蛋白酶抑制劑范文

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篇1

 

關(guān)鍵詞：  胰蛋白酶抑制劑； 魚腥草； 分離純化

   

胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor ,TI)除了在臨床上用來治療急性胰腺炎、肺氣腫、腦水腫和腦缺血外，目前還發(fā)現(xiàn)它在HIV和腫瘤的治療中也有重要意義［1］。化學(xué)合成的TI生物利用度低、副作用大以及產(chǎn)生耐藥性等缺點，植物來源的TI具有兼容性好、安全和特殊的藥物特性等優(yōu)點。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選具有TI有活性的材料有很廣闊的應(yīng)用前景和市場價值。

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的地上部分，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋之功效，是臨床應(yīng)用極其廣泛的中藥之一。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對魚腥草中TI進行了分離純化，獲得的結(jié)果對開發(fā)植物來源的TI具有重要意義。

1  材料與儀器

1.1   試劑胰蛋白酶(北京麒麟宏偉公司) ，苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺(上海三杰生物技術(shù)有限公司)，DEAE-纖維素(Sigma)，三-羥甲基-氨基甲烷，無水氯化鈣，鹽酸，三氯乙酸，氫氧化鈉等為國產(chǎn)分析純。

1.2  儀器可見光分光光度計，高速冰凍離心機，精密pH 計，數(shù)顯恒溫水浴鍋，精密電子天平，蛋白質(zhì)電泳儀等。

2  方法

2.1  魚腥草胰蛋白酶抑制劑抑制率的測定參考杜旭東等［2，3］的苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺(BAPNA)法。

2.2  魚腥草胰蛋白酶抑制劑的分離與純化參考康莊等［4］的方法進行。

3  結(jié)果

3.1  硫酸銨分級沉淀按照硫酸銨沉淀表，對樣品浸提液添加硫酸銨至30％，45％，60％，75％飽和濃度，分別測定各濃度下的體積、抑制活性和蛋白濃度。pH值為6.0的樣品浸提液實驗結(jié)果見表1，pH值為8.0的樣品浸提液實驗結(jié)果見表2。表1  pH 6.0條件下硫酸銨分級沉淀TI的結(jié)果（略）表2  pH 8.0條件下硫酸銨分級沉淀TI的結(jié)果（略）

    

從圖1可以看出，兩種不同pH體系活性析出均集中于30％～75％飽和度，但45％～60％飽和度下比活力最高，且pH 8.0體系時比活力大。因此，在以后的純化過程中，均采用pH 8.0溶液體系對樣品液進行硫酸銨分級沉淀，加(NH4)2SO4至40％飽和度，以除去堿性或中性雜蛋白。再加(NH4)2SO4至60％飽和度，收集沉淀，溶解透析供下步離子交換層析用。抑制劑的析出在pH 6.0體系比pH 8.0體系要早，這說明抑制劑可能是一種酸性蛋白。

3.2  DEAE-52離子交換分離純化取pH 8.0 Tris-HCl緩沖液透析后的粗提液5 ml，上DEAE-52離子交換柱(ф 2.5 cm×15 cm),流速為0.75 ml/min，以50 ml緩沖液洗脫,使樣品液壓實，再分別用由緩沖液配制的60～400 mmol NaCl溶液進行梯度洗脫，所得各管洗脫液(每管收集3 ml)在紫外光280 nm下測其吸光度，檢測蛋白含量，其梯度洗脫曲線見圖2。

由圖3可知, 在55～70號試管具有HCTI活性，以60～63號活性最高。收集60號試管及附近活性較高的試管保存，進一步處理后進行HCTI相對分子量的測定。洗脫液的濃度梯度與試管號的對應(yīng)關(guān)系見表3。表3  洗脫液的濃度梯度與試管號的對應(yīng)關(guān)系（略）

3.3  魚腥草胰蛋白酶抑制劑的相對分子量的測定

DEAE-52離子交換柱分離純化后HCTI液的活性峰經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果如圖4。

由電泳圖譜上測定的標準蛋白相對遷移率及其分子量，待測蛋白的遷移率為0.530。經(jīng)計算機處理數(shù)據(jù)后，得回歸方程：LogY=－1.355X+5.165 3 如圖5所示，將待測的蛋白相對遷移率帶入方程，計算出HCTI的分子量約為28 kDa。

4  討論

   

本實驗在粗提過程中采用分級鹽析法除掉了部分雜蛋白，分離過程中用到了DEAE-52離子交換層析法，并檢測到活性峰。說明分級鹽析發(fā)揮了一定作用，從而簡化了分離純化過程，測得HCTI分子量約為28 kDa。為該胰蛋白酶抑制劑的進一步深入研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

【參考文獻】

 

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篇2

【關(guān)鍵詞】 大豆胰蛋白酶抑制劑 人宮頸癌細胞 細胞增殖

Abstract: Objective To study the influence of soybean trypsin inhibitor (Trypsin inhibitor.SBTI) on the human hela cells' (Ishikawa) proliferation in vitro. Methods Hela cells were cultured in vitro and effects of SBTI on cell proliferation were measured by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Results For 0.20～1.00 g/L SBTI concentration， with the increasing concentration of the drug and with the duration of the same concentration， the inhibition to cell proliferation was significantly strengthened. The characteristics of the apoptosis can be observed under the light microscope. Conclusions SBTI markedly inhibited hela cells' proliferation on dose- effect and time- effect relationship.

Key words:soybean trypsin inhibitor; the human hela cells; cell multiplication

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。患者年齡分布 呈雙峰狀，35～39歲和60～64歲，平均年齡52.5歲。宮頸癌不僅發(fā)病率居于首位，近年來發(fā)病年齡有提前的趨勢，探尋一種經(jīng)濟有效的、非手術(shù)的、能夠免除平常化療藥物副作用的方法可謂當務(wù)之急。大豆胰蛋白酶抑制劑是從大豆中提取的，是指能夠抑制胰蛋白酶作用的一類物質(zhì)。國內(nèi)外已經(jīng)有文獻報道大豆胰蛋白酶抑制劑具有多種藥理活性，其中包括抗炎，抗病毒，抗腫瘤等。現(xiàn)在人們在對結(jié)腸癌，前列腺癌，乳腺癌的研究已經(jīng)證明大豆胰蛋白酶抑制劑有明顯的抗腫瘤作用［1-3］。大豆胰蛋白酶抑制劑已經(jīng)受到人們的關(guān)注，成為研究的熱點。但是國內(nèi)外關(guān)于大豆胰蛋白酶抑制劑對宮頸癌的研究報道較少。本實驗以細胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)，對大豆胰蛋白酶抑制劑的抗腫瘤作用進行了初步研究，通過證明大豆胰蛋白酶抑制劑對宮頸癌細胞增殖的抑制作用，以期對臨床用藥和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，積累實驗資料，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品和試劑

大豆胰蛋白酶抑制劑為北京中醫(yī)藥大學(xué)細胞與生化實驗室提取（濃度為98%）；RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青血清；胰蛋白酶和EDTA均購于Ameresco公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購于Sigma公司；HERAD—6345型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國赫利氏公司)；IⅩ71倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）;FCANF129004酶標儀(澳大利亞TECAN公司)。

1.1.2 細胞株

人宮頸癌細胞株（Hela）由北京病毒學(xué)研究所惠贈。

1.1.3 培養(yǎng)液

RPMI1640全培養(yǎng)液（RPMI1640+10％胎牛血清+青鏈霉素100 U/mL及100 μg/mL）。

1.2 實驗方法

1.2.1 腫瘤細胞培養(yǎng)

Hela細胞使用含有10%胎牛血清的RPMI1640全培養(yǎng)液，在設(shè)定為37.0 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞可貼壁生長，待細胞生長貼滿底壁的80%左右時傳代。傳代時移去舊的培養(yǎng)液，用PBS洗滌2 次，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化，培養(yǎng)液重懸細胞于新培養(yǎng)液中，每瓶傳代為2或3 瓶。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞生長

將用上述方法培養(yǎng)得到的細胞消化，l 000 rpm離心10 min，計數(shù)，以2×105個/L密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，在37.0 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入濃度分別為0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L 的 SBTI (溶解在含10%胎牛血清的1640全培養(yǎng)液中)100 μL。每一濃度各設(shè)6個平行孔，并分別設(shè)空白孔(即只加入藥液和培養(yǎng)液，不加細胞)以調(diào)零。繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，再培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器上震蕩10 min，應(yīng)用酶標儀于490 nm處測吸光值（A），按照公式：抑制率％=(對照組A－實驗組A)/對照A×100％，求抑制率。實驗在相同條件下均重復(fù)進行3 次。

1.2.3 光鏡下形態(tài)學(xué)觀察

hela細胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，加入0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L的SBTI，培養(yǎng)24 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，并拍攝照片。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，求抑制率，采用重復(fù)測量的方差分析。并繪制出SBTI對Hela細胞抑制作用的量效和時效依賴關(guān)系曲線。

2 結(jié)果

2.1 SBTI對Hela細胞增殖的抑制作用

SBTI能夠明顯的抑制Hela細胞的增殖，并且呈現(xiàn)明顯的量效和時效依賴關(guān)系。在不同的作用時間分別是24、36、48 h，隨著藥物濃度（為0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L）的依次增加，抑制率依次增加，最高可達83.24％，87.83％，96.01％， 除了0.50 g/L與1.00 g/L組之間差異沒有顯著性（P>0.05）外，其他各組差異均有顯著性（P﹤0.01）；在不同的作用濃度（如上的6個濃度），隨著作用時間（24，36，48 h）的依次增加，抑制率也依次增加，除了0.50 g/L和1.00 g/L組的24 h與36 h比較差異沒有顯著性（P>0.05）外，其他的均有有顯著性差異（P﹤0.01），抑制率最高可達49.2%，59.77%，77.52%，80.92%，96.01%。見表1、圖1。表1 不同濃度大豆胰蛋白酶抑制劑在不同作用時間對Hela細胞的抑制率（略）注：* 實驗組與對照組比較P﹤0.01。#與前一組比較P﹤0.01，與上一組比較P﹤0.01但是0.50 g/L與1.00 g/L兩組間在24 h時差異沒有顯著性P>0.05， 0.50 g/L組的24 h與36 h比較差異沒有顯著性P>0.05，1.00 g/L組的24 h與36 h比較差異沒有顯著性P>0.05

2.2 SBTI對Hela細胞形態(tài)上的影響

正常培養(yǎng)時，Hela細胞在傳代后陪培養(yǎng)3～4 h即可貼壁，呈現(xiàn)長橢圓形，10 h后貼壁結(jié)實，呈現(xiàn)多角形而且細胞大小不一，可見巨大細胞，胞質(zhì)也多少不一，核大小不等，可有雙核。24 h后細胞呈現(xiàn)活躍的增殖。48～72 h后細胞生長貼滿一底壁，此期間細胞稱為對數(shù)生長期，見圖2，圖3。96 h后則由于細胞之間互相的抑制而不再增殖。在對數(shù)生長期的細胞，加藥不同濃度后培養(yǎng)24 h，可見1.00 g/L濃度的細胞不再增殖，細胞間距變大，而且貼壁不緊固，見圖4，10.00 g/L濃度的細胞，細胞大部分變圓，邊緣蹺起，且已脫離底壁，少量細胞聚集成一個一個的小細胞團，見圖5。

3 討 論

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor ，TI)是指能夠抑制胰蛋白酶作用的一類物質(zhì)。天然的胰蛋白酶抑制劑來源廣泛，動物植物以及人體內(nèi)均含有TI，如可從黃豆、南瓜籽、牛肺或牛胰以及人尿中提取等。大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor ，SBTI)是從大豆中提取的 ［4］，無毒副作用［5］，具有廣泛的生物學(xué)活性和作用，有著良好的科學(xué)研究和臨床治療前景。

腫瘤的發(fā)生有其遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為多基因突變所致的細胞失控性生長，細胞增殖失控和凋亡受阻是其發(fā)生、發(fā)展的主要原因，有效的抑制腫瘤細胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的新的手段之一。

大豆胰蛋白酶抑制劑具有抗腫瘤作用。Zhang［6］等研究了單純型的大豆胰蛋白酶抑制劑BBI 對人類乳腺癌細胞（MCF7）、人類頭頸腫瘤細胞 （SCC61 和 SQ20B） 、人類宮頸癌細胞（Hela ，Hela-R1 ，Hela-R3） 、非腫瘤生成性人類上皮細胞 （MCF10）、非腫瘤生成性人類甲狀腺上皮細胞（Htori-3）及小鼠成纖維細胞（C3H10T1/2）的影響 ，結(jié)果顯示單純型的大豆胰蛋白酶抑制劑BBI 和結(jié)合型的大豆胰蛋白酶抑制劑BBIC 能夠顯著降低MCF7 和SCC61 細胞系的存活率。

有實驗證明大豆胰蛋白酶抑制劑具有明顯的抑制腫瘤細胞降解基質(zhì)膜的作用，從而能夠抑制腫瘤細胞離開原來的生長部位，突破細胞外基質(zhì)（ECM）的屏障和侵犯周圍毗鄰的正常組織［7］。

大豆胰蛋白酶抑制劑的還可以通過抑制腫瘤細胞的纖溶酶原激活系統(tǒng)起作用。這一系統(tǒng)包括:尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase type plasmino gen activator， uPA)及其受體(uPAR)和uPA抑制劑。大豆胰蛋白酶抑制劑與目前研究較為成熟的尿胰蛋白酶抑制劑（B ikunin）有著類似的作用，即與uPA結(jié)合形成一個復(fù)合體，并競爭地與uPAR 結(jié)合，封閉uPAR 的激活部位，使uPA酶活性不被激活，從而防止腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤。Kobayashi等［8］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤可分泌大量uPA，分泌后隨即與腫瘤細胞表面的uPAR高度結(jié)合，活化的uPA再催化細胞表面的纖溶酶產(chǎn)生蛋白溶解級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致基底膜和細胞外基質(zhì)被破壞。Kobayashi 等［9］ 通過Northernblot、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附法等證實，SBTI以一種時間及劑量依賴形式，在基因及蛋白水平抑制卵巢癌細胞系HOC－Ⅰ和HRA 的uPA 表達。

另外，大豆胰蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)途徑而抑制腫瘤細胞的生長。大豆胰蛋白酶抑制劑通過直接抑制CD44 的二聚化抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。白細胞分化抗原CD44是一種多功能跨膜糖蛋白，它促進腫瘤細胞粘附、遷移，參與新生血管形成等一系列關(guān)鍵步驟。Kobayashi等［10］對人類軟骨肉瘤細胞系HCS22 /8研究顯示，腫瘤細胞間是通過CD44相互識別透明質(zhì)酸，其相互作用是通過CD44蛋白二聚化完成。SBTI 通過直接抑制CD44二聚化介導(dǎo)激活的促細胞分裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)，從而抑制uPA mRNA及其蛋白的表達及腫瘤的侵襲。

本實驗用大豆胰蛋白酶抑制劑處理人宮頸癌細胞Hela細胞后，Hela細胞的生長受到明顯抑制， 隨著藥物濃度為0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L依次增加，作用時間為24、36、48 h的依次延長，其抑制率也明顯增加。并且出現(xiàn)凋亡的特征性改變：細胞大部分變圓，邊緣蹺起，且已脫離底壁，少量細胞聚集成一個一個的小細胞團，并隨著藥物濃度的增加，細胞均漂起，聚集成一個一個的大細胞團。這些結(jié)果表明大豆胰蛋白酶抑制劑能抑制Hela細胞增殖，與文獻報道相似這可能是誘導(dǎo)Hela細胞發(fā)生凋亡有關(guān)。有關(guān)于大豆胰蛋白酶抑制劑抑制Hela細胞的機理方面我們將在以后做進一步的研究。

總之，大豆胰蛋白酶抑制劑，作為一種新型又無毒副作用的抗癌藥，很有值得研究的價值，尤其我國是一個大豆資源豐富的國家，對其機制的深入研究，將對臨床腫瘤治療步入一個新的階段有著重要的意義。

參考文獻

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篇3

【摘要】 目的 探討重組蛋白酶抑制劑(recombinant proteinase inhibitor，RPI)對大鼠胰腺缺血再灌注(I/R)損傷的保護作用。方法 Wistar大鼠30只隨機分為假手術(shù)組、I/R模型組和RPI組，分別測定各組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶含量。檢測各組血清中腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細胞介素1β(IL1β) 的變化。結(jié)果 RPI組的淀粉酶、脂肪酶含量較模型組顯著降低(P

【關(guān)鍵詞】 胰腺;缺血再灌注;重組蛋白酶抑制劑;淀粉酶;腫瘤壞死因子α

胰腺移植能增加患者胰島素分泌細胞，從而有效地控制血糖，防止和改善糖尿病的并發(fā)癥。早期胰腺炎是胰腺移植術(shù)后的常見并發(fā)癥，而缺血再灌注(I/R)損傷是引起移植胰腺炎的主要原因，因此術(shù)后使用高效治療胰腺炎的藥物可取得較好的效果。重組蛋白酶抑制劑(RPI)是含有Kunitz結(jié)構(gòu)域(Kunitz domain)的一個片段(289～345)，由57個氨基酸殘基組成多肽，具有Kunitz型絲氨酸蛋白水解酶抑制(KPI)活性，能夠有效地抑制胰蛋白酶、彈性蛋白酶、纖溶酶、胰血管舒緩素等蛋白水解酶的活性。研究表明，成功地利用DNA重組和分子克隆技術(shù)制備重組人Kunitz型RPI優(yōu)選的表達系統(tǒng)是巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)〔1〕，并通過藥效學(xué)實驗證實RPI對急性胰腺炎有明顯的治療作用〔2〕。本研究旨在觀察RPI在胰腺I/R損傷的保護作用，為臨床防治胰腺I/R損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 Wistar大鼠30只，雌雄兼用，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)動物研究中心提供。RPI由吉林大學(xué)藥學(xué)院制備。淀粉酶和脂肪酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。COLE PARMERP酶標儀 (新加坡 ) TJ6低溫高速離心機(美國BACPKMA公司);2700型生化分析儀(日本SANYO公司);KUBOT KR2000T高速離心機(日本)。

1.2 動物模型與分組 術(shù)前實驗動物禁食 12 h，自由進水，隨機分為假手術(shù)組、I/R模型組和RPI組。術(shù)前30 min假手術(shù)組、I/R模型組尾靜脈推注生理鹽水1 ml，RPI組尾靜脈推注RPI(8×104 kIU/kg) 。3%戊巴比妥鈉 30 mg/kg腹腔注射，腹正中切口，分離胃脾韌帶，結(jié)扎脾門血管，夾持脾臟，將胃翻向大鼠右側(cè)，暴露膈肌與左腎動脈之間的腹主動脈，游離腹腔干至脾動脈，用無創(chuàng)動脈夾閉脾動脈，造成胰腺體尾缺血模型，30 min后松開動脈夾進行再灌注，松開動脈夾前各組按上述方法再次給藥 1 次。假手術(shù)組以相同的手術(shù)方法切開顯露腹腔干及脾動脈，但不夾閉血管。再灌注時間均為 6 h。

1.3 大鼠血清淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)測定 各組動物分別在再灌注后 6 h腹主動脈取血約 3 ml，2 000 r/min 離心 10 min，分離血清，測定血清AMY、Lipase。

1.4 大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細胞介素1β(白介素1β)的測定 標本采集同1.3，分離血清，采用ELISA方法測定血清TNFα、IL1β，具體步驟按試劑盒要求進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，各組數(shù)據(jù)的均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 RPI對胰腺I/R損傷大鼠血清AMY和Lipase的影響 I/R模型組大鼠血清AMY及Lipase含量均明顯增高，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異。RPI組與I/R模型組比較，大鼠血清AMY及Lipase含量均明顯降低(P

2.2 RPI對胰腺I/R損傷大鼠血清TNFα和IL1β的影響 I/R模型組大鼠血清TNFα和IL1β水平均明顯增高，與假手術(shù)組比較差異顯著(P

3 討 論

I/R損傷是造成胰腺移植后各種并發(fā)癥的主要原因之一，如移植術(shù)后早期胰腺炎、移植術(shù)后胰島細胞功能不良，這些都大大降低了胰腺移植的效果〔3〕。I/R損傷的具體發(fā)病機制復(fù)雜，目前認為與能量代謝障礙、 氧自由基的產(chǎn)生以及中性粒細胞激活并釋放炎性細胞因子等有關(guān)〔4〕。

基因工程制備的RPI是一種小分子量β淀粉樣蛋白前體(APP)，包含一段KPI結(jié)構(gòu)域，具有強抑制活性，氨基酸序列與KPI家族的抑肽酶43%同源性，具有與KPI相同的生物學(xué)活性和藥理作用。本研究中通過建立大鼠胰腺I/R損傷模型后，血清AMY和Lipase明顯升高，而給予RPI治療后則明顯降低，說明RPI可有效地抑制胰酶的分泌和釋放。

另外炎性細胞因子的釋放在胰腺I/R損傷的病理生理中起重要作用。炎性細胞因子主要由機體的免疫細胞分泌，在各種因素刺激如感染、 外傷、 缺血后其表達可急劇增加，過度表達可導(dǎo)致或加重組織損傷〔5〕。其中，TNFα 和 IL1β 已被普遍認為是介導(dǎo)胰腺I/R損傷的主要細胞因子，其水平異常增高時，可直接作用于細胞，使組織細胞溶解;作用于中性粒細胞時，刺激中性粒脫顆粒，生成自由基，釋放各種蛋白酶和其他水解酶，誘導(dǎo)細胞凋亡，造成局部組織損傷和毛細血管通透性增高，進一步加重微循環(huán)障礙，微循環(huán)障礙反過來又誘發(fā)炎癥介質(zhì)的釋放。本研究也顯示，RPI可明顯降低I/R模型組血清TNFα、 IL1β，說明胰腺I/R后，RPI通過抑制炎性細胞因子的作用而達到對胰腺I/R的保護作用。

參考文獻

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篇4

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥；性激素受體；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；免疫組織化學(xué)

子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥endometriosis,EMs）發(fā)病機理有多種學(xué)說，隨著分子生物學(xué)研究的進展，發(fā)現(xiàn)性激素和性激素受體在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，內(nèi)異癥是激素依賴性疾病，近年來研究細胞外基質(zhì)的降解與重建是異位內(nèi)膜侵襲并種植于腹膜的關(guān)鍵。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅依賴的，在結(jié)構(gòu)上高度同源的蛋白水解酶，是降解細胞外基質(zhì)成分最重要的酶類[1]。有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子介入了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生過程[2]，為深入探討性激素受體和免疫因子在內(nèi)異癥發(fā)病中的作用，現(xiàn)采用免疫組化PV-9000法對子宮肌瘤患者的正常子宮內(nèi)膜和內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜作比較，檢測雌激素受體(entrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)在異位內(nèi)膜中的表達，從而進一步闡明內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的機制。

1 研究資料與方法

1.1標本來源與分組所有標本均取自2003年1月～2006年8月間，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)腹腔鏡或開腹手術(shù)，均經(jīng)病理診斷。研究組1為EMs異位內(nèi)膜組：標本均為異位內(nèi)膜，大多為卵巢巧克力囊腫，共84例，年齡25.3～50.0歲，平均年齡（38.6±6.6）歲；按美國生育協(xié)會修正分期標準(r-AFS)為：Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ期28例，Ⅳ期30例。研究組2為EMs在位內(nèi)膜組：為研究組1中部分內(nèi)異癥患者子宮全切術(shù)后對應(yīng)的子宮內(nèi)膜，共44例，年齡37.0～50.0歲，平均年齡（43.7±3.0）歲。對照組：因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)者的正常子宮內(nèi)膜，共32例，年齡20.0～49.5歲，平均年齡（42.7±7.7）歲。上述患者術(shù)前半年內(nèi)均未接受性激素及抗EMs藥物治療，無其他內(nèi)分泌類疾病史。

1.2標本的制備與檢測

1.2.1 取材與包埋 術(shù)中取卵巢巧克力囊腫壁（異位內(nèi)膜），子宮肌瘤和部分巧克力囊腫患者的在位子宮內(nèi)膜，將內(nèi)膜組織置于10%甲醛液固定，二甲苯透明后石蠟包埋。

1.2.2 ER、PR和TIMP-1檢測 4 μm連續(xù)切片后脫蠟，水化組織切片，3% H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，根據(jù)所應(yīng)用的ER、PR和TIMP-1的要求，嚴格按北京中山生物技術(shù)有限公司提供的具體操作步驟要求進行。

1.2.3 結(jié)果評定 顯微鏡下觀察，細胞核顯色棕褐色者為強陽性，淺棕或淺褐色者為陽性，藍色為陰性。采用高清晰彩色電子圖像分析儀，用平均密度＝棕褐色細胞核/（棕褐色細胞核+藍染細胞核）代表ER、PR和TIMP-1的表達強度，每個切片選擇4個視野，10×40倍鏡放大，每個視野測定3次后取均值，由同一人用同一臺儀器測定。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 評分數(shù)據(jù)用x±s表示，運用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理進行t檢驗。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示：異位內(nèi)膜組織中ER、PR及TIMP-1的表達明顯低于正常內(nèi)膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P

3 討論

EMs是激素依賴性疾病，雌、孕激素與子宮內(nèi)膜細胞上的相應(yīng)ER、PR發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生一定效應(yīng)，從而影響細胞的代謝過程或?qū)虮磉_進行調(diào)控[3]。且Sampson提出經(jīng)血逆流學(xué)說被認為是一種正常現(xiàn)象，因并非所有發(fā)生經(jīng)血逆流的婦女都將患內(nèi)異癥，這說明經(jīng)血逆流可能僅僅是個誘因。TIMP-1是一種糖蛋白，它能與活化的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)形成1∶1復(fù)合體而使它們失活。而異位內(nèi)膜的細胞外基質(zhì)的降解與重建是異位內(nèi)膜侵襲并種植于腹膜的關(guān)鍵，因此檢測ER和PR及TIMP-1在內(nèi)異癥中的表達，對研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展等方面有重要意義。

本實驗采用免疫組化方法，檢測了異位內(nèi)膜組織及EMs在位內(nèi)膜中ER、PR、TIMP-1的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜組織中ER、PR、TIMP-1的表達明顯低于正常內(nèi)膜，說明異位內(nèi)膜雖然在結(jié)構(gòu)和功能上與正常子宮內(nèi)膜基本相同，同樣有月經(jīng)周期的改變。內(nèi)異癥患者的異位內(nèi)膜ER、PR的表達明顯低下，使得異位內(nèi)膜激素變化幅度不如正常內(nèi)膜明顯，說明異位子宮內(nèi)膜從周圍組織纖維化到供血不足及組織分化程度不同，局部生長環(huán)境不良以及腺體細胞中激素受體的變化等，造成了對激素反應(yīng)的差異。同時也說明TIMP-1對MMPs的抑制作用減弱，相反也說明MMPs的作用增強，對細胞外基質(zhì)的降解與重建作用增強，而細胞外基質(zhì)的降解與重新建成是異位內(nèi)膜侵襲并種植于腹膜的關(guān)鍵[4]，從而導(dǎo)致許多病理過程。本研究表明TIMP-1在EMs病人在位內(nèi)膜中的表達與正常內(nèi)膜中的表達差異有顯著性，表明EMs病人在位內(nèi)膜比正常內(nèi)膜表現(xiàn)出更強的侵襲能力，只有內(nèi)膜組織逆流入腹腔后，周圍因素發(fā)生改變，才促使TIMP-1表達減弱，從而發(fā)生內(nèi)膜的異位侵襲。因此異位內(nèi)膜組織中TIMP-1的異常表達在EMs的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了主要作用。

盡管將EMs稱為激素依賴性疾病，但異位內(nèi)膜畢竟與在位內(nèi)膜不同，這種對激素的依賴是不完全的，這也可能是某些用激素治療不能完全根除EMs的原因所在。EMs患者子宮內(nèi)膜的生物學(xué)特性不同于正常在位內(nèi)膜，其差異在其形成中可能具有決定性作用，即EMs“在位內(nèi)膜決定論”[5]。本試驗結(jié)果顯示：在位內(nèi)膜組織中ER、PR明顯高于正常內(nèi)膜組織，而TIMP-1在在位內(nèi)膜中呈低表達，充分表明EMs在位內(nèi)膜組織局部特性的改變在EMs的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用，進一步突出了“在位內(nèi)膜決定論”的理論意義。在位內(nèi)膜中ER及PR較正常內(nèi)膜組織中高，而TIMP-1卻較正常內(nèi)膜組織中低，是否又說明了雌孕激素對TIMP-1有抑制的作用，使得在位內(nèi)膜碎片一旦種植到腹腔即可發(fā)揮其異位種植的作用。Ramon等[6]卻發(fā)現(xiàn)TIMP-1在患者中的活性明顯高于正常對照組，他們認為TIMP-1活性增高，抑制細胞侵襲的能力加強，這一結(jié)果有利于解釋臨床上經(jīng)常發(fā)生的子宮內(nèi)膜異位灶對其周圍的卵巢組織沒有侵襲的現(xiàn)象。但同時，TIMPs和MMPs一般都是以復(fù)合體形式出現(xiàn)的，不知是否還與目前大家討論比較熱的MMPs/TIMPs比值失衡還有關(guān)[7，8]，有待進一步研究證實。

綜上所述，異位內(nèi)膜組織中ER、PR、TIMP-1的低表達，表明異位內(nèi)膜仍保留對激素反應(yīng)的特性，是其得以種植生長的必要條件，細胞外基質(zhì)的降解與重建作用增強是關(guān)鍵。異位內(nèi)膜對激素敏感性的降低，也可能是某些用激素治療不可能完全根除內(nèi)異癥的原因所在，而內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜中ER、PR的高表達及TIMP-1表達較低，則是內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素。

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篇5

【關(guān)鍵詞】 鈣蛋白酶； 缺血再灌注損傷； 鈣離子； 凋亡

鈣蛋白酶（calpain）是半胱氨酸異源二聚體蛋白酶，廣泛存在于包括心臟在內(nèi)的各種組織細胞中，在體內(nèi)calpain可被鈣離子激活后對特定的底物進行限制性水解，參與了細胞增殖、分化、遷移和細胞信號傳導(dǎo)等多種生物學(xué)功能［1］。calpain的異常激活則參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)退行性病、外傷性腦損傷和脊髓損傷等，而對其在心臟病理條件下的作用研究不是很多。本試驗利用calpain特異性抑制劑，觀察其對離體大鼠心臟缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷的影響，旨在探討calpain在I/R損傷中作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 calpain抑制劑(ALLN)、N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC、AMC、calpain單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的二抗、FLUO-3/AM FITC (美國Sigma公司)，Western blotting ECL發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司），膠原酶Ⅰ型（美國Amresco公司），GAPDH單克隆抗體（上海康成生物公司），其它試劑為國產(chǎn)分析純。FACSAria流式細胞儀（美國BD公司），Langendorff離體灌流裝置由揚州醫(yī)院心血管病研究所提供，熒光分光光度計（日立，F(xiàn)-4500），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 實驗動物為成年雄性SD大鼠，250～300 g，由揚州大學(xué)動物比較中心提供。

1.2 方法

1.2.1 離體大鼠心臟I/R模型的制備和分組 (1)模型制備：SD大鼠，3%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1及肝素500 U·kg-1腹腔注射，麻醉后無菌條件下摘取心臟，在4 ℃的Kerbs-Henseleit（K-H）液中迅速行主動脈插管并與Langendorff逆灌裝置連接，用以95%O2、5%CO2達飽和的K-H液行逆行恒溫恒壓灌注，整個試驗過程中溫度控制在(37±0.5)℃、pH(7.4±0.5)，灌注壓90 cmH2O，并于灌注過程中持續(xù)通入95%O2、5%CO2混合氣體。(2)分組：心臟復(fù)跳成功后平衡15 min隨機分為以下5組，每組9只。①正常灌注組（control組），離體大鼠心臟用K-H液灌注85 min。②I/R組，離體大鼠心臟用K-H液先灌注15 min后停止灌注30 min，然后再用K-H液恢復(fù)灌注40 min。③ALLN+control組，離體大鼠心臟用含10 μmol·L-1ALLN的K-H液先灌注15 min，后用K-H液恢復(fù)灌注70 min。④ALLN+I/R組，用含10 μmol·L-1 ALLN的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接著再用K-H液恢復(fù)灌注40 min。⑤二甲亞砜(DMSO)+I/R組，用含0.3%DMSO的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接著再用K-H液恢復(fù)灌注40 min。

1.2.2 乳酸脫氫酶(LDH)和冠狀動脈流出量(CF)的測定 收集再灌注15 min時單位時間內(nèi)的CF，并應(yīng)用日立全自動生化分析儀測定冠脈流出液中LDH的漏出量。

1.2.3 心肌勻漿制備 去除心房和右心室，將剩余的心臟組織剪碎后加入10 ml·（g組織）-1勻漿液（10 mmol·L-1 NaHCO3，5 mmol·L-1NaN3，15 mmol·L-1Tris-HCl，pH 6.8），制成勻漿后離心（10 919 ×g，20 min），收集上清，分裝儲存于-70 ℃，以上操作均在4 ℃進行，蛋白濃度采用Bradford法測定。

1.2.4 calpain活性測定 我們以N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC（calpain特異性作用底物）與calpain 反應(yīng)釋放出AMC的熒光強度來代表不同樣品中calpain的活性［2］。取150 μl的心肌勻漿液，加入1 ml的反應(yīng)緩沖液（145 mmol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.3）37 ℃水浴箱中振蕩10 min，再加入150 μl的500 μmol·L-1的N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC，在37 ℃水浴箱中振蕩60 min 后取1 ml加入比色皿，在熒光分光光度計上用波長為360 nm的光線激發(fā)后，測定在440 nm處發(fā)射的熒光強度。用已知濃度的AMC作標準曲線，測得的結(jié)果以ngAMC·min-1·(mg蛋白)-1表示。

1.2.5 Western blotting測定calpain蛋白表達 取40 μg 變性蛋白(心肌勻漿液)經(jīng)12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(電壓50 V，2 h)，轉(zhuǎn)膜后5％脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，洗膜3次，每次10 min，洗膜后與1∶1 000稀釋的calpain單克隆抗體37 ℃結(jié)合2 h，洗膜3次，每次10 min，然后用1∶4 000稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗37 ℃結(jié)合2 h，洗膜3次，每次10 min，以上的洗膜均在搖床上進行，洗膜所用液體均為PBS+0.05％Tween-20。最后用化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯色，X光膠片曝光，顯影，定影。用同樣的方法做內(nèi)參GAPDH的Western blotting免疫印跡［一抗（1∶3 500），辣根過氧化酶標記二抗（1∶5 000）］，X光膠片采用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行掃描，并用自帶的Quantity One分析軟件對結(jié)果進行定量分析，各組calpain條帶與各自對應(yīng)的內(nèi)參GAPDH的積分光密度值的比值作為結(jié)果。

1.2.6 心肌細胞內(nèi)鈣離子及凋亡的測定 再灌注結(jié)束后，每組隨機取3枚心臟采用酶分解法制備成年大鼠心肌細胞［3］，調(diào)整細胞濃度至2×106 ml-1，在相差顯微鏡下可見心肌細胞呈細長桿狀，邊緣光滑，橫紋清晰。

(1)心肌細胞內(nèi)鈣離子測定：每組樣品中加入適量的FLUO-3/AM液（終濃度為5 mmol·L-1），混勻后避光37 ℃振蕩30 min，去除負載液，用D-Hanks液洗滌3次，流式細胞儀參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm，每組樣品取10 000個細胞，以平均熒光強度代表各組細胞內(nèi)的鈣離子濃度。FLUO-3/AM用DMSO配制，混勻后-20 ℃保存。

(2)凋亡的測定：按照Annexin-Ⅴ-FLUOS Staining KIT使用說明，取30 μl Annexin-Ⅴ染料加入到1.5 ml的結(jié)合緩沖液中，再加入30 μl PI染料，充分混勻。每個細胞樣品中加入100 μl的混合染料，混勻，避光室溫放置15 min。用流式細胞儀測定細胞凋亡率。結(jié)果判定Annexin-Ⅴ-／PI-為正常細胞，Annexin-Ⅴ+／PI-為凋亡細胞，Annexin-Ⅴ+ ／PI+ 為壞死細胞。每組樣品取10 000個細胞，計算Annexin-Ⅴ+／PI-細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以x-±s表示，應(yīng)用SPSS11．5統(tǒng)計軟件分析處理，并采用單因素方差檢驗(ANOVA)分析組間差異的顯著性。若差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，進一步進行兩兩比較(SNK法)，P

2 結(jié)

果

2.1 各組間再灌注15 min時CF和LDH比較

與control組相比，I/R組和DMSO+I/R組的CF顯著降低(P

2.2 各組間calpain活性比較

I/R組calpain活性為0.365 5±0.001 7，明顯高于control組的0.136 0±0.002 2(P

轉(zhuǎn)貼于 2.3 各組間calpain蛋白表達比較

I/R組calpain/GAPDH（2.34±0.20）明顯高于control組（0.73±0.13）、ALLN+control組（0.64±0.07）和ALLN+I/R組（1.19±0.14)，均為P

1. control組；2. ALLN+control組;

3. ALLN+I/R組；4. I/R組;

5. DMSO+I/R組

圖1 各組大鼠心肌calpain和

內(nèi)參GAPDH蛋白印跡

Fig 1 The protein blot of calpain and

GAPDH in all groups

2.4 各組間細胞內(nèi)鈣離子濃度比較

I/R組與DMSO+I/R組明顯高于其他各組（P

2.5 各組間細胞凋亡指數(shù)的比較

與I/R組相比，control組、ALLN+control組和ALLN+I/R組的細胞凋亡指數(shù)均顯著降低（P

3 討

論

心肌I/R損傷一直是臨床和基礎(chǔ)研究的熱點，其發(fā)生機制可能與再灌注期自由基生成過多、鈣超載、微血管損傷和能量生成不足等有關(guān)，其中鈣超載可通過以下機制引起心肌細胞功能障礙：(1)導(dǎo)致線粒體功能障礙。(2)引起心律失常。(3)使肌原纖維攣縮、斷裂。(4)激活許多鈣依賴的酶系統(tǒng)，如磷脂酶，可促進膜磷脂水解，造成細胞膜及細胞器質(zhì)膜受損，此外還可激活calpain，后者是半胱氨酸異源二聚體蛋白酶，其家族包括具有組織特異性的n-calpain和非組織特異性的μ-calpain 和m-calpain。 其中μ-calpain 和m-calpain分布廣泛且生化和催化特性十分相似，但兩者激活表現(xiàn)半最高活性所需鈣離子濃度不同，前者需1～20 μmol·L-1，后者需250～750 μmol·L-1。calpain活性主要受calpain-激活蛋白，calpain-抑制蛋白（calpastatin）、鈣離子、PKA的磷酸化以及亞硝基化調(diào)節(jié)［4-5］。

本試驗中我們利用離體心臟Langendorff灌流模型，測量了再灌注15 min時的CF和冠脈流出液中LDH的漏出量，并利用流式細胞儀測定細胞內(nèi)鈣水平和細胞的凋亡程度，從而綜合評價心臟損傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R組較control組損傷明顯，證實我們離體大鼠心臟I/R模型構(gòu)建成功，若在I/R前預(yù)先使用10 μmol·L-1的ALLN可明顯減輕I/R所致的損傷，但與control

組仍有差異，這些提示ALLN通過抑制calpain活性，一定程度上減輕了I/R所致的細胞壞死和凋亡，這與國外一些研究是相符的。Barta等［6］試驗發(fā)現(xiàn)心肌纖維組成蛋白和骨架蛋白均可被calpain降解，其中相對分子質(zhì)量為284 000的胞襯蛋白(fodrin)和相對分子質(zhì)量為3 000 000～3 300 000的肌聯(lián)蛋白（connectin）對calpain最敏感，所有這些蛋白的水解都將損傷心臟功能，而ALLN可減輕這種損傷。Chen等［7］通過實驗證實了［Ca2+］i的增加可以激活calpain，后者水解Bid形成tBid(截短的Bid)，促使了BAX/BAK易位和寡聚化，促使細胞色素c的釋放，而ALLN可以阻止Bid活化所造成的細胞凋亡。

為進一步研究calpain在I/R中的作用，我們利用calpain特異性熒光底物以及免疫印跡法分析了各組calpain活性和蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)calpain活性在I/R組明顯高于control組，而預(yù)先使用ALLN可使calpain活性明顯降低，但令人驚奇的是，該組細胞內(nèi)鈣水平較I/R組也顯著降低，此前Armstrong等［8］試驗發(fā)現(xiàn)，激活的calpain可以蛋白水解肌漿網(wǎng)膜骨架上的α-fodrin，從而增加肌漿網(wǎng)的脆性，這些在再灌注的前幾分鐘持續(xù)惡化，使肌漿網(wǎng)對心肌細胞內(nèi)鈣的處理能力趨于崩潰，最終導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生。由于心肌肌漿網(wǎng)是控制心肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，結(jié)合相關(guān)文獻［9］及我們的試驗結(jié)果，我們提出以下假設(shè)：在I/R損傷中，細胞內(nèi)calpain激活后發(fā)揮其蛋白酶的功能，損害肌漿網(wǎng)的功能，造成細胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運的失調(diào)，加重鈣超載，而增加的鈣離子又可以進一步激活calpain，從而形成一惡性循環(huán)，而ALLN可以打斷這種循環(huán)，一定程度緩和了鈣超載，從而保護了細胞，這方面我們將在下一步試驗中繼續(xù)研究。

關(guān)于calpain蛋白表達情況，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)calpain蛋白量與活性相一致，這提示在I/R損傷中calpain蛋白表達是增加的。此外為排除溶劑DMSO對試驗的影響，我們增加DMSO+I/R組，其各項指標與I/R組相比無明顯差異。

綜上所述，我們認為10 μmol·L-1ALLN可一定程度緩和I/R引起的細胞壞死和凋亡，作用機制可能與其抑制calpain活性，從而減輕calpain對細胞的損傷，維持了細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)。

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篇6

[關(guān)鍵詞] 組蛋白去乙酰化酶；抑制劑；腫瘤

[中圖分類號] R977.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）06（a）-0015-07

Research progress of histone deacetylase inhibitors

GU Hua-wei LIU Yan SANG Jun-xia LIU Jing

Pharmacy of Department，the Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology；Tumor Hospital of Anyang City in Henan Province，Anyang 455000，China

[Abstract] Histone deacetylase（HDACs） is a kind of protease which plays an important role in the modification of chromosome and regulation of gene expression，and is closely associated with the occurrence and development of tumor.Histone deacetylase inhibitors（HDACIs） of great significance in the development of the antitumor drugs.The molecular structures of HDACs，HDACs with malignant tumor，the molecular structures of HDACIs，main design ideas of HDACIs，structure-activity relationship were reviewed in this article.

[Key words] Histone deacetylase；Inhibitors；Tumor

近年來，腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的一大殺手。2012年全球新增癌癥病例達到1400多萬例，預(yù)計在未來20年內(nèi)，癌癥死亡人數(shù)將從每年820萬飆升至1300萬[1]。2014年2月3日，世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)表的《2014年世界癌癥報告》顯示，全球癌癥死亡率正在以驚人的速度增加，平均每8個死亡病例中就有1例死于癌癥。目前腫瘤治療方法主要是手術(shù)治療、化學(xué)療法和放射治療，花費高、治愈率低、副作用大，給患者造成了沉重的負擔，如何解決這些問題成為科研以及醫(yī)務(wù)工作者密切關(guān)注的問題。

隨著表觀遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因水平的病變密不可分。組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HATs）與組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與表達的兩個主要酶家族。HATs將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上，降低組蛋白與DNA的結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄及表達；HDACs使組蛋白去乙酰化，增強組蛋白與DNA的結(jié)合，染色質(zhì)致密卷曲，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄及表達。在腫瘤細胞中，HDACs過度表達，去乙酰化作用增強，抑制了特定基因的表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系[2-3]。早在1990年就有科學(xué)研究[4-5]表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACIs）有助于抑制腫瘤細胞的存活。本文就HDACs與腫瘤的關(guān)系及其現(xiàn)階段已經(jīng)上市、處于臨床及臨床前研究的抑制劑進行綜述，以期為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供一些新思路。

1 HDACs的結(jié)構(gòu)及其與腫瘤的關(guān)系

真核細胞中，染色質(zhì)由DNA、組蛋白及其他蛋白組成。組蛋白構(gòu)成的八聚體緊緊環(huán)繞在DNA周圍，構(gòu)成核小體，是染色質(zhì)的基本組成單位。組蛋白的N-端氨基酸是可被修飾的活性位點，可以發(fā)生乙酰化、磷酸化、甲基化等作用，調(diào)控基因的表達。HDACs可能通過以下2種機制調(diào)控基因的表達：①HDACs使組蛋白去乙酰化，增強組蛋白與DNA結(jié)合，染色質(zhì)致密卷曲，基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制；②HDACs使一些非組蛋白在DNA附近集聚，與組蛋白N-端活性位點發(fā)生作用，影響轉(zhuǎn)錄過程[6-9]。

目前已知的人類HDACs存在18種亞型，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可以分為以下4類。Ⅰ類：HDAC1～3和8；Ⅱ類：HDAC4～7，9～10；Ⅲ類：SIRT1～7；Ⅳ類：HDAC11[10-11]。其中Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類HDACs為Zn2+依賴酶，Ⅲ類為NAD+依賴酶。Zn2+依賴的HDACs是研究的主要靶點，其僅有HDAC4、HDAC7和HDAC8獲得了蛋白晶體結(jié)構(gòu)（圖1）。表觀遺傳學(xué)研究[12]表明，在眾多的亞型中，HDAC1和HDAC2與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系最為密切。

圖1 HDAC8的晶體結(jié)構(gòu)及其與TSA結(jié)合（PDB ID：1T64）

組蛋白的乙酰化與去乙酰化分別受HATs和HDACs的調(diào)控，一旦平衡被打破，基因的轉(zhuǎn)錄過程將失調(diào)。病理情況下，HDACs過度表達，一些腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，引起一系列疾病。例如，HDAC1在胃癌[13]和前列腺癌[14]中高表達，HDAC1和HDAC6在胸腺癌中高表達[15-16]，HDAC2和HDAC3在結(jié)腸直腸癌中高表達[17-18]等。因此，HDACs是抗腫瘤藥物研發(fā)中的一個重要靶點。

2 HDACIs的結(jié)構(gòu)及其與腫瘤的關(guān)系

目前設(shè)計開發(fā)的HDACIs種類繁多，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為4類：①異羥肟酸類；②苯酰胺類；③環(huán)肽類；④羧酸類。按照其結(jié)構(gòu)特征又可分為3部分片段：①與Zn2+絡(luò)合的異羥肟酸結(jié)構(gòu)；②中間的脂肪鏈連接部分；③親脂性的帽子結(jié)構(gòu)，與受體口袋疏水性結(jié)合。臨床實驗及臨床前研究表明，HDACIs對多種腫瘤細胞具有生長抑制的作用，影響腫瘤細胞分化及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，用于腫瘤的單一或聯(lián)合治療（表1）。

2.1 異羥肟酸類

2.1.1 處于臨床實驗研究的抑制劑 異羥肟酸類HDACIs是在二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的基礎(chǔ)上研究開發(fā)的。Friend等[19]在復(fù)蘇小鼠紅白血病細胞時發(fā)現(xiàn)DMSO對傳代細胞具有生長抑制作用，并且2/3的病變細胞有好轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。該現(xiàn)象引起了Marks等[20]的注意，拉開了異羥肟酸類HDACIs的研究序幕。研究表明，一些極性小分子胺類化合物同樣對小鼠紅白血病細胞具有生長抑制作用，但其抑制活性未能顯著增高。兩分子的胺類化合物拼接后得到二乙酰胺類化合物六亞甲基二乙酰胺（HMBA，13）（圖2），并選擇性的改變基因的表達，從而起到抑制腫瘤細胞生長的作用，對小鼠紅白血病細胞的抑制IC50達到5 mmol/L，抑制活性得到顯著提高。臨床前研究表明，HMBA具有毒性低、良好的藥動學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點。HMBA曾進入二期臨床實驗，用于治療骨髓異常綜合征和急性髓細胞白血病[21]，但由于其活性較低，劑量需求過大，在患者中耐受性差，且有血小板減少等副作用，研究被迫終止。

圖2 部分異羥肟酸類HDACIs的結(jié)構(gòu)及其活性

對HMBA進行進一步的結(jié)構(gòu)修飾，采用羥肟酸片段取代酰胺片段，親脂性的苯環(huán)取代一側(cè)羥基，以期同時達到離子螯合和與疏水性口袋結(jié)合的作用，獲得了一系列的HDACIs。Merk公司開發(fā)的化合物Vorinistat（SAHA，1）是該類化合物中理化性質(zhì)及活性較好、毒性適中的化合物，于2006年被美國FDA批準上市，主要用于治療CTCL。Belinostat（PXD-101，2）是TopoTarget公司開發(fā)的HDACIs，對HDACs的IC50為27 nmol/L，目前已經(jīng)在美國批準上市，用于治療外周T細胞淋巴瘤。Novartis公司研發(fā)的Panobinostat（LBH589，3）用于治療惡性淋巴瘤，例如CTCL已經(jīng)進入Ⅲ期臨床實驗。體內(nèi)外實驗表明，Italfarmaco公司開發(fā)的Givinostat（ITF2357，4）具有抗炎和細胞毒作用，一項用于治療霍奇金淋巴瘤Ⅱ期臨床實驗表明，Givinostat具有抑制淋巴瘤的作用，并且呈現(xiàn)出了良好的安全性。Pharmacyclics公司開發(fā)的Abexinostat（PCI-24781，5）用于治療B細胞淋巴瘤現(xiàn)在正處于Ⅱ期臨床實驗階段[22]。Resminostat（4SC-201，6）是可以口服的HDACIs，用于治療頑固性腫瘤處于Ⅰ期臨床實驗階段[23]。Quisinostat（JNJ-26481585，7）作為廣譜HDACIs，用于治療骨髓瘤、白血病等的研究正在進行[24-25]。

2.1.2 處于臨床前研究的抑制劑 Guan等[26]根據(jù)異羥肟酸類HDACIs的構(gòu)效關(guān)系，設(shè)計一類取代1，3，4-噻二唑類的化合物，獲得了化合物14（表2），其IC50為89 nmol/L，優(yōu)于SAHA，但該化合物抑制細胞增殖能力卻弱于SAHA。Guan等[27]繼續(xù)對其結(jié)構(gòu)改造，用取代的芳雜環(huán)代替苯環(huán)，得到化合物15～17（表2），其對HDACIs的抑制活性與抑制細胞增殖能力均高于SAHA，有繼續(xù)開發(fā)的價值。Woo等[28]發(fā)現(xiàn)Trichostatin A（TSA，18）（圖2）是一種天然異羥肟酸類HDACIs，對HDAC1的IC50為5 nmol/L。Yang等[29]通過改變連接部分的C鏈長度及帽子區(qū)域的結(jié)構(gòu)類型，發(fā)現(xiàn)了化合物19（圖2），對HDAC1的IC50為1.8 nmol/L，強于SAHA，體內(nèi)外實驗具有良好的結(jié)果。Yang等[30]合成了一系列噻吩并嘧啶類異羥肟酸HDACIs，其中化合物20對HDAC1和HDAC3的IC50分別為1.14 nmol/L和3.56 nmol/L（圖2）。

表2 1，3，4-噻二唑異羥肟酸類HDACIs的結(jié)構(gòu)及其活性

2.2 苯甲酰胺類

20世紀90年代，藥物化學(xué)家發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的抗驚厥藥地西林具有抑制細胞生長的作用，動物實驗顯示其對各種實體瘤具有一定的抑制活性。其乙酰化產(chǎn)物CI-994（21）（圖3）的抗腫瘤活性與地西林相當，但是代謝穩(wěn)定性更強。臨床前研究表明，CI-994具有較好的抗腫瘤活性和較低的毒性[31-32]。目前，CI-994與吉西他濱聯(lián)合治療非小細胞肺癌已經(jīng)完成了Ⅲ期臨床實驗。進一步結(jié)構(gòu)修飾表明，CI-994的A環(huán)可被生物電子等排體，如芳香環(huán)或者芳雜環(huán)取代，但活性保持不變或增強；如脂肪鏈取代，活性降低。Hamblett等[33]用取代吡啶環(huán)代替A環(huán)合成得到了化合物22（表3），其對HDAC1的IC50為73 nmol/L。體內(nèi)實驗表明，化合物22具有良好的藥動學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，具有開發(fā)成藥物的潛力。

CI-994（21）

圖3 CI-994的結(jié)構(gòu)

表3 苯甲酰胺HDACIs的結(jié)構(gòu)及其抑制活性

1999年，Suzuki等[34]報道了一類新型的苯甲酰胺類衍生物，A環(huán)的4位是亞甲氨基而非氨基取代，得到了一個活性較好的先導(dǎo)化合物Entinostat（MS-275，8），對HDACIs的IC50達到了4.8 μmol/L。Syndax公司正在對其進行臨床研究開發(fā)，用于治療霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌等疾病，研究正在處于Ⅱ期臨床實驗研究階段，2013年9月FDA已經(jīng)提議與Syndax公司聯(lián)合對Entinostat進行Ⅲ期臨床實驗研究。Paquin等[35]用吡啶、嘧啶、三嗪等芳雜環(huán)對4位亞甲氨基進行結(jié)構(gòu)修飾，得到了化合物23（表3），對HDAC1的IC50為70 nmol/L。Frechette等[36]開發(fā)出了化合物24（表3），對HDAC1的IC50為60 nmol/L。Zhou等[37]用嘧啶衍生物對4位亞甲氨基進行結(jié)構(gòu)修飾，得到了化合物Mocetinostat（MGCD0103，9），現(xiàn)在正在進行Ⅰ、Ⅱ臨床試驗，主要用于治療急性髓細胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤。未保留4位亞甲氨基結(jié)構(gòu)進行的一些結(jié)構(gòu)修飾，如化合物25、26及27（表3），其IC50均在nmol/L級別。

Moradei等[38]用計算機輔助藥物設(shè)計的方法，將MS-275分子與HDAC1的催化活性中心進行對接，發(fā)現(xiàn)B環(huán)NH2的對位方向有一個疏水性空腔，于是在MS-275的B環(huán)NH2的對位引入了噻吩基團得到化合物28（表3），活性提高了將近27倍，但是鄰間位取代活性則下降。

2.3 環(huán)肽類

環(huán)肽類化合物是HDACIs中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、最具成藥潛力的一類化合物，對HDACs抑制活性較強，作用方式與異羥肟酸類HDACIs一致。其基本結(jié)構(gòu)是疏水氨基酸構(gòu)成的12元環(huán)，是親脂性的帽子結(jié)構(gòu)；非天然氨基酸的側(cè)鏈構(gòu)成了連接部分；與Zn2+結(jié)合區(qū)域是一些環(huán)氧酮類或者異羥肟酸片段。目前存在的環(huán)肽類HDACIs，根據(jù)結(jié)構(gòu)組成可以分為含硫抑制劑、含L-Aoe的抑制劑及其他類抑制劑。

含硫的環(huán)肽類HDACIs多為前藥，分子中的二硫鍵或硫酯鍵在體內(nèi)降解生成硫醇，與HDACs活性位點的Zn2+螯合而發(fā)揮作用，例如Romidepsin（FK-228，10）、FR901375（29）、Largazole（30）（圖4）。其中Romidepsin對HDAC1的IC50為0.2 nmol/L，已獲得美國FDA批準上市，主治復(fù)發(fā)或頑固性CTCL及外周T-細胞淋巴瘤。Taori等[39]從海燕藍藻中分離得到十六元環(huán)肽內(nèi)酯類化合物Largazole（圖4），其對HDACs的抑制活性在nmol/L級別。其乙酰化衍生物與Largazole具有同等程度的抑制活性。Ying等[40]和Nasveschuk等[41]均已經(jīng)完成了Largazole的全部合成工作。

含有L-Aoe的環(huán)肽類HDACIs大都從具有抗寄生蟲或抗增殖作用的天然產(chǎn)物中篩選獲得，是HDACs的不可逆抑制劑，其功能基團為（2S）-2-氨基-9、10-環(huán)氧-8-氧代癸酸（L-Aoe），所以叫做L-Aoe類抑制劑，例如化合物31～37（表4）。

還有一些其他類型的環(huán)肽類HDACIs，也具有很好的開發(fā)價值。例如Apicidin（38）[42]，對HDAC1和HDAC8的IC50分別為2 nmol/L和>1000 nmol/L，對包括胃癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌在內(nèi)的多種人類腫瘤細胞均有較好的抗增殖活性。

2.4 羧酸類

羧酸類的HDACIs對HDACs抑制活性較弱，為mmol/L級別，其與Zn2+結(jié)合區(qū)域是一個羧基集團。雖然表面識別區(qū)對HDACs抑制活性較為重要，但是目前研究開發(fā)的羧酸類HDACIs仍然是簡單的烷基鏈。丁酸是結(jié)腸中的微生物代謝的副產(chǎn)物，mmol/L級別的丁酸選擇地抑制腫瘤細胞生長的G1期，從而抑制腫瘤細胞增殖，并且不影響正常細胞結(jié)構(gòu)和功能。羧酸類HDACIs作為抗腫瘤藥物，其毒性較低，但首過效應(yīng)強、半衰期短，所需劑量大。其抑制活性低，可能是由于其僅僅具有HDACs抑制活性，而促進細胞分化能力較低的緣故[43]。其常與其他藥物聯(lián)合使用，如丁酸鈉和抗脂肪酸合成酶激動劑抗體聯(lián)合用藥，能起到協(xié)同誘導(dǎo)作用；苯基丁酸（39）（圖5）和全反維甲酸（ATRA）聯(lián)合用藥治療前髓細胞白血病[44]。因此，羧酸類化合物生物利用度低，多將羧基制成酯基，做成前藥，吸收、代謝更好。

Phenylbutyric acid（39）

圖5 苯基丁酸的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)語

HDACs是人體內(nèi)一類重要的金屬蛋白酶，其參與了細胞周期調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用。目前已經(jīng)合成了結(jié)構(gòu)豐富的HDACIs，SAHA、FK228及Belinostat已成功被FDA批準上市；Largazole、Panobinostat、Entinostat等許多化合物已經(jīng)進入臨床前或臨床研究階段。隨著對腫瘤發(fā)生機制及HDACIs構(gòu)效關(guān)系地深入研究，HDACIs的設(shè)計開發(fā)將對腫瘤的治療產(chǎn)生重要意義。

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篇7

【關(guān)鍵詞】 胃腫瘤;乙酰肝素酶;基質(zhì)金屬蛋白酶9;免疫組織化學(xué)

[ABSTRACT] Objective:To investigate the clinicopathological significance of the expression of heparanase (Hpa) and MMP9， and its relationship to progressing in gastric carcinoma. Methods： The expression of Hpa and MMP9 were detected by immunohistochemistry SABC in 65 gastric carcinoma cases and 20 adjacent nonneoplastic tissues. The positive ratios of Hpa and MMP9 were compared in gastric carcinoma tissues and adjacent nonneoplastic tissues as well as perse deep infiltration tissues with or without lymph node metastasis. The correlation analysis of Hpa and MMP9 expression in gastric carcinoma tissue was assessed. Results：The positive ratios of Hpa and MMP9 were significant higher in gastric carcinoma tissue than that in adjacent nonneoplastic tissue(P

[KEY WORDS] Gastric carcinoma; Heparanase; Matrix metalloproteinase 9; Immunohistochemistry

腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程。乙酰肝素酶(Hpa)是目前已確定的唯一能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因(HSPG)的蛋白酶， 通過特異性降解HSPG發(fā)揮其促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用;基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)是一種鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，主要降解細胞外基質(zhì)和基底膜中的膠原蛋白，在破壞細胞外基質(zhì)和基底膜的屏障作用、促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中同樣具有作用。Hpa mRNA的檢測在多種腫瘤中已有研究報道，但目前聯(lián)合檢測Hpa和MMP9在胃癌中的表達少有報道，本實驗對65例胃癌切除標本Hpa和MMP9的表達進行了檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取河源市人民醫(yī)院2003～2005年胃癌手術(shù)切除標本65例，男性47例，女性18例，年齡35～78歲，中位年齡60歲，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例。所有病例術(shù)后均經(jīng)病理證實。另取癌旁非瘤組織20例作為對照，癌旁組織距離腫瘤邊緣不小于5 cm。

1.2 Hpa、MMP9的檢測

采用免疫組化SABC法進行檢測。Hpa抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購于武漢博士得生物工程有限公司;兔抗人MMP9多克隆抗體為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，均在4℃冰箱保存。用已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標準

1.3.1 Hpa Hpa以細胞膜和/或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標準，以染色強度和陽性細胞比例評定陽性表達。參照Friedmann等[1]的方法，每張切片隨機觀察5個視野，每個視野觀察100個腫瘤細胞，計數(shù)500個腫瘤細胞中陽性染色的細胞數(shù)，陽性細胞記數(shù)僅限于腫瘤細胞染色。染色強度分級如下：無著色為0，淡黃色為1，黃色及更深顏色為2;陽性細胞數(shù)分級為:陽性細胞數(shù)小于50%為0， 50%～75%為1，>75%為2。染色強度分級與陽性細胞數(shù)分級兩項得分相乘結(jié)果≥2為陽性表達。

1.3.2 MMP9 MMP9以細胞漿和/或細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標準，參照Liaball等[2]的方法，每張切片隨機觀察5個視野，每個視野觀察100個腫瘤細胞，計數(shù)500個腫瘤細胞中陽性染色的細胞數(shù)，陽性細胞計數(shù)僅限于腫瘤細胞染色，10%及以上細胞陽性染色的切片為陽性，10%以下陽性染色的切片為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，行χ2檢驗或精確概率法及Spearman相關(guān)性檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hpa的表達

Hpa蛋白陽性表達主要位于細胞漿和/或細胞膜，腫瘤間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和淋巴細胞也偶有陽性表達，胃癌中Hpa的陽性表達率為60%(39/65);在癌旁非瘤組織中，血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和淋巴細胞偶有陽性表達， Hpa的陽性表達率為15%(3/20)，胃癌中的表達明顯高于癌旁非瘤組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.390，P

2.2 MMP9的表達

MMP9在正常胃黏膜細胞中著色均勻，主要分布于細胞胞漿內(nèi)，陽性表達率為15%(3/20);在胃癌組織中的表達異質(zhì)明顯，呈灶狀或彌散性分布，陽性表達率為55.4%(36/65)，胃癌中的表達明顯高于癌旁非瘤組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.046，P

2.3 不同腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移胃癌患者Hpa、MMP9的表達

腫瘤浸潤深度達到或超過漿膜層的胃癌患者Hpa、MMP9的陽性表達率明顯高于未達漿膜層者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

2.4 Hpa、MMP9在胃癌中陽性表達的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性檢驗，Hpa、MMP9在胃癌組織中的表達呈正相關(guān)(rs=0.531，P=0.000)，見表2。表2 Hpa、MMP9在胃癌中表達的相關(guān)性

3 討論

腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)成分及其基底膜的降解是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是人體內(nèi)降解ECM的主要酶類，參與腫瘤演進等眾多生理和病理過程[3，4]，MMP9作為MMPs家庭重要成員，具有廣泛的酶底物特性，是降解基底膜成分IV型膠原的主要酶[5]。Sier等[6]的研究結(jié)果顯示胃癌組織MMP9表達顯著高于臨近的正常胃粘膜，MMP9高表達的胃癌患者生存期明顯縮短;David等[7]研究表明，與正常胃粘膜相比，胃癌組織MMPs表達明顯升高，MMPs表達與胃癌分期密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者MMP9陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說明MMP9在胃癌細胞突破基底膜向周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用; MMP9的表達還與胃癌的浸潤深度密切相關(guān)(P

Hpa是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠降解細胞外基質(zhì)和基底膜中主要成分HSPG的蛋白水解酶，其在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的意義。 Vlodavsky等[9]研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細胞Hpa活性比低或無轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細胞高4～10倍。在卵巢腺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞、口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌以及前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌中Hpa mRNA和蛋白呈優(yōu)勢表達。Hulett等[10]也發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移的鼠腺癌細胞系表達高水平Hpa mRNA，而低轉(zhuǎn)移細胞系僅有少量表達。Takaoka等[11]用RTPCR檢測胃癌組織中Hpa的表達發(fā)現(xiàn)，正常胃粘膜組織中無Hpa的表達，胃癌組織中Hpa的表達與腫瘤體積和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯正相關(guān)性，高表達Hpa的患者預(yù)后差。本研究結(jié)果顯示，Hpa的陽性表達與胃癌的浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明在胃癌的進展過程中，Hpa具有重要的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，Hpa和MMP9在胃癌細胞上的表達呈正相關(guān)，推測Hpa和MMP9在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中存在相互關(guān)聯(lián)、相互作用，聯(lián)合檢測Hpa和MMP9在判斷腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后方面具有重要意義。

參考文獻

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篇8

【關(guān)鍵詞】 川芎嗪注射液; 腹膜間皮細胞; 高糖; ⅰ型膠原; 基質(zhì)金屬蛋白酶?1; 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑?1; 體外實驗

zhu gs, he js. j chin integr med. 2009; 7(1): 65?69.

received june 18, 2008; accepted july 22, 2008; published online january 15, 2009.

indexed/abstracted in and full text link?out at pubmed. journal title in pubmed: zhong xi yi jie he xue bao.

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doi: 10.3736/jcim20090110open access

effects of ligustrazine injection on high glucose?induced type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase?1 and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 expressions in human peritoneal mesothelial cells in vitro

gui?song zhu, jin?song he

department of nephrology, the affiliated drum tower hospital, nanjing university medical school, nanjing, jiangsu province 210008, china

objective: to investigate the effects of ligustrazine injection on type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase?1 (mmp?1) and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 (timp?1) expressions in human peritoneal mesothelial cells (hpmcs) cultured in high glucose conditions.

methods: hpmcs were isolated from human omenta by trypsin digestion method and subcultured. then, the hpmcs were divided into normal control group, high glucose group and high glucose plus low?, medium? and high?dose ligustrazine (10, 20 and 40 mg/l ligustrazine respectively) groups. semi?quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction was used to detect the expressions of type ⅰ collagen, mmp?1 and timp?1 mrnas in hpmcs. proteins of type ⅰ collagen, mmp?1 and timp?1 in culture supernatants were measured by enzyme?linked immunosorbent assay (elisa). cell protein concentration was measured by trace bicinchoninic acid method to correct the elisa assay results.

results: ligustrazine injection could significantly decrease high glucose?induced type ⅰ collagen and timp?1 expressions in a dose?dependent manner both in protein and gene levels (p<0.05, p<0.01). in addition, medium? and high?dose ligustrazine injection could significantly increase mmp?1 expression which was inhibited by high glucose concentrations (p<0.05).

conclusion: ligustrazine injection does not only decrease type ⅰ collagen synthesis, but also promote its degradation by modulating unbalanced mmp?1/timp?1 expression in hpmcs cultured in high glucose conditions.

keywords: ligustrazine injection; human peritoneal mesothelial cells; high glucose; type ⅰ collagen; matrix metalloproteinase?1; tissue inhibitor of metalloproteinase?1; in vitro

腹膜纖維化是腹膜透析治療的主要并發(fā)癥，最終導(dǎo)致腹膜功能衰竭，這是腹膜透析患者退出治療的主要原因［1］。腹膜纖維化以細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ecm）的過度沉積為特點［2］。研究表明，ecm的過度沉積是由于ecm合成與降解失衡而引起［3］。ⅰ型膠原是腹膜纖維化中主要的ecm［4］，其降解過程受基質(zhì)金屬蛋白酶?1（matrix metalloproteinase?1, mmp?1）及其特異性抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑?1（tissue inhibitor of metalloproteinase?1, timp?1）調(diào)控［5］。有研究證實，高糖能上調(diào)腹膜間皮細胞（human peritoneal mesothelial cells, hpmcs）ⅰ型膠原和timp?1的表達，降低mmp?1活性［3］。本研究通過觀察川芎嗪注射液對高糖刺激下hpmcs ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1表達的影響，探討川芎嗪在防治腹膜纖維化中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和主要儀器 川芎嗪注射液（江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司，批準號為國藥準字h20020630）；50％葡萄糖注射液（江蘇方強制藥廠，批號為200710111）。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution, pbs）、胎牛血清（fetal calf serum, fcs）、trizol和rpmi?1640粉劑等（gibco公司）；胰蛋白酶和瓊脂糖粉等（promega公司）；ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme?linked immunosorbent assay, elisa）試劑盒（adl公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, bca）蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；ⅰ型膠原、mmp?1、timp?1和β?actin引物，m?mlv第一鏈cdna合成試劑盒和taq酶等（invitrogen公司）；抗細胞角蛋白抗體、抗細胞波形蛋白抗體、第ⅷ因子抗體和抗白細胞cd45抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）。nu?2500e二氧化碳培養(yǎng)箱（nuaire公司）；全自動酶標儀（biobank公司）；生物電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hpmcs的培養(yǎng)與鑒定 取來自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院普外科擇期腹部手術(shù)患者（排除尿毒癥、腹膜炎）捐獻的大網(wǎng)膜組織，按文獻［3］方法原代培養(yǎng)hpmcs，按1?3傳代，第3代細胞用于實驗，每次實驗均由來自3個患者的標本進行3次獨立實驗。倒置相差顯微鏡觀察hpmcs呈多邊形，似鋪路鵝卵石樣外觀；免疫組化鑒定抗細胞角蛋白抗體和抗波形蛋白抗體染色陽性，抗第ⅷ因子抗體和抗白細胞cd45抗體染色陰性。

1.2.2 實驗步驟和分組 hpmcs用含1％fcs的rpmi?1640培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h后分為5組（每組設(shè)3個樣本）：正常組（完全培養(yǎng)液）、高糖對照組（2.5％葡萄糖）和高糖（2.5％葡萄糖）加低、中、高劑量川芎嗪（10、20和40 mg/l）組。各組完全培養(yǎng)液均為含有15％ fcs的rpmi?1640培養(yǎng)液。細胞置于37 ℃、5％ co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.2.3 elisa法檢測細胞上清液中ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1含量 分組干預(yù)48 h后，離心收集上清液，按elisa試劑盒說明書檢測ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1表達水平。用0.1 mol/l naoh溶解細胞沉淀，bca蛋白檢測試劑盒測定細胞沉淀中蛋白質(zhì)濃度，用相應(yīng)蛋白質(zhì)濃度結(jié)果校正檢測結(jié)果。

1.2.4 半定量rt?pcr 分組處理同上。采用trizol一步法提取總rna，2 μg總rna進行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，50 μl反應(yīng)體系進行pcr擴增，以β?actin作內(nèi)參照（引物序列及反應(yīng)條件見表1）。1.5％瓊脂糖凝膠電泳（110 v，15 min）進行pcr產(chǎn)物鑒定，電泳圖像分析儀掃描分析，mrna相對含量用其pcr產(chǎn)物吸光值（absorance, a）與β?actin a值的比值表示。引物及pcr反應(yīng)條件見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，采用spss 15.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用lsd?t檢驗。檢驗水準α=0.05。 表1 ⅰ型膠原、mmp?1、timp?1和β?actin引物序列及pcr反應(yīng)條件

2 結(jié) 果

2.1 上清液中ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1蛋白質(zhì)水平 與正常組比較，高糖對照組上清液中ⅰ型膠原和timp?1含量顯著升高（p<0.01），mmp?1含量顯著下降（p<0.01）；與高糖對照組比較，低、中和高劑量川芎嗪組上清液中的ⅰ型膠原和timp?1含量顯著降低（p<0.05, p<0.01），且兩者均呈量效關(guān)系，中、高劑量川芎嗪組上清液mmp?1含量顯著增加（p<0.01）。見表2。表2 各組上清液中ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1蛋白質(zhì)表達

2.2 hpmcsⅰ型膠原、mmp?1和timp?1 mrna的表達 與正常組比較，高糖對照組hpmcs ⅰ型膠原/β?actin mrna和timp?1/β?actin mrna分別上升（15.43±0.83）倍和（4.19±0.09）倍（p<0.01），mmp?1/β?actin mrna下降（86.9±0.44）%（p<0.01）；與高糖對照組相比，低、中、高劑量川芎嗪組ⅰ型膠原/β?actin mrna和timp?1/β?actin mrna表達水平均顯著下調(diào)（p<0.05），兩者均呈量效關(guān)系，中、高劑量川芎嗪組mmp?1/β?actin mrna表達顯著增加（p<0.05）。見圖1和圖2。

3 討 論

高糖透析液導(dǎo)致ecm過度沉積是腹膜纖維化的病理基礎(chǔ)［2］，研究表明，高糖不僅增加hpmcsⅰ型膠原的表達，并且引起ⅰ型膠原降解酶系mmp?1/timp?1的表達失衡［3］。我們的研究結(jié)果與之基本相同，此外我們發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能顯著對抗高糖的上述作用。

在生理條件下，hpmcs可以產(chǎn)生一定量的ecm和mmps/timps［3, 6］。mmps是降解ecm的蛋白水解酶系，幾乎能降解全部ecm成分。timps是內(nèi)源性分泌蛋白，作為mmps的特異性抑制因子，其n'端可與相應(yīng)的mmps催化活性中心的鋅離子結(jié)合而抑制其催化活性［7］。本實驗通過研究川芎嗪對hpmcs在高糖刺激下主要ecm ⅰ型膠原及其降解酶系mmp?1/timp?1分泌及表達的影響，旨在探討川芎嗪對hpmcs在高糖環(huán)境下ⅰ型膠原的合成和降解的干預(yù)作用及其機制。結(jié)果顯示，川芎嗪能顯著降低高糖所致的ⅰ型膠原的過度合成，同時顯著下調(diào)timp?1的表達，增加mmp?1的表達，提示川芎嗪亦能通過調(diào)節(jié)mmp?1/timp?1的平衡，從而促進ⅰ型膠原的降解，減少ecm沉積。由此我們推測，川芎嗪可能具有預(yù)防或延緩腹膜纖維化的作用。

川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一，屬酰胺類生物堿，具有活血化瘀的功效。藥理實驗證明，川芎嗪具有擴張血管、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫和鈣離子拮抗的作用［8］。目前川芎嗪抑制ⅰ型膠原、timp?1和增加mmp?1表達的機制尚不清楚。以往的研究發(fā)現(xiàn)這可能與抑制轉(zhuǎn)化細胞生長因子β1（transforming growth factor?β1, tgf?β1）表達有關(guān)［9, 10］。tgf?β1是重要的致纖維化細胞因子，參與了腹膜纖維化的病理過程［2］。tgf?β1可增加ⅰ型膠原的合成，并且抑制mmps的活性而激活timps，使ⅰ型膠原降解減少［3, 11］。有研究報道，川芎嗪能降低多種細胞如心肌細胞、肝細胞和血管內(nèi)皮細胞的膠原合成和timp?1表達，而增加mmp?1的分泌和表達，進一步的研究發(fā)現(xiàn)這可能是通過抑制tgf?β/smads信號傳導(dǎo)通路繼而抑制tgf?β1表達的結(jié)果［9, 10, 12］。我們前期研究證實，川芎嗪能下調(diào)高糖致hpmcs tgf?β1的表達（文章待發(fā)表）。因此我們推測，川芎嗪抑制tgf?β1的表達可能是其抑制hpmcs ⅰ型膠原合成和調(diào)整mmp?1/timp?1表達平衡的機制之一，其具體機制將是我們下一步要研究的內(nèi)容。

綜上所述，川芎嗪能抑制高糖致hpmcs ⅰ型膠原的過度合成，并且通過調(diào)節(jié)mmp?1/timp?1的平衡，促進ⅰ型膠原降解，從而減少ecm的沉積，防止腹膜纖維化的發(fā)生和發(fā)展。因此，川芎嗪可能具有預(yù)防或延緩腹膜纖維化的作用，這對腹膜纖維化的機制及其防治的研究有一定借鑒和應(yīng)用價值。

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篇9

【摘要】

本研究旨在探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑－SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）誘導(dǎo)人急性髓性白血病細胞株HL60凋亡的分子機制。采用MTT法，瑞氏姬姆薩染色和Hoechst33342／PI熒光染色方法，檢測SAHA對HL60細胞生長的抑制作用及細胞的形態(tài)變化；通過流式細胞術(shù)、Westernblot方法測定HL60細胞的周期變化以及多種信號蛋白的表達。結(jié)果表明：SAHA可以呈劑量時間依賴性抑制HL60細胞的生長；經(jīng)2 μmol/L SAHA處理12-48小時，HL60細胞顯示細胞周期被阻滯于G0/G1期；經(jīng)Hoechst33342熒光染色后細胞核出現(xiàn)明顯的凋亡小體結(jié)構(gòu)；Western blot檢測證實，SAHA作用HL60細胞后caspase 3被激活，其底物蛋白聚ADP核糖聚合酶［poly(ADPribose) polymerase， PARP］發(fā)生剪切，細胞發(fā)生凋亡；對細胞凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路P44/42 MAPK及PI3K/Akt檢測結(jié)果表明，涉及MAPK信號通路的Raf及ERK激酶磷酸化受到明顯抑制，而Akt及其下游mTOR激酶的活性沒有明顯改變。結(jié)論：SAHA對HL60細胞的殺傷作用主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)，與細胞增殖相關(guān)的P44/42 MAPK信號通路被阻斷是細胞凋亡發(fā)生的機制之一。

【關(guān)鍵詞】 組蛋白去乙酰化酶抑制劑；SAHA； MAPK； 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；細胞凋亡；HL60細胞

Histone Deacetylase Inhibitor SAHA Induces Inactivation of MAPK Signaling and Apoptosis in HL60 Cells

Abstract

The study was aimed to investigate the molecular mechanisms of histone deacetylase inhibitor SAHAinduced apoptosis of acute myeloid leukemia cell line HL60. The effect of SAHA on HL60 cell proliferation was detected by MTT assay and the cell morphological changes were observed with WrightGiemsa and Hoechst33342 staining. The cell cycle distribution was determined by flow cytometry and the expression of cell signaling proteins were detected by Westernblot analysis. The results showed that SAHA inhibited the proliferation of HL60 cells in dose and timedependent manners，after 2 μmol/L SAHA exposure for 12-48 hours， the cell cycle was arrested at G0/G1 phase and apoptotic cell death was confirmed by either defined apoptotic bodies stained by Hoechst33342， Western blot showed cleavedPARP， which represents the activation of caspase 3. The Western blot analysis indicated the activation of two important survival signal pathways after SAHA treatment， the phosphorylation of Raf and its downstream ERK kinases were remarkable downregulated， whereas the phosphorylation of AKT and its downstream molecular mTOR were not changed. It is concluded that SAHAinduced apoptosis of HL60 cells is mediated by inactivation of p44/42 MAPK signaling pathway.

Key words

HDAC inhibitor; SAHA; MAPK; signal transduction；apoptosis; HL60 cell

SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）是繼HMBA(hexamethylenebisacetamide)之后的第二代羥肟酸類的組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histon deacetylase inhibitor， HDACi）。與HMBA相比，它誘導(dǎo)鼠紅白血病(murine erythroleukemia， MEL)細胞分化的活性是HMBA的2 000倍，并且在微摩爾(μmol/L)水平即可達到如此高的活性［1］。已知組蛋白的乙酰化狀態(tài)可以影響基因的表達，當組蛋白處于乙酰化狀態(tài)時，由組蛋白與DNA雙鏈構(gòu)成的核小體結(jié)構(gòu)變得更為開放，有利于各種轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，啟動基因的表達。而當組蛋白處于低乙酰化狀態(tài)時， 可出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制， 并介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，因此HDACi已經(jīng)成為一類新型的抗腫瘤制劑。目前，SAHA已經(jīng)在美國進入Ⅱ期臨床試驗。研究表明，SAHA可以選擇性誘導(dǎo)細胞周期負調(diào)控子p21的表達，從而阻滯細胞周期［2］，同時可以誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的分化和凋亡，但其誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制還不十分清楚。本研究采用HL60細胞為研究模型，探討SAHA誘導(dǎo)其凋亡的分子機制。

材料和方法

細胞系及培養(yǎng)條件

急性髓性白血病細胞HL60為本室凍存保存株，用含10％滅活胎牛血清及青霉素、鏈霉素（各100 U／ml）、NaHCO3 (2 g/L)、HEPES (2.4 g/L) 的RPMI 1640 (Gibco BRL)培養(yǎng)液，置于37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期換液傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

試劑

SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）由英國阿斯利康公司提供。MTT（methyl thiazolyl tetrazolium）購自Sigma公司，500 mg粉末溶于100 ml PBS中，過濾分裝，-20℃避光保存。抗體acetyleH3、PARP、pAkt、Akt、pmTOR、mTOR、pRaf、pErk、Erk均購自Cell Signaling Technology公司。抗CDK4、Raf1抗體購自Becton Dickinson PharMingen公司。抗p21抗體購自SantaCruz Biotechnology公司。抗βactin抗體購自O(shè)ncogene公司。ECL試劑，BCA試劑盒購自PIERCE Biotechnology公司，Laemmli sample buffer 購自BioRad公司。

細胞生長曲線測定

采用臺盼藍排斥實驗。將對數(shù)生長期HL60細胞以2×104／ml濃度接種于6孔板，設(shè)正常對照組及SAHA終濃度為1 μmol/L和2 μmol/L的處理組；于藥物作用細胞后1-5天分別取細胞，用0.4%胎盤蘭溶液混勻，3分鐘內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞數(shù)，并計算細胞存活率。

細胞存活率＝［活細胞數(shù)／（活細胞數(shù)＋死細胞數(shù)）］×100％

細胞存活率測定

采用MTT法，通過酶聯(lián)儀測量細胞的OD值檢測細胞對藥物的敏感性。取對數(shù)生長期HL60細胞以2×104／ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl細胞懸液。SAHA處理濃度分別為0.5、1、2、3、5 μmol/L。每一個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔，分別處理12、24和48小時。每個時相點結(jié)束后加0.5% MTT（每孔20 μl），4小時后加入細胞裂解液（每孔100 μl），置培養(yǎng)箱過夜。次日在酶聯(lián)儀上調(diào)節(jié)到540 nm波長，以空白對照孔調(diào)零，讀取各孔OD值。試驗重復(fù)3次。按下列公式計算細胞生存率。

細胞存活率＝（加藥組細胞OD平均值／

正常細胞OD平均值）×100％

細胞形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)生長期HL60細胞，以2×104／ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，加SAHA（2 μmol/L）處理24和48小時。細胞經(jīng)藥物處理后，離心棄培養(yǎng)液，加入PBS混勻。吸取少量細胞懸液（5×104／ml）進行細胞甩片，甲醇固定10分鐘后，進行瑞氏姬姆薩染色，在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化。細胞經(jīng)Hoechst33342染色，用熒光顯微鏡觀察細胞是否出現(xiàn)凋亡小體。

細胞周期分析

取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，經(jīng)SAHA（2 μmol/L）處理12、24、48小時后，1 500 ×g離心10分鐘，收集細胞。用PBS洗沉淀，離心，收集于1.5 ml EP管中。然后以70％的冷乙醇（含1％FCS的PBS配制）固定過夜，-20℃冰箱保存。次日常溫下1 500 ×g離心10分鐘后，以PBS洗細胞沉淀。以含RNase A（終濃度200 μg/ml）的PBS 0.5 ml重懸細胞沉淀，37℃水浴30分鐘。離心去掉RNA酶。向試管內(nèi)加入PI染液(終濃度為100 μg/ml，貯存液為10 mg/ml)，室溫下避光反應(yīng)1小時后，上流式細胞儀檢測。

蛋白表達的Westernblot檢測

將SAHA（2 μmol/L）處理12、24、48小時的HL60細胞10 000 ×g離心5分鐘收集起來，加入Laemmli sample buffer（100 μl/1×106個細胞）裂解細胞。置熱混勻儀上99℃加熱8分鐘，冰水浴冷卻。然后4℃、10 000 ×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清至另一無菌EP管內(nèi)，取適量樣品應(yīng)用BCA試劑盒測量蛋白濃度（具體步驟見試劑說明書）。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠，上樣前加入5％β巰基乙醇，每個樣品上樣50 μg蛋白。80 V電壓電泳2小時，至溴酚藍到達凝膠底部。轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，80 V電壓電泳2小時。將膜置5%脫脂牛奶室溫封閉1-2小時，TBS+Tween洗膜3×5分鐘。加入5%脫脂牛奶或5％BSA稀釋的一抗封閉膜，置4℃搖床過夜。洗膜后再分別與相應(yīng)的二抗（5%脫脂牛奶稀釋）室溫孵育1小時，洗膜3次。將等體積混合的ECL化學(xué)發(fā)光底物A、B液均勻加在PVDF膜上，顯色5分鐘，X光片曝光3分鐘后，將X光片依次進行顯影和定影。βactin作為內(nèi)參對照。

統(tǒng)計學(xué)分析

利用SAS 6.0軟件對細胞生長抑制實驗進行具有一個重復(fù)測量的二因素析因設(shè)計方差分析。

結(jié)

果

SAHA對HL60細胞生長的抑制作用

與未經(jīng)藥物處理的正常對照組相比較，HL60細胞經(jīng)過不同濃度的SAHA處理后，細胞增殖受到明顯抑制（圖1）。藥物敏感性實驗顯示，SAHA對細胞的殺傷作用具有時間和劑量依賴性(圖2)。SAHA 2 μmol/L作用48小時后對細胞已經(jīng)達到60％的殺傷效果，故在后續(xù)的實驗中僅采用2 μmol/L的藥物濃度。

SAHA阻斷HL60細胞周期并誘導(dǎo)細胞凋亡

流式細胞儀測定結(jié)果顯示，SAHA作用細胞后12小時 細胞周期明顯被阻滯于G0／G1期，表現(xiàn)為G0／G1期細胞比率由對照組的38%增加至85%， 伴有S期細胞數(shù)目明顯降低。這一結(jié)果與SAHA對細胞增殖的抑制作用相一致。SAHA作用48小時，細胞出現(xiàn)subG1峰，提示HL60細胞出現(xiàn)凋亡（圖4）。Western blot結(jié)果顯示，SAHA可明顯上調(diào)細胞周期檢測點的主要負調(diào)控因子P21的水平，同時降低CDK4的表達水平（圖4），這些分子改變表明細胞周期在G1期的進程受到影響。聚ADP核糖聚合酶（PARP）是caspase 3的底物蛋白，在caspase 3活化的過程中會受到切割，被剪切后的PARP可以作為細胞凋亡的分子標志。圖4顯示，在SAHA作用48小時后出現(xiàn)PARP剪切后的條帶，證實HL60細胞內(nèi)caspase 3被激活，細胞發(fā)生凋亡。

SAHA對HL60細胞組蛋白H3乙酰化的影響

SAHA屬于廣譜型組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，細胞經(jīng)SAHA處理后，作為HDAC1和HDAC2底物的組蛋白H3的乙酰化明顯增強，在藥物作用12小時時最為明顯，這說明SAHA對HDAC具有明顯的抑制作用(圖5)。

SAHA對HL60細胞信號蛋白表達的影響

為探討SAHA誘導(dǎo)HL60細胞凋亡的分子機制，我們采用Western blot方法，對細胞內(nèi)兩條重要的細胞存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化狀態(tài)進行了測定。結(jié)果表明，SAHA對細胞內(nèi)Akt激酶及其下游的mTOR蛋白磷酸化沒有影響，提示HL60細胞經(jīng)SAHA處理后，PI3K/AKT生存信號通路并沒有受到影響。但細胞內(nèi)另一條重要的信號通路Ras/Raf/Mek/Erk（p44/42 MAPK）被阻斷，表現(xiàn)為Raf激酶及Erk激酶的磷酸化受到顯著抑制 （圖 6） 。 細胞內(nèi) p44/42

Figure 6. Effects of SAHA on various cell signal proteins of HL60 cells. The levels of βactin served as the loading control.MAPK信號通路在藥物作用后24小時即出現(xiàn)活性降低，至用藥后48小時，激酶活性出現(xiàn)明顯降低，同期出現(xiàn)細胞凋亡，提示p44/42 MAPK信號通路阻斷在介導(dǎo)細胞凋亡中起重要的作用。

討

論

真核生物染色質(zhì)的基本單位是核小體，由核心組蛋白（H2A，H2B，H3，H4），H1及DNA組成。核心組蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表達過程中的重要調(diào)控方式之一。組蛋白的高度乙酰化是轉(zhuǎn)錄活躍的一個標志，而低乙酰化與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。組蛋白的乙酰化多發(fā)生在組蛋白的N端堿性氨基酸定賴氨酸殘基上。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到賴氨酸的氨基端，中和組蛋白所帶的正電荷，從而減弱DNA和組蛋白的相互作用，使轉(zhuǎn)錄因子易與DNA結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)則可以移去氨基端的乙酰基，增強DNA和組蛋白的相互作用，從而抑制轉(zhuǎn)錄。HAT和HDAC兩者之間的動態(tài)平衡調(diào)節(jié)著組蛋白的乙酰化水平［3］。組蛋白乙酰化水平的異常在白血病細胞的發(fā)展，增殖和分化中起著很重要的作用［4］。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）是一類新型的抗腫瘤藥物。通過抑制HDAC的活性，誘導(dǎo)靶細胞中組蛋白高度乙酰化，由于乙酰化修飾可以改變組蛋白與DNA鏈間的結(jié)合狀態(tài)，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA鏈的結(jié)合，啟動某些特異性基因的表達，從而達到阻斷腫瘤細胞的生長［5］。實驗表明，HDACi可以在體外有效抑制腫瘤細胞的增殖，在體內(nèi)可以抑制實體瘤的生長，并能有效抑制腫瘤血管的形成。更為重要的是，它能特異性殺傷腫瘤細胞，并對正常細胞影響較小［6，7］。

本研究采用SAHA處理人HL60白血病細胞。結(jié)果表明，SAHA可抑制細胞的生長，阻斷細胞周期于G0/G1期，并誘導(dǎo)細胞凋亡。SAHA對細胞周期的調(diào)節(jié)表現(xiàn)在它可以增強CDK抑制因子P21蛋白的表達。本實驗中觀察到SAHA作用12小時后P21蛋白的表達即明顯增強。增強的P21蛋白表達可以通過抑制cdc2和CDK從而阻斷細胞周期在G1期［8］。本實驗中也檢測到SAHA在增強P21蛋白表達的同時降低CDK4的水平使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。近年來，有試驗表明P21蛋白同樣在細胞的分化和凋亡中發(fā)揮作用。如：經(jīng)細胞分化誘導(dǎo)劑phorbol或bryostatin1處理白血病細胞，或者加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理，再加入CDK的抑制劑flavopiridol后，發(fā)現(xiàn)flavopiridol會促進細胞發(fā)生凋亡［9，11］。HDACi誘導(dǎo)P21的表達增強，表明CDK抑制因子在HDACi介導(dǎo)的細胞凋亡中同樣發(fā)揮著重要的作用。

細胞外信號調(diào)控細胞生長是通過激活細胞內(nèi)不同的信號傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)的。PI3K/AKT生存信號通路具有抗凋亡作用，此信號通路的調(diào)節(jié)紊亂會導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。在本實驗中AKT及其下游信號分子mTOR的表達均沒有明顯改變，表明SAHA處理細胞后并沒有影響到此信號通路。MAPK通路是典型的細胞生長調(diào)控信號途徑，目前發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有3種家族成員：JNK，P38，ERK1/2。其中Ras/Raf/MEK/ERK通路與腫瘤細胞增殖的關(guān)系最為密切，此信號通路被激活后，ERK1/2被磷酸化，轉(zhuǎn)位至細胞核，作用于轉(zhuǎn)錄因子（如NFΚb， cmyc等），調(diào)控基因的表達，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)［12，13］。經(jīng)SAHA處理細胞后，Raf1和Erk蛋白的磷酸化呈時間依賴性降低，提示SAHA對HL60細胞凋亡的誘導(dǎo)是通過阻斷Ras/Raf/MEK/ERK（P44/42 MAPK）信號通路而實現(xiàn)的，而與PI3K/AKT通路并無關(guān)聯(lián)。

近年來有研究表明，HDACi不僅可以使組蛋白發(fā)生乙酰化，而且還能夠誘導(dǎo)細胞內(nèi)的非組蛋白發(fā)生乙酰化修飾［14］。2002年， Yu等［15］首次發(fā)現(xiàn)HDACi可以乙酰化修飾胞內(nèi)的熱休克蛋白90(HSP90)，從而影響其分子伴侶的功能，導(dǎo)致其多種靶蛋白通過泛素蛋白酶體途徑降解，進而介導(dǎo)細胞凋亡。最新的研究表明，慢性髓性白血病細胞K562經(jīng)HDACi（LAQ824，LBH589）處理后，細胞內(nèi)HSP90發(fā)生明顯的乙酰化修飾，從而影響了其與靶蛋白BCR/ABL的結(jié)合，并介導(dǎo)信號通路中Raf1和Akt的表達下調(diào)，進而誘導(dǎo)細胞凋亡［16］。在本實驗中，HSP90的底物蛋白Raf1及CDK4蛋白表達降低，提示SAHA可能對HSP90的分子伴侶功能有抑制作用，但同為HSP90底物蛋白的AKT表達水平卻并未受影響，因此SAHA是否通過抑制HSP90分子伴侶功能而介導(dǎo)HL60細胞凋亡尚需要更多的實驗證實。

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篇10

[關(guān)鍵詞] 心肌內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶；組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子；表達；變化

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）04（a）-0007-03

Changes of Intramyocardial Matrx Metalloproteinases and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase Protein Expression

MA Xin-hua

Department of Clinical Laboratory， Heze Multiple Hospital， Heze， Shandong Province， 274000 China

[Abstract] Objective To study the changes of intramyocardial matrx metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase protein expression. Methods 20 SD rats in the laboratory in our hospital from January to February 2017 were randomly selected and divided into the Adriamycin group and the control group， the mRNA expression level was measured by the semi-quantitative RT-PCR method， while the protein level was tested by the Western blotting method， and then the effect of adriamycin on the cardiac muscle tissue MMP-2， MMP-9 expression， TIMP-1 and MAPKs activity was analyzed. Results The cardiac muscle tissue MMP-2 and MMP-9mRNA increased affected by the adriamycin， and the cardiac muscle tissue MMP-2 and MMP-9 protein expression level increased under the treatment of adriamycin， and the cardiac muscle tissue TIMP-1mRNA level increased affected by the adriamycin， the cardiac muscle tissue TIMP-1 protein level increased under the treatment of adriamycin， and the cardiac muscle tissue p38MAPK phosphorylation level increased under the treatment of adriamycin， but the ERK and JNK MAPK MAPKs phosphorylation levels did not increase under the treatment of adriamycin，. Conclusion Adriamycin has a direct and deep effect on the intramyocardial matrx metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase protein expression， which is worth full attention in clinic.

[Key words] Intramyocardial matrx metalloproteinases； Tissue inhibitor of metalloproteinase protein expression； Expression； Change

心力衰竭儆諞蛔樽酆險鰨在臨床極為常見，心室重塑及心肌損傷是其發(fā)病及發(fā)展的主要機制，極易降低心功能[1]。阿霉素屬于一種廣譜高效的抗腫瘤藥物，在腫瘤的治療中應(yīng)用極為廣泛，但是由于其毒性會損傷心肌組織，因此其在臨床的應(yīng)用受到了一定程度的限制。充血性心力衰竭的心肌病是其主要的毒性作用，患者具有極差的預(yù)后[2]。在對完整的心肌結(jié)構(gòu)進行保持的過程中，細胞外基質(zhì)發(fā)揮著極為重要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）屬于一組蛋白水解酶，能夠?qū)Π饣|(zhì)進行降解，在很多組織中存在，如心肌、肝臟、血管等。有MMPs抑制劑及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）存在于體內(nèi)。細胞外基質(zhì)的生成及降解平衡在一些病理生理條件下會隨著MMPs及TIMPs表達的改變而改變，引發(fā)心肌重構(gòu)[3]。該研究對2017年1―2月該院實驗室的20只SD大鼠的相關(guān)資料進行了回顧性分析，探討了心肌內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶及組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子表達變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取該院實驗室的20只SD大鼠，依據(jù)隨機數(shù)字表法將其分為阿霉素組和對照組兩組，每組10只，阿霉素組應(yīng)用5 mg/kg體重阿霉素（批準文號：注冊證號 H20130186）+生理鹽水對大鼠進行處理，每5天1次，連續(xù)應(yīng)用2次，共10 mg/kg。第1次注射阿霉素+生理鹽水2周后開始對大鼠進行乙醚（批準文號：國藥準字Z20093680）麻醉，將胸腔打開，將心臟血流抽取出來，同時取出心臟，然后將其浸泡在pH值為7.4的10 mmol/L磷酸鈉鹽（批準文號：國藥準字H201034 72）+生理鹽水的PBS溶液中進行清洗，在-80℃的環(huán)境中凍存[4]。

1.2 基因表達測定

應(yīng)用Trizole試劑提取心肌總RNA，應(yīng)用SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNAs，應(yīng)用半定量RT-PCR法測定mRNA表達水平，引物序列具體見表1。

1.3 蛋白質(zhì)水平檢測

運用Western blotting方法對蛋白質(zhì)水平進行檢測，用SDS-PAGE分離心肌組織蛋白，一抗為TIMP-1、MMP-2、MMP-9的抗兔抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的抗兔lgG，發(fā)光底物為ECL檢測試劑[5]。

1.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理該研究所得數(shù)據(jù)，用單因素方差分析數(shù)據(jù)，用q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織MMP-2、MMP-9表達受到阿霉素的影響

水平半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，心肌組織MMP-2、MMP-9mRNA在阿霉素的作用下提升，見圖1。Western blotting檢測也表明，心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白表達水平在阿霉素處理的情況下提升，見圖2。

2.2 心肌組織TIMP-1表達受到阿霉素的影響

MMP-2、MMP-9最主要的抑制劑為TIMP-1，心肌組織TIMP-1mRNA水平會在阿霉素的作用下提升見圖3。Western bolttingz測也表明，心肌組織TIMP-1蛋白水平在阿霉素處理的情況下提升。

2.3 心肌組織絲裂速活化蛋白激酶（MAPKs）活性受到阿霉素的影響

相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者研究表明，MMPs、TIMPs的表達調(diào)控中有MAPKs的參與，MAPKs主要分為3類，即ERK、JNK MAPK、p38，其激活的標準為絲/蘇氨酸磷酸化。Western boltting檢測表明，心肌組織p38MAPK磷酸化水平在阿霉素處理的情況下提升，而ERK、JNK MAPK MAPKs磷酸化水平并沒有在阿霉素處理的情況下提升。

3 討論

相關(guān)研究表明，阿霉素產(chǎn)生的大量活性氧自由基直接而深刻地影響著其誘導(dǎo)的心肌毒性[5-7]。在動物模型中，抗氧化劑處理能夠?qū)Π⒚顾卣T導(dǎo)的心力衰竭進行明顯的緩解。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者研究表明，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子AP-1會在體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)下提升，進而提升TIMP-1基因表達。目前，臨床還沒有完全弄清楚活性氧自由基對AP-1的激活機制，可能是自由基將MAPK蛋白激酶首先激活。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者研究表明，JNK或p38MAPK會磷酸化AP-1的亞基c-Jun，增強其轉(zhuǎn)錄活性[8]。該研究結(jié)果表明，心肌組織p38MAPK磷酸化水平在阿霉素處理的情況下提升，而ERK、JNK MAPK MAPKs磷酸化水平并沒有在阿霉素處理的情況下提升，說明阿霉素提升了p38MAPK蛋白激酶活性。因此，臨床普遍認為，TIMP-1表達在阿霉素的作用下提升的分子機制可能為：①阿霉素提升了心肌組織活性氧自由基；②p38MAPK蛋白激活被細胞內(nèi)信號活性氧自由基的作用下激活；③p38MAPK蛋白激酶磷酸化AP-1的亞基c-Jun等，進而激活該轉(zhuǎn)錄因子；④阿霉素提升了AP-1介導(dǎo)的TIMP-1表達。但是，這些假設(shè)還沒有得到臨床的充分驗證，需要相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者進行進一步的實驗研究來對其進行驗證。

綜上所述，心肌內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶及組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子表達受到阿霉素的直接而深刻的影響，值得臨床充分重視。

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