聚合物合金法制及性能

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本文作者：劉華蔚溫偉生孫華燕鄭愛萍胡敏陳麗潔工作單位：解放軍總醫院口腔醫學研究所

傳統復乳法及聚合物合金法制備NGF緩釋微球:(1)傳統復乳法:采用復乳-溶劑揮發法(W/O/W)制備緩釋微球，300μg的NGF和10mg牛血清白蛋白(BSA)溶于100μl的去離子水中得內水相(W1);PL-GA300mg溶于2ml的二氯甲烷(CH2Cl2)溶液中形成油相(O)，外水相為2%聚乙烯醇溶液10ml(W2)。將W1倒入O中，冰浴超聲處理30s得到初乳(W1/O)，將初乳倒入W2中，冰浴下高速勻漿30s，得到(W1/O/W2)復乳。將復乳倒入400ml10%的去離子水氯化鈉溶液中，室溫下磁力攪拌機(上海雷磁)，1700r/min攪拌2h，前30min冰浴，后1.5h常溫下攪拌，再800r/min攪拌2h揮發殘余有機溶劑，收集微球，去離子水洗滌3次，真空凍干，得微球205.8mg，置于4℃保存。(2)聚合物合金法:采用乳化-溶劑揮發法(S/O/W)與聚合物合金法結合制備微球，分為兩步。①NGF微粉化。經純化的NGF溶液300μg，與牛血清白蛋白溶液0.5ml(含BSA10mg)混合后進行凍干處理，預凍溫度－50℃，降溫速度20℃/min，凍干條件(－20℃，3h;20℃，12h)。混合物凍干后得到均勻分散在BSA基質中的NGF藥粉(S)。②NGF微囊化。PLA/PLGA(PLA∶PLGA=1∶3)300mg置于試管內，加入所制NGF凍干粉，加入2ml的CH2Cl2使聚合物溶解形成油相(O)。水相為2%聚乙烯醇溶液10ml(W)。將W加入O中，高速勻漿30s，形成S/O/W乳液，復乳倒入400ml10%的去離子水氯化鈉溶液中，室溫下磁力攪拌，方法同上，得微球256.7mg，置于4℃保存。2．微球形態及粒徑的檢測:取少量NGF-PLGA緩釋微球放置于貼有雙面膠的金屬板上，噴金制成掃描電鏡標本，掃描電鏡下觀察其外形。取少量NGF緩釋微球溶解于去離子水，在光學顯微鏡下用測微尺測定200個微球的粒徑，每隔5μm粒徑為一單元，分別計數每一單元的微球數。以微球個數的百分數為縱坐標(%)、粒徑大小為橫坐標(μm)，繪制微球粒徑分布的直方圖，測定微球的平均直徑及粒徑分布。3．微球包封率的測定:(1)建立標準曲線將NGF-ELISA檢測試劑盒中的標準品稀釋為10、20、40、80、160、320pg/ml的NGF溶液，以不含NGF的空白微球降解液作為空白對照，將酶標儀吸光度調零，繪制標準曲線。(2)萃取法提取微球中的NGF:分別取10mgNGF緩釋微球溶于0.5ml的乙酸乙酯中，然后加入2ml的去離子水，在振蕩器上充分混勻，萃取乙酸乙酯中的NGF，靜置，分取水層，重復3次。合并三次提取液，混勻。(3)微球萃取率的測定:取10mg不含NGF的微球和標準品NGF1μg溶于0.5ml的乙酸乙酯中，然后加入2ml的去離子水，在振蕩器上充分混勻，萃取乙酸乙酯中的NGF，靜置，分取水層，重復3次，合并三次提取液，混勻。用ELISA法在450nm波長下測定所得溶液的吸光度值，計算NGF含量，算得萃取率。(4)微球包封率的測定:將步驟(2)中萃取液稀釋，用ELISA法(檢測范圍10～400ng/L)在450nm波長下測定所得NGF溶液的吸光度，以空白微球降解液作為空白對照。計算微球中NGF的含量，嚴格按照說明書操作。微球包封率按以下公式計算:微球中測定的NGF量=微球質量×(4)中測得微球中NGF濃度;微球中理論NGF量=投入的NGF的質量;微球包封率(%)=微球中測定的NGF量/微球中理論NGF量×100%。4．微球的體外釋放:準確稱取兩種微球各3份，50mg微球分別溶于5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中(pH7.4)，37℃震蕩溫浴，分別在6h、12h、1d、4d、7d、14d、21d、30d、40d、50d、60d、70d、80d、90d取出全部稀釋液(2000r/min，2min)，并補充相應的緩沖液，取出液－20℃保存，每個樣品按1∶100和1∶1000稀釋，每個濃度的稀釋樣品做雙復孔，ELISA測定NGF濃度，計算每次釋藥量及累積釋藥率，并繪制釋放曲線。5．微球中NGF活性的檢測［6-7］:分別于1d、7d、30d、60d、90d時取微球釋放液，通過對PC12細胞突起的計數來檢測NGF的活性。將生長良好的PC12細胞接種于預先經鼠尾膠原包被的6孔培養板中，接種密度為2×104/cm2，每孔加入2ml含體積分數為10%馬血清和體積分數為5%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃、體積分數為5%CO2及飽和濕度條件下培養3h后隨機分組，分為NGF組(陽性對照組)、不含NGF的牛血清白蛋白微球組(陰性對照組)、傳統復乳法制備的NGF微球組(復乳法組)、合金法制備的NGF微球組(合金法組)。分別以50ng/ml的NGF、牛血清白蛋白微球的緩釋液、傳統復乳法所制備NGF微球的緩釋液、合金法制備的NGF微球緩釋液各2ml替換原細胞培養液，繼續培養48h后，在倒置顯微鏡上用隨機選取視野，計數100個細胞，并計算每組中長出軸突的細胞(陽性細胞)比例，陽性細胞比例(%)=陽性細胞數/計數細胞數，每組實驗重復3次。

數據均以均數±標準差(x珋±s)表示，采用CHISS統計軟件對數據進行均數t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。結果一、NGF緩釋微球表觀形態觀察結果光鏡、掃描電鏡結果顯示兩種方法制備的NGF微球均具有光滑的表面且形態規整均勻，近似圓形，大小相近，體外PBS中釋放90d后其表面存在大量孔隙，部分降解，見圖1，2。二、微球粒徑測定結果兩種方法制備的微球粒徑分布經CHISS軟件正態性檢驗均符合正態分布，傳統復乳法組平均粒徑(24.68μm)，合金法組平均粒徑(22.47μm)，傳統復乳法組制備微球粒徑較合金法略小，見圖3。三、微球產率、包封率測定結果實驗測得標準曲線為y=0.0063x+0.0015，萃取法回收率為(67.6±4.6)%。微球產率=制得微球質量/(BSA質量+NGF+共聚物質量)，傳統復乳法制備的微球產率為66.3%，包封率為(23.7±2.1)%;合金法組制備微球產率為82.7%。包封率為(49.5±3.4)%，可見合金法組制備微球產率、包封率均明顯高于傳統復乳法。四、微球的體外釋放結果傳統復乳法與合金法在第90天時，累積釋放率分別為達到(78.6±2.0)%、(91.2±2.2)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)。傳統復乳法存在著顯著突釋效應，24h時釋放率為(22.3±1.6)%，合金法突釋效應較小，24h時釋放率為(8.8±0.7)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)。微球體外釋放曲線見圖4。五、微球中NGF活性的檢測結果第1、7、30、60、90天的微球緩釋液被用來作為體外NGF活性的檢測。PC12細胞能在NGF的刺激下發出突起分化為神經元樣細胞，見圖5。因此可通過計算陽性PC12細胞的比例來考察NGF的活性［8］。見表2。由表2可知，陽性對照、復乳法、合金法組在1d、7d、30d、60d時組間差異無統計學意義;90d時復乳法與合金法組差異有統計學意義(P＜0.05)，陰性對照組與復乳法組差異無統計學意義。說明60d時復乳法組、合金法組均可分泌活性的NGF，90d時合金法組仍可分泌活性的NGF，復乳法組無活性NGF分泌。討論隨著生物學等相關學科的發展，蛋白質類藥物的臨床應用日益廣泛，目前的主要應用劑型是凍干粉針劑，由于蛋白質的半衰期較短，注射頻繁，令很多患者難以接受。緩控釋劑型的發展為蛋白質類藥物提供了劑型改進方向，緩釋微球制劑可較長時間持續釋放藥物，克服了蛋白質類藥物半衰期短，頻繁給藥的缺點。近年來，微球制劑的研究發展迅速，它是利用高分子材料包封藥物形成球狀實體，通過高分子材料的緩慢降解而逐步釋放藥物，從而達到緩釋的目的。溶劑揮發法是最常用的蛋白質類微球制備方法，對實驗設備要求較低，成球性較好，尤其適合少量微球的制備，成為我們微球制備的首選方法。但其制備過程中有諸多因素對微球的相關性狀有著顯著的影響，特別是超聲及機械攪拌過程中產生的剪切力會嚴重影響生物大分子藥物的生物活性，從而使得多肽蛋白質類藥物極易在微球內部聚集形成不溶性沉淀而影響藥物的釋放［9］。本實驗采用傳統復乳法及聚合物合金法制備微球。從聚合物專業角度進行定義，“聚合物合金技術”(polymer-alloystechnique)系指一種聚合物相分散在另一種聚合物相中形成固態混合物的技術。研究發現，在特定條件下，兩種聚合物在有機溶劑中能自動分離成兩種溶液。以PLA和PLGA為例，它們在CH2Cl2中可生成富含PLA相和富含PLGA相。如PLGA與PLA重量比介于1∶2～1∶4時，會產生分散相中富含PLGA，連續相中富含PLA的現象。如將藥物與PLGA混合，則乳劑中的分散相往往由藥物和PLGA組成，連續相仍富含PLA。上述兩種聚合物經溶劑揮發法制得的微球，藥物基本都在微球的中心部位，外周囊壁主要成分為PLA。Morita等［10］利用聚合物合金法制備牛重組超氧化物歧化酶(bSOD)微球，采用聚乙二醇作為蛋白質保護劑，結果當PLGA和PLA(重量比1∶4)時，制成微球包封率為87.6%，以接近0級的速率控釋藥物達4周之久，突釋作用僅1.4%，生物活性保存率高達113.1%。藥物的體外釋放一般符合三段模式:爆發釋放，低速率的釋放，最后是較高速率的釋放。藥物從微囊中釋放出來是藥物擴散與微囊降解的結合，在聚合物降解過程的不同階段，上述兩種機制分別占主導作用。微囊表面的藥物和尚未包于囊內的藥物晶體釋放形成突釋效應，眾多學者嘗試改進制作工藝以降低藥物突釋率［11］。

本實驗采用傳統復乳法及聚合物合金法制備的微球均未出現上述的三段模式，所以無雙峰現象出現，只表現為最初的突釋和繼之而來的相對穩定的釋放。在體外釋放的實驗中，傳統復乳法及聚合物合金法24h藥物的釋放率分別為22.3%和8.8%，均存在藥物突釋現象，但聚合物合金法藥物突釋效應明顯較傳統復乳法低。90d時傳統復乳法和聚合物合金法累計釋放率分別為78.6%、91.2%，聚合物合金法釋藥更完全。對于蛋白質藥物而言，藥物的載藥量、包封率并不等于具有活性的藥物的量，主要由于微囊制備過程中蛋白質分子會遭到不同程度的破壞，破壞程度與制備條件及制備工藝有關，我們制備蛋白質藥物微囊的目的就是最大限度地保護藥物的活性，所以了解微囊內藥物的生物學活性也是必要的。根據實驗測定需要，我們采用了PC12細胞方法進行活性測定，NGF可使PC12細胞停止分裂，長出突起，轉化成神經元樣細胞。本組實驗通過測量陽性PC12細胞比例，傳統法組在90d時與陰性對照組接近，證明已無活性NGF釋出，而合金法組可一直釋放活性NGF達90d。本實驗采用聚合物合金法制備NGF緩釋微球，結果微球大小符合實驗要求，較傳統復乳法所制備的NGF緩釋微球突釋效應較少，包封率更高，可一直釋放活性NGF達90d。聚合物合金法制備NGF緩釋微球對減少突釋、提高包封率、保留NGF活性均有重要意義，值得深入研究，具有廣泛的應用前景。