcinoma cells ［J］. Cancer Res， 2001， 61: 4569-4575.

［6］Saito Y， Swanson X， Mhashilkar AM， et al. Adenovirusmediated transfer of the PTEN gene inhibits human colorectal cancer growth in vitro and in vivo［J］. Gene Ther， 2003， 10(23):1961-1969.

［7］ Majhen D， AmbriovicRistov A. Adenoviral vectors-How to use them in cancer gene therapy［J］? Virus Res， 2006， 119(2):121-133.

篇8

【摘要】 ［目的］應用重組骨形成蛋白4/7融合基因腺相關病毒載體（AAV BMP4/7）轉染兔骨髓基質干細胞（BMSCs)，觀察其對BMSCs生物學行為的影響。［方法］（1）采用RTPCR一步法和基因重組法，從胎盤組織中克隆BMP4和BMP7成熟肽cDNA，獲取BMP4/7融合基因，克隆到質粒pGEM質粒中；（2）從pGEMBMP4/7質粒中切取BMP4/7融合基因克隆到穿梭質粒，在大腸桿菌內重組，在293細胞中構建AAVBMP4/7重組腺相關病毒載體；（3）不同MOI值的AAVBMP4/7轉染兔BMSCs，觀察細胞形態學變化，MTT法描記細胞生物曲線，觀察對細胞增殖的影響，以AAVEDFP做對照；（4）AAVBMP4/7轉染兔BMSCs細胞7、14 d后，行ALP及OC含量測定，觀察成骨活性，以AAVEDFP做對照。［結果］（1）成功構建高滴度的攜帶BMP4/7融合基因的重組腺相關病毒AAVBMP4/7；（2）AAVBMP4/7轉染BMSCs細胞后，細胞增殖活性良好，轉染效率為72%，細胞形態呈典型的成骨改變，1×105 vg/cell的MOI值對細胞形態影響較小，而轉染效率強于5×104vg/cell(59.38%)。（3）AAVBMP4/7轉染細胞后，ALP、OC含量均明顯增高，并與轉染后誘導培養的時間呈正相關，與對照組比較差異統計學意義（tALP=896.88 P

【關鍵詞】 骨組織工程； 骨形成蛋白； 融合基因； 腺相關病毒； 骨髓基質干細胞

Abstract：［Objective］To determine the biological effects of transfection of adenoassociated rirus(AAV) BMP4/7 on rabbit bone marrow stromal cells (BMSCs).［Method］The mature peptide of BMP4 and BMP7 were gained by OneStep RTPCR from the human placenta and the BMP4/7 fusion gene was gained through gene recombinant techniques and then transferred to pGEM plasmid. The BMP4/7 fusion genen was cut down from the pGEMBMP4/7 and the recombination was successfully completed in colibacillus， and recombinant adenoassosiated was produced in 293 cells. Rabbit BMSCs were transfected with the recombinant adenoassosiated virus vectors carrying BMP4/7 fusion gene with differen multiplicitv of infection(MOI) values. Cell growth curves were drawn to evaluate the biologic effect of AAVBMP4/7 on cytoactivity. The transfection efficiency was measured using MTT method. The ossification of cells was evaluated by investigating the shape change of the cell ability of ALP and OC at 7，14 days after transfection. Cells were then transfected with AAVBMP4/7 and AAVEGFP，respectively.［Result］1.We successfully constructed the recombinant adenoassosiated virus with BMP4/7 fusion gene.2.The ttransfection efficiency of AAVBMP4/7 was roughly 72% without siginifficant biologic effect on cytoactivity.The ossification of cells was significant after transfection with AAVBMP4/7. The 1×105 vg/cell MOI value of transfection efficiency was stroger than 5～104 vg/cell MOI value (59.3，8%). 3. The concentrations of ALP and OC in AAVBMP4/7 transfection groups were significantbly higher than in AAVEGFP groups (tALP=896.88 P

Key words：bone tissue engineering; bone morphogenetic protein;fusion gene; adenoassociated virus; bone marrow stromal cells

骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)具有誘導骨髓基質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)向成骨或成軟骨細胞分化、促進新骨形成的作用。BMPs家族已發現20余種成員，以BMP2、BMP4、BMP7的活性最強，它們可促進軟骨和新生骨形成。在促進骨及脊柱融合的實驗中已取得了成功的經驗［1］，其中BMP4，7均表現出不同的促進骨和脊柱融合的作用［2，3］。人體內BMPs多為同源二聚體，也存在少量的異源二聚體，如BMP2／7， BMP4／7等。文獻報道BMPs異源二聚體比同源二聚體的活性高20倍［4，5］。

腺相關病毒(adenoassiciaed virus，AAV)具有高效轉染靶細胞，長期穩定表達外源基因及安全性好等特點［6］。本實驗通過構建出融合基因BMP4／7的腺相關病毒載體(AAVBMP4／7)，觀察AAVBMP4／7轉染對兔BMSCs細胞生物學行為的影響，從而探討BMP4／7融合基因是否具有促進兔BMSCs細胞成骨活性，為骨組織工程提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

OneStep RTPCR試劑盒(CLOTECH公司)，DNAMarker(大連寶生生物工程公司)，pGEMT，DMEM(哈爾濱弘博生物公司)，限制性內切酶、Taq酶、T4連接酶(美國Promega公司)，PCR引物(上海Sigma生物制品公司)，堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(武漢博士德試劑公司)，骨鈣素(OC)檢測試劑盒(北京東亞免疫技術研究所)，重組增強型綠色熒光蛋白基因的腺相關病毒載體(adeno associated virusenhancement green fluore scent protein，AAVEGFP)(本元正陽公司提供)。

引物設計根據pGEMBMP4／7質粒為測序模板，用pGEM兩側特異的引物進行測序。

1.2 實驗方法

（1）兔BMSCs的體外培養：取健康新西蘭大白兔13只(由哈爾濱醫科大學附屬第一醫學院中心實驗室提供)，雄性，體重20 kg左右，2.5個月齡，按全骨髓法分離培養BMSCs，進行原代培養，待細胞匯合成單層后，消化傳代，取生長狀態良好的第3代細胞進行轉染實驗。

（2）pGEMBMP4的構建及鑒定：根據Gene Bank中和hBMP4的基因序列設計引物，上游引入EcoR I位點，下游引入BamH I位點，從胎盤組織中，RTPCR一步法擴增BMP4成熟肽序列，將BMP4基因克隆入pGEMT載體中，獲得重組質粒pGEMBMP4，然后用EcoR I和BamH I酶切pGEMBMP4質粒，回收酶切片斷。T4連接酶16℃過夜，轉化大腸桿菌，DH5α感受肽細胞，篩選陽性克隆，獲得pGMEBMP4，EcoR I、BamH I雙酶切，進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定和PCR引物擴增鑒定，以pGEM多克隆位點兩側特異引物進行測序，與Gene Bank中的BMP4成熟肽序列比對。

(3)pGEMBMP7的構建及鑒定：根據Gene Bank中hBMP7的基因序列設計引物，上游引入BamH I位點，下游引入PstI酶切位點，同實驗方法2步驟相同進行pGEMBMP7的重組質粒構建、轉化、篩選、及相關的酶切1．5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定和PCR引物擴增鑒定，并進行測序。

(4)AAVBMP4／7的構建及鑒定：采用DNA連接法將BMP4與BMP7基因片段連接，得到BMP4／7融合基因，經測序鑒定后，克隆到質粒pGEM。從pGEMBMP4／7質粒中切取BMP4／7融合基因克隆到穿梭質粒，在大腸桿菌內重組，在293細胞中構建AAVBMP4／7重組腺病毒。用EcoRI、BamH I Pst I酶切鑒定分析，將AAVBMP4／7質粒轉化DH5α細胞，大量提取腺相關病毒質粒，取脂質體Lipofectamine 2 000，按說明書轉染293細胞，G418篩選培養，獲取抗約克隆細胞株。

(5)AAVBMP4／7轉染對細胞形態學的影響：取生長狀態良好的第3代細胞，0.25％胰蛋白酶消化后，接種到24孔板，每孔均勻接種105個細胞，培養至70％融合，進行病毒感染，實驗按照AAV轉染細胞感染復數(Multiplicit of infection，MOI)值，按梯度選取4組不同MOI值，分別為5×104 vg／cell，1×105 vg／cell，5×105 vg／cell，1×106 vg／cell，每組6孔，按不同的MOI值，將各孔所需要的病毒量及血清DMEM，加入各孔，轉染2 h后，吸出病毒液，加入普通DMEM，常規培養，轉染后每24 h觀察細胞學改變。

(6)AAVBMP4／7轉染對細胞增殖活性的影響取MOI值為1×105 vg／cell的病毒轉染兔BMSCs (轉染組)2 h，取未轉染的BMSCs為對照組(非轉染組)。將細胞消化收集后，按1×104／孔接種于96孔板，于接種后12、24、48、72、96h，行MTT法測定細胞活性(λ630 nm)，并描記細胞生長曲線，比較兩組細胞增殖情況，觀察AAVBMP4／7轉染對細胞增殖活性的影響。

(7)AAV病毒的轉染效率：取生長狀態良好的第3代細胞，以1×105 vg／cell MOI值轉染2 h后，行流式細胞儀檢測綠色熒光表達，計算細胞轉染效率(實驗重復6次)，5×104 vg／cell MOI值為對照。

(8)AAVBMP4／7轉染對細胞成骨活性的影響: 以AAVBMP4／7轉染細胞2 h(實驗組)后，培養7、14 d，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態改變，觀察成骨分化，以AAVEGFP為對照病毒，進行相應實驗對照(對照組)(每組樣本量為6份)。于轉染后培養7、14 d，分別收集兩組細胞上清液，按ALP檢測試劑盒說明處理上清，比色儀測定(520 nm，1 cm光鏡比色)，計算上清液中ALP的含量；另于轉染后培養7、14 d，分別收集兩組細胞上清液，按照試劑盒說明檢測OC值， 收集細胞培養液100 μl，與125I標記的OC抗體100 μl混合后，4℃下放置24 h，加入分離劑混勻后，室溫放置， 4℃離心棄去上清檢測沉淀物放射劑量，計算各組平均OC含量。

1.3 統計學處理

應用SPSS 11.5統計學軟件包進行分析，數據用±s表示，組間比較采用兩組獨立樣本的t檢驗，P

2 結 果

2.1 pGEMBMP4 及pGEMBMP7的構建與鑒定

從陽性克隆中提取pGEMBMP4質粒及pGEMBMP7質粒，經雙酶切后，進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定 和PCR引物擴增鑒定，分別可見374、451 bp亮帶(圖1，2)測序結果與Gene Bank中報道的BMP4基因和BMP7基因成熟肽序列完全符合。

2.2 AAVBMP4／7的構建與鑒定

成功獲得了AAVBMP4／7，經雙酶切鑒定可見826 bp亮帶(圖3)，基因測序結果與Gene Bank中BMP4、 BMP7成熟肽基因序列一致，并成功在二者之間加入6個連接肽編碼基因。經EcoR I、BamH I Pst I鑒定和相應的PCR引物擴增，在瓊脂糖凝膠電泳上，分別有374、451 bp的亮帶，(圖4)，說明成功獲得了BMP4、BMP7的融合基因，重組產生了攜帶融合基因BMP4／7的腺相關病毒質粒。

圖1 BMP4重組質粒雙酶切鑒定 圖2 PCR產物及BMP7重組質粒酶切鑒定 圖3 融合基因克隆載體鑒定 M：DNAMarker 1.PGEM／BMP4，PGEM／BMP7，融合基因 2.PCR片斷 圖4 PBV222／BMP4／7表達質粒酶切鑒定 1．丸DNA分子量標準 2．Eco RI與Pst I酶切質粒AAVBMP4／7 3．BamH I、Pst I切質粒AVVBMP4／7 4．Eco RI與BamHI酶切質粒AAVBMP4／7 5．BMP7PCR片斷 6．BMP4PCR片斷 M：DNAMarker

2.3 AAVBMP4／7轉染對細胞學形態學的影響

以不同的MOI值分別轉染兔BMSCs細胞，轉染后24 h，各組均可觀察到細胞形態變化，長梭形細胞收縮， 邊緣不規則，72 h后上述改變明顯，部分細胞失去BMSCs典型細胞形態，排列不規則，呈多角形或無規矩形。上述改變隨著MOI值地增大而顯著，5×104 vg／cell基本無明顯變化，1×105 vg／cell變化較輕，1×106 vg／cell組影響最明顯，部分細胞崩解(圖5)。

圖5 AAVBMP4／7轉染72 h后細胞改變 5a 5×104 vg／cell細胞無明顯變化 5b 1×105 vg／cell變化明顯，長梭形細胞收縮，邊緣不規則 5c 5×105 vg／cell細胞進一步變化 5d 1×106 vg／cell部分細胞崩解(×200)2.4 AAVBMP4／7轉染對細胞增殖活性的影響

轉染組和非轉染組細胞于接種后12、24、48、72、96 h行MTT(λ=630 nm)法測定細胞活性，繪制生長曲線，結果表明兩組細胞倍數增殖期均出現于24 h，轉染組活性略低于未轉染組，但細胞增殖活躍，提示AAV對細胞生長曲線的影響小(圖6a、b)。

圖6 AAVBMP4／7轉染對細胞增殖活性的影響及轉染BMSCs細胞的轉染效率 6a MOI值1×105 vg／cell轉染 6b MOI值5×104 vg/cell轉染

2.5 AAVBMP4／7轉染效率檢測

取生長狀態良好的第3代細胞，以MOI值1×105 vg／cell轉染，流式細胞儀計算轉染效率，平均轉染效率為72％，MOI值時對細胞形態影響較小，而轉染效率強于5×104 vg／cell(59.38％)。 (x2=15.58，P

2.6 AAVBMP4／7對細胞成骨活性的影響

(1)倒置相差顯微鏡觀察：取AAVBMP4／7轉染組及AAVEGFP轉染組細胞，于轉染后7、14 d，倒置相差顯微鏡觀察，可見AVBMP4／7組于轉染后7 d，細胞形態發生明顯改變，起初細胞分布不均勻，出現局部密集，局部疏松，細胞呈多角形，高倍視野下可見胞漿內出現棕褐色顆粒，呈現明顯的成骨改變。14 d后可見細胞呈復層生長，胞漿內棕褐色顆粒更加明顯，可見細胞性鈣結節形成。AAVEGFP組僅見細胞收縮，邊緣不規則，無成骨細胞分化的特異改變(圖7)。

圖7 AAVBMP4／7轉染后倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學變化 7a 轉染7 d細胞分布不均勻；掃現局部密集，局部疏松，細胞呈多角形，町見胞漿內出現棕褐色顆粒(×200)

7b 轉染14 d細胞呈復層生長，胞漿內棕褐色顆粒更加明顯(×200) 7c AAVEGFP轉染組細胞無明顯變化(×200)

(2)ALP含量測定：取兩組細胞轉染后，7、14 d細胞上清液，計算ALP含量，AAVBMP4／7組分別為：67.2±8.4金氏單位，106.5±12.1金氏單位，AAVEGFP組分別為：10.1±2.7金氏單位，23.6±4.8金氏單位，兩組間差異有統計學意義(t=896.88，P

(3)OC含量測定：取兩組細胞轉染后7、14 d的細胞上清液，計算OC含量，AAVBMP4／7組分別為0.289±0.014 ng／ml，0.363±0.076 ng／ml；AAVEGFP組分別為0.011±0.007 ng／ml，0.017±0.010 ng／ml，兩組間差異有統計學意義(t=543.24， P

3 討 論

BMPs在細胞生長及骨形成過程中扮演關鍵角色，一直被廣大學者所關注［7，8］。在已發現的20余種BMPs中，BMP2、BMP4、BMP7的骨誘導能力最強，尤其是BMP4，新近的研究證實重組人BMP4促進脊柱融合的作用強于重組人BMP2，所需劑量僅為重組BMP2的1／10，且成骨量與劑量呈正相關［9，10］。由于BMPs在體內異源二聚體活性高于同源二聚體，故本實驗在目的基因的選擇上，選擇了BMP4與BMP7，將二者成熟肽序列成功克隆，利用DNA重組技術將BMP4、BMP7成熟肽基因融合，將融合基因成功克隆到穿梭質粒，在大腸桿菌內重組，獲取AAVBMP4／7質粒，在293細胞中成功穩定表達，為進一步研究異源二聚體BMP4／7對骨髓基質干細胞是否具有促進骨形成的作用打下實驗基礎。

AAV基因組可以整合入宿主細胞的基因組DNA中，保證了外源基因長期穩定表達。AAV末端重復序列中的轉錄元件方向不指向宿主DNA，插入突變的可能性很小。該病毒載體還可整合入分裂及非分裂期細胞，宿主范圍較寬［11，12］，因而在應用基因工程技術解決重組基因獲得持續表達的問題中，AAV可作為較合適的病毒載體，是目前基因治療基礎和臨床研究中最常用的載體之一。

目前文獻中報道AAV轉染細胞的MOI值差異很大，從1×104～1×106 vg／cell，均有報道［12，13］。本實驗通過采用不同梯度的MOI值轉染細胞發現，1×105 vg／cell對細胞形態影響較小，對細胞增殖活性無明顯影響，轉染效率為72％，明顯高于文獻中報道的脂質體感染率20%～30％。有學者報道5×104 vg／cell即可達到良好的轉染效率(55%～65％)，對細胞增殖活性影響也較?。?4］。本實驗結果認為，1×105 vg／cell MOI值轉染效率高于5×104 vg／cell MOI值，前者可作為常規選取的MOI值，既保證了一定的轉染病毒量，同時也保證了良好的轉染效率，經統計學分析，與文獻［14］報道的轉染效率間差異無統計學意義(P>0.05)。

BMSCs屬成骨干細胞，是具有向多種細胞系轉化潛能的基質干細胞，在一定外界環境及刺激因子的作用下實現跨系統分化，具有取材方便，易培養等特點，是組織工程良好的種子細胞來源［15］。本實驗應用AAVBMP4／7轉染BMSCs，相對于對照組，細胞形態由梭形細胞向多角形、立方形轉化，呈現明顯的成骨改變，隨著轉染時間的延長，上述特征性改變更加明顯，說明BMP4／7融合基因有成骨活性，與轉染時間成正相關。

研究表明，BMPs在骨發生的過程中主要起3個作用：促進細胞的趨化、有絲分裂和細胞分化。BMSCs分化為成熟的成骨細胞的復雜過程，是由于許多的系統因子、旁分泌因子和自分泌因子的相互作用完成的。在培養的BMSCs中加入BMPs進行誘導，成骨細胞的過程被誘發時，向成骨細胞分化的重要表現是細胞合成分泌表達成骨特征性蛋白和細胞外基質成分，如堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OC)是常用的檢測指標。細胞形態學觀察顯示，AAVBMP4／7轉染細胞誘導培養后的7、14 d細胞呈現成骨活性，且活性逐漸增強，而對照組AAVEGFP未見明顯的成骨活性。AAVBMP4／7轉然后誘導培養7、14 d，細胞上情液中ALP、OC的含量均明顯增加，并隨著誘導培養時間的延長而遞增， AAVEGFP對照組ALP、OC的含量無明顯增加，結果證實了通過AAV轉染的BMP4／7融合基因有誘導成骨活性，說明BMP4／7融合基因有生物學活性。

綜上，本實驗成功將BMP4、BMP7連接并構建了融合基因BMP4／7，通過AAVBMP4／7轉染BMPSs，初步探討了AAVBMP4／7對靶細胞生物學行為的影響，結果表明，BMP4／7有生物學活性，可通過AAV在靶細胞內高效表達，可加速BMSCs向骨表型轉化，促進骨形成。本實驗為骨組織工程的基因治療提供了一個新的思路，為嘗試用BMPs的融合基因有效提高成骨活性，提供實驗研究基礎。

參考文獻

［1］ Lieberman JR， Daluisk A， Einbom TA. The role of growth factors in the repair of bone: biology and clinical application［J］. J Bone Jiont Surg(Am)， 2002，14: 1032-1044.

［2］ Guo X， Lec KM， Law LP， et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-4 (rhBMP4) enhance posterior spinal fusion without decortication［J］. J Orthop Res， 2002， 20:740-746.

［3］ Hidaka C， Goodrich LR， Chen CT， et al. Acceleration of cartilage repair by genetically modified chondrocytes over expressing bone morphogenetic protein-7［J］. J Orthop Res， 2003，4: 573-583.

［4］ Lian Zhu， Wei Liu， Yilin Cao，et al. Tissue-engineered bone repair of goat-femur defects with osteogenically induced bone marrow stromal cells［J］.Tissue Eng， 2006，3: 423-433.

［5］ Nussenbaum B， Rutherford RB， Teknos TN， et al. Ex vivo gene therapy for skeletal regeneration in cranial defects compromised by postoperative radio-therapy［J］. Hum Gene Ther， 2003， 11: 1107-1115.

［6］ Shiau AL， Liu PS， Wu CL. Novel strategy for generation and titration of recombinant adeno-associated virus vectors［J］. Virol， 2005，1:193-201.

［7］ Chang CN， Chuang YR， et al. Cranial repair using BMP2 gene engineered bone marrow stromal cells［J］. J Surg Res， 2004， 119:85-91.

［8］ 董智勇，鄺冠明，鄭召民．基因治療促進脊柱融合的研究進展［J］. 中國矯形外科雜志，2005，13:1665-1667.

［9］ Gregory CA，Prockop DJ，Spees JL.Non-hematopoietic bone marrow stem cells；molecular control of expansion and differentiation［J］．Exp Cell Res，2005，306：330-335.

［10］李廣恒，侯倏魁.組織工程化骨組織誘導脊柱融合的實驗研究［J］．中國醫學科學院學報，2003，25：39-42.

［11］Chen Y，Luk KD，Cheung KM，et al．Gene therapy for new bone formation using adeno-associated viral bone morphpgenefic protein2 vectors［J］．Gene Ther，2003，10：1345-1353.

［12］Yang M，Ma QJ，Dang GT，et al．Adeno-associated virus-mediated bone morphogenetic protein-7 gene transfer induces C2C12 cell differentiation into osteoblast lineage cells［J］．Acta Pharmacol Sin，2005，26：963-968.

［13］彭建強，譚淑萍，董小巖，等．2型重組腺相關病毒體外轉錄培養細胞的研究［J］．病毒學報，2004，20：128-132.

篇9

【摘要】

本研究探討轉染survivin(SVV)基因的樹突狀細胞(DC)體外誘導特異性抗淋巴瘤的免疫效應。對人外周血DC進行誘導培養，以AdSVV轉染DC，用Western blot 鑒定Survivin的表達，用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應，用混合淋巴細胞反應（MLR）測定DC刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力，以ELISA法檢測上清中的細胞因子IL12含量。結果表明：在MLR中，刺激應答比（S/R）為1∶5、1∶10、1∶50和1∶100時，轉染AdSVV的DC有較強刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力；轉染AdSVV的DC組所誘發的CTL活性明顯高于對照DC組；轉染病毒后第2天，轉染AdSVV的DC組的IL12分泌水平高于對照DC組。結論：含存活蛋白基因的DC能夠在體外誘導特異性CTL效應，對CA46細胞有明顯的殺傷作用。

【關鍵詞】 survivin基因 樹突狀細胞 CA46細胞系 淋巴瘤 細胞毒性T細胞 免疫治療

Induction of Antilymphoma Cytotoxic T Cell Effect by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Vectors Carrying Survivin Gene

Abstract

This study was purposed to investigate the immunological effects of modified dendritic cells (DCs) in inducing cytotoxic T cells (CTLs) effect against lymphoma cells. The DCs were derived from human peripheral blood and transfected with recombined adenovirus vector carrying survivin gene， Western blot was used to detect the expression of survivin， the lactate dehydrogenase (LDH) release test was used to determine the cytotoxicity of CTLs， the mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to measure the ability to proleferate allolymphocyte by DCs， ELISA was used to assay IL12 level in supernatant.

The results showed that the expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. In MLR assay， DCs transfected with Adsurvivin could induce higher allogeneic lymphocytes reaction at the ratios of 1∶5，1∶10，1∶50 and 1∶100. DCs transfected with Adsurvivin had much higher activity of CTL to CA46 cells than control DCs. The levels of IL12 of supernatants containing DCs transfected with Adsurvivin were significantly higher than that in the control group. It is concluded that DCs transfected with Adsurvivin can induce CTL response in vitro against lymphoma cells.

Key words

survivin gene； dendritic cell； CA46 cell line; lymphoma; cytotoxic T cell; immunotherapy

樹突狀細胞(dendritic cell， DC)作為機體內功能最強的專職抗原呈遞細胞(APC)，在激活T細胞介導的免疫反應中起關鍵性作用，而survivin（存活蛋白，SVV）基因是腫瘤組織較為特異的基因，其編碼的蛋白survivin成為腫瘤較理想的靶抗原之一。因此，我們以重組腺病毒介導SVV基因修飾DC，觀察誘導產生的特異性抗淋巴瘤免疫效應，為以DC為基礎腫瘤免疫治療提供實驗依據。

材料和方法

材料

表達survivin蛋白的重組腺病毒（AdSVV）由本所構建、包裝［1］，滴度為： AdSVV 2.65×109pfu/ml；惡性淋巴瘤細胞株CA46為本室保存株。總蛋白裂解酶、蛋白酶抑制劑為美國Pierce公司產品；兔抗人survivin多克隆抗體為北京中杉生物技術公司產品；辣根標記山羊抗兔IgG、Westernblotting lunimol試劑（ECL）為Santa Cruz 公司產品。Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay試劑盒購自Promega公司。細胞因子IL12檢測試劑盒購自深圳晶美生物公司。

中國實驗血液學雜志 J Exp Hematol 2007; 15(3)轉染存活蛋白基因的樹突狀細胞抗淋巴瘤免疫的研究 DC的分離、培養和病毒感染

人外周血DC的分離和培養參照文獻［1］，收集培養第7天的DC，按MOI為100加入重組腺病毒，分為3組： 轉染AdSVV的DC組(AdSVV DC)、空載體轉染DC組（AdCMVDC）和未轉染DC組（NDC），并補充生長因子GMCSF、IL4（終濃度均為1 000 U/ml）。于37℃ 5% CO2，培養箱繼續培養48小時 (第9天)收集細胞。

Survivin蛋白表達的Western blot鑒定

收集第9天轉染AdSVV的DC組和空載體轉染DC組的DC，進行蛋白質抽提，SDSPAGE電泳，Western blot鑒定外源基因SVV蛋白的表達［1］。

同種混合淋巴細胞反應(MLR)測定

取培養第9天的AdSVVDC和NDC，分別加入絲裂霉素C，使其終濃度為50 μg/ml，在37℃，5% CO2的培養箱中培養45分鐘，作為刺激細胞。分別以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔將DC加入96孔板中，以T淋巴細胞供者自身的PBMC為對照組，每組設3個復孔。每孔均加入1×105的T淋巴細胞，刺激反應細胞之比（S/R）分別為1∶5，1∶10，1∶50，和1∶100，終體積200 μl，于37℃，5% CO2的培養箱中培養96小時。終止培養前4小時加入MTT 20 μl（5 mg/ml），培養終止后加DMSO 200 μl，充分混勻后靜置。選擇波長為570 nm處測OD570值。計算刺激指數（SI），結果以3孔的均值表示。

刺激指數（SI）=實驗孔OD均值/對照孔OD均值

CTL細胞體外殺傷活性的檢測

效應細胞的制備 取培養第9天的AdSVVDC組細胞和NDC組細胞各5×105，作為刺激細胞，加入到24孔培養板中，按5×106/孔加入經T細胞尼龍毛柱分離的T淋巴細胞（反應細胞）；同時以不與DC共孵育的自體淋巴細胞為對照，每組設3個復孔。加入IL2（500 U/ml），于37℃、5% CO2的培養箱培養。以后隔天半量換液，并補充IL2，繼續培養至第14天，作為效應細胞。

CTL的活性測定 以1×104∕孔加靶細胞（CA46）到96孔板中，再分別按5∶1、10∶1、20∶1（效應細胞∶靶細胞）加效應細胞到各孔中，每組設3個復孔。同時設4個對照:靶細胞最大釋放組、體積校正對照組、背景對照組和自然釋放組。按Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書檢測CTL反應，以對靶細胞的殺傷率表示CTL活性。

細胞殺傷率(%)= ［（實驗組釋放-效應細胞自發釋放-靶細胞自發釋放）/（靶細胞最大釋放-靶細胞自發釋放）］×100%

細胞因子的檢測

收集培養AdSVVDC以及NDC的當天、第2天、第4天上清，按試劑盒說明書方法進行IL12含量檢測。

統計學處理

本實驗數據應用SPSS 11.5 統計軟件進行方差分析。

轉貼于

結

果

存活蛋白的表達

經 Western blot檢測，轉染AdSVV的DC在16.5 kD處可見一陽性條帶（附圖），提示經基因轉導的DC可有效表達SVV蛋白，而未轉導基因的DC未檢出SVV蛋白表達。

Figure . Expression of SVV protein detected by Western blot. M: marker. Lane 1: AdCMVtransfected DC. Lane 2: AdSVVtransfected DC.

刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力

在不同的S/R（刺激細胞/應答細胞為1∶5、1∶10、1∶50、1∶100）比值時，轉染AdSVV的DC與未轉染的DC比較，具有更強刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力（P

CTL殺傷活性的檢測

在效靶比（E/T）為5∶1、10∶1和20∶1時，轉染AdSVV的DC（AdSVVDC）所誘發的CTL活性均值分別為23.48％、38.24％和46.76%，未轉染的DC（NDC組）誘發的CTL活性為7.32%、8.83%、14.72%，兩組間的CTL活性有顯著性差異（P

細胞因子的檢測

在轉染病毒后第2天、第4天，AdSVVDC組和NDC組的IL12分泌水平分別為50.7±3.2 pg/ml和56.4±2.7 pg/ml及36.5±1.8 pg/ml和42.3±2.6 pg/ml。AdSVVDC組的IL12分泌水平高于NDC（P

討

論

非霍奇金淋巴瘤（NHL）的發病率及死亡率均有上升趨勢，傳統治療難以徹底消滅腫瘤細胞，因此如何進一步提高療效并最終根治本病，已成為目前研究的熱點和難點。近年來，對樹突狀細胞在腫瘤抗原呈遞和腫瘤免疫中重要作用的揭示， 開拓了腫瘤免疫治療的又一新領域。腫瘤疫苗即腫瘤的特異性主動免疫治療，近年來取得了可喜進展，其中尤以DC疫苗的進展最為矚目［2，3］。

Survivin基因是一個抗凋亡基因，它在大多數腫瘤組織中表達，而在正常成人組織中不表達。業已證明，HL60、K562、CA46、U266等血液腫瘤細胞系均高表達survivin［4，5］。因此，應用靶向survivin的免疫治療有望成為一種重要的抗腫瘤療法。Schemitz 等［6］將自身DC與可溶性重組survivin共培育，誘導出survivin特異性的CD8+ CTL，首次證實了survivin可作為一種潛在應用價值的腫瘤疫苗抗原。

本實驗用重組腺病毒介導SVV基因轉染DC，通過檢測證實DC能夠表達SVV抗原蛋白，轉染后成熟DC仍具有較強刺激同種異體T淋巴細胞增殖和分泌細胞因子的能力。此研究結果說明Ad能夠高效介導目的基因感染DC，重組腺病毒不影響DC的成熟及其功能，是目前基因治療研究中較為理想的載體。

在研究靶細胞毒性實驗中，我們應用CytoTox 96 非放射試劑盒測量乳酸脫氫酶（LDH）在細胞裂解后的釋放量，結果表明轉染survivin基因的DC在體外能誘導特異性CTL，殺傷淋巴瘤細胞。這提示用重組腺病毒載體介導survivin基因的DC疫苗可能是抗淋巴瘤治療中有效的方法。

【參考文獻】

1朱雄鵬，陳志哲，林旭等. 存活蛋白重組腺病毒載體的構建及其在樹突狀細胞的表達. 中國實驗血液學雜志，2006； 14：791-794

2Steinman RM， Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I Morphology， quantitation， tissue distribution. J Exp Med， 1973;137: 1142-1162

3Banchereau J， Briere F， Caux C， et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol.2000;18:767-811

4Zeis M， Siegel S， Wagner A， et al. Generation of cytotoxic responses in mice and human inpiduals against hematological malignancies using survivinRNAtransfected dendritic cells. J Immunol， 2003; 170: 5391-5397

篇10

作者：張惠中　范清宇　楊安鋼

【關鍵詞】 逆轉錄病毒載體

關鍵詞: 逆轉錄病毒載體;包裝細胞;集落形成單位

摘 要:目的 探討產生重組逆轉錄病毒包裝細胞系建立及其病毒滴度（以cfu表示）的影響因素. 方法 用逆轉錄病毒載體pSLXCMV，以磷酸鈣共沉淀法轉染PA317包裝細胞，挑選抗性集落（PA317/pSLXCMV）擴大培養后，進行PA317/pSLXCMV細胞接種密度、培養溫度（37℃，32℃）、純化方法等對其培養上清中重組病毒cfu影響的比較性研究. 結果 包裝細胞的密度是影響cfu滴度的關鍵因素;降低培養溫度需延長培養時間方可提高cfu滴度;對比離心純化與過濾純化，并未發現兩者之間的差異. 結論 該實驗結果為應用逆轉錄病毒載體進行的ex vivo基因治療實驗研究提供重要參考指標.

Keywords:retroviral vector;packaging cell;colony-forming units

Abstract:AIM To optimize the methods of manufacturing retrovirus containing supernatant of PA317packaging cell line for the use in the retroviral-mediated gene transfer.METHODS Studies were conducted using pSLXCMV retro-viral vector.The colony forming unit（cfu）influence factors including packaging cell density，incubation temperature（32℃and37℃），incubation time and different purification method were compared，respectively.RESULTS Results demonstrated that1.2×106 PA317 packaging cells seeded in100mm plate with the incubation condition at37℃for24hours could get the highest cfu titer of retroviral containing supernatant.As for purification，there was no significant dif-ference between filter and centrifugation methods.CONCLUSION These results will be useful for those who use retrovi-ral vector for ex vivo gene therapy experiment.

0 引言

在目前眾多的基因治療臨床試驗方案中，逆轉錄病毒載體仍是被廣泛應用的載體之一［1-4］ .作為目的基因轉運過程中的逆轉錄病毒載體和包裝細胞，其本身的分子生物學特性已被廣泛研究，但對于包裝后這些含目的基因的重組逆轉錄病毒之生物、物理學特性（如病毒對溫度的敏感性、純化方法等的影響）的研究卻較少.為此，我們對產生重組逆轉錄病毒的包裝細胞系的建立過程及其上清中重組逆轉錄病毒集落形成單位（colony forming unit，cfu）影響因素進行了比較性研究.

1 材料和方法

1.1 材料 本實驗所用表達載體為含有新霉素磷酸轉移酶基因（neo）的鼠白血病源性逆轉錄病毒表達載體pSLXCMV，PA317包裝細胞及Swiss小鼠成纖維細胞NIH3T3培養于含100mL?L-1 小牛血清（GIBCO-BRL）的DMEM培養液中.

1.2 方法

1.2.1 逆轉錄病毒載體包裝及包裝后cfu滴度測定 以標準的磷酸鈣共沉淀法（Promega，Inc.Kit）轉染20μg pSLXCMV質粒到PA317細胞14h，換液繼續培養24h，換含500mg?L-1 G418（Geneticin）的培養液直至抗G418的集落形成，挑選60個克隆，擴大培養，測定包裝細胞上清中病毒的cfu;接種2.5×105 NIH3T3細胞，次日移出培養液，加入10-2 ，10-4 ，10-6 稀釋的含重組逆轉錄病毒的包裝細胞上清1mL.4h后加入5mL完全DMEM培養液繼續培養18～24h.換含有500mg?L-1 G418培養液繼續培養7～10d，直至抗性集落形成.結晶紫染色，計算三個梯度中的cfu（Fig1）.

圖1 略

1.2.2 包裝細胞接種密度對其上清中病毒cfu的影響 分別以0.5，0.7，0.9，1.2及1.5×106 不同細胞密度接種產病毒包裝細胞，于相同溫度及相同培養時間條件下制備含重組逆轉錄病毒的包裝細胞上清，并于相同的條件下測定它們的cfu滴度.

1.2.3 培養溫度及培養時間對cfu滴度的影響 取最高cfu的包裝細胞系集落，以相同的密度接種細胞，分別在37℃及32℃的條件下培養細胞，并于24h及48h分別收集細胞上清測定病毒cfu滴度.

1.2.4 離心及過濾純化對包裝細胞上清中病毒cfu影響 選擇高cfu滴度的包裝細胞克隆用以制備含重組逆轉錄病毒的細胞上清，分別用1500g離心10min純化及Acrylic.45Micron濾器（Corning Inc）純化，測定cfu，比較它們之間cfu滴度的變化.

2 結果

在以pSLXCMV質粒轉染的PA317細胞中挑選60個G418抗性細胞集落，并分別于培養1wk和10wk測定cfu.其中4個克隆# 17，# 19，# 28，# 34于1wk的cfu分別為2.8，3.3，1.8，2.2（colonies?L -1 ），而在10wk測得的cfu分別為1.6，2.7，0.9，0.8（colonies?L-1 ）.

接種0.5，0.7，0.9，1.2及1.5×106 轉染后包裝細胞，24h收集上清測定cfu，結果cfu隨細胞密度上升而上升（Fig2）.在PA317/pSLXCMV包裝細胞密度相同條件下降低溫度需延長培養時間，我們在32℃條件下培養48h獲得了3.0×109 ?L-1 的cfu滴度.

取同一來源的同一份PA317/pSLXCMV包裝細胞上清，分別經離心及過濾除去細胞及細胞碎片等，然后以相同的條件測定cfu滴度.結果并未發現明顯的差別. 轉貼于

圖2 略

3 討論

目的基因導入靶細胞是整個基因治療過程中一個重要環節，其效率的高低將直接影響整個基因治療的效果甚至成敗，而包裝后逆轉錄病毒滴度的高低是重要參數之一.我們從逆轉錄病毒載體轉染的PA317包裝細胞中挑選了60個G418抗性細胞集落，經測定僅有4個集落cfu>106 .經1W至10W傳代培養后測定cfu，所有4個在1W cfu很高的細胞集落經10W傳代培養后其cfu滴度均有所下降，其中#28及#34的cfu

參考文獻

［1］Danos O，Mulligan RC.Safe and efficient generatiion of recom-binant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1988;85（17）:6460-6464.

［2］Miller AD，Muttlmore S.Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production ［J］.Mol Cell Biol，1986;6（8）:2895-2902.

［3］Miller AR，Skotzko MJ，Phoades K，Rhoades K，Belldegrun AS，Tso CL，Daboo R，Mcbride WH，Jacobs E，Kohn DB，Moen R.Simultaneous use of two retroviral vectors in human gene marking trials:Feasibility and potential applications ［J］.Hum Gene Ther，1992;3（6）:619-624.

［4］Muenchau DD，Freeman SM，Cornetta K，Zwiebel JA，Ander-son WF.Analysis of retroviral packaging lines for generation of replication-competent virus ［J］.Virology，1990;176（1）:262-265.