大鼠Munc13研究論文

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【摘要】目的：研究大鼠胰腺發育不同階段munc131基因及蛋白表達的變化及Munc131在胰島素釋放過程中的作用.方法：應用顯微分離及提取技術獲得大鼠胚胎發育12.5d（E12.5）,E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21d（P21）及成年大鼠胰腺組織；另外，從大鼠胚胎發育15d開始給予孕鼠半量飲食，造成宮內發育遲緩動物模型，提取其新生大鼠胰腺組織.采用RTPCR,RealtimePCR和Westernblot技術確定Munc131的表達情況，并測定不同發育時期血中胰島素濃度.結果：胰島素基因從E12.5開始出現，Munc131基因從E15.5開始表達，隨著胎齡的增長，二者表達量皆增多.E15.5和E18.5時munc131蛋白表達量較少，以后明顯增多.自E18.5即檢測到血中胰島素的存在，隨著胚胎的發育，血胰島素濃度逐漸升高.宮內發育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠血胰島素濃度低，同時Munc131基因及蛋白表達量亦比正常對照組明顯減少.結論：Munc131在胰島素釋放過程中的作用，隨著胚胎發育期胰島素分泌的增多表達也增加，宮內發育遲緩新生大鼠胰島素分泌減少時，Munc131的表達亦減少.

【關鍵詞】Munc131；胰島素/分泌；胚胎胰腺發育；糖尿病；宮內發育遲緩

0引言

胰島素在β細胞內合成后，以分泌顆粒的形式貯存在大致密囊泡中，在營養物質（葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）、神經遞質、激素等刺激下，進入血循環，完成其調節體內營養物質代謝，調節生長發育，控制血糖動態平衡的生理作用［1-2］.業已證實，胞吐過程是涉及許多蛋白因子的復雜過程，可溶性N甲基馬來酰胺融合蛋白附著蛋白受體(solublenethylmaleimidesensitivefusionproteinattachmentproteinreceptors,SNARE)復合體是胞吐過程所必須的分子構件；Munc，Synaptotagmin，Rab等蛋白家族的不同成員是其重要的調節因子.這些因子在神經遞質胞吐中研究得較多，但他們在胰島素分泌過程中的確切作用及其精細功能如何尚無定論［3-5］.我們運用基因芯片技術，已建立了大鼠不同發育階段基因表達譜，初步明確了胰島素釋放的完善過程中相關基因的表達情況，在此基礎上，我們重點從胰島素釋放關鍵因子之一Munc131入手，探討正常及異常胰腺發育情況下Munc131表達的變化，闡述其在胰島素釋放過程中所起的重要作用，以期尋找糖尿病治療的新靶點.

1材料和方法

1.1材料SD大鼠由南京醫科大學實驗動物中心提供.18：00將雌雄鼠合籠，次日晨檢測有陰栓者定為孕0.5d（E0.5），分別于受精后12.5d(E12.5),15.5d(E15.5),18.5d(E18.5)，經頸椎脫臼處死孕鼠，剖腹取出孕子宮，分離胚胎，取出胰腺（E12.5,E15.5胚胎胰腺需在解剖顯微鏡下分離），新生鼠出生后，立即與母體分離，迅速取出其胰腺.出生后21d鼠和成年鼠在低溫條件下迅速取出胰腺［6］.部分孕鼠于E15開始給予正常卡路里的50%，直至出生，造成宮內發育遲緩動物模型，待新生鼠出生后，立即取出其胰腺.所有標本置液氮中速凍后-70℃凍存備用.分別取E12.5胚胎胰腺100只、E15.5胚胎胰腺30只，E18.5胚胎胰腺10只（來自3只孕鼠）,新生鼠3只（來自3只孕鼠），用RneasyMiniKit（Qiagen公司）抽提并純化總RNA.總RNA分裝后-70℃凍存，用于RTPCR和RealtimePCR.

1.2方法RTPCR和RealtimePCRRTPCR操作過程按試劑盒（日本Toyoko公司）提供常規步驟.目的基因及內參照引物序列如下：G3PDHforward:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,reverse:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′.Insulinforward:5′CCGTCGTGAAGTGGAG3′,reverse:5′CAGTTGGTAGAGGGAGCAG3′.PDX1forward:5′GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAA3′,reverse:5′CCAGTCTCGGTTCCATTCG3′.Munc131forward:5′TGTGGAACAAGGGTCTCATCTGG3′.reverse:5′GGCTGCGAAGTCGTGTAGTAAGG－3′.Munc131RealtimePCR探針設計如下：unc13h1fam:CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG，unc13h1fp:CGCTATGGCGTTGAATCCA，unc13h1rp:TGCGTAGTAGGCGTTGATGTTG.分別取E15.5的胰腺100只,E18.5的胰腺20只,新生大鼠胰腺6只,出生后21d大鼠6只、成年大鼠6只（雌雄各3只），分別按1∶5（m/V）加裂解液（50mmol/LTrisCl,150mmol/LNaCl,1g/LSDS,100mg/LPMSF,10g/LNP40,10g/LTritonX100,10g/L蛋白酶抑制劑cocktail），冰上勻漿，然后300W超聲4s×14（間隔時間）×6次（保護、工作復位），靜置1h后，21500g離心15min，提取上清為總蛋白，用Braford法測蛋白濃度，分裝后-70℃凍存備用.將上述提取的胰腺發育各時期的總蛋白,進行SDSPAGE,轉膜后以Munc131（小鼠，針對621~834氨基酸，BD公司）為一抗，羊抗小鼠IgG為二抗進行雜交，檢測其相對分子質量.另取E18.5、新生大鼠和成年大鼠血標本各6份，運用胰島素ELISA試劑盒（Linco公司）檢測血中胰島素水平.

2結果

胰腺內分泌細胞的一些標志物如insulin，PDX1等基因在所取胰腺皆有表達，證明我們的取材是準確無誤的.

2.1胰腺發育各階段Munc131基因及蛋白的表達Munc131從E15.5開始表達，以后一直持續存在；同時，胰島素基因從E12.5開始出現，隨著胎齡的增長表達量增多（圖1）.RealtimePCR結果與RTPCR結果趨勢一致.Westernblot結果顯示，在Mr1.97×105處出現雜交帶,此與文獻報道的Munc131抗原的相對分子質量相一致.E15.5和E18.5時Munc131蛋白表達量較少，新生以后表達量明顯增多.

M：Marker；N：新生大鼠；P21：出生后21d大鼠；A：成年大鼠.

圖1大鼠胰腺中Munc131,insulin的表達（RTPCR）（略）

A:正常大鼠；B:宮內發育遲緩新生大鼠.N：新生大鼠；IUGR：宮內發育遲緩新生大鼠.

圖2胰腺中Munc131蛋白的表達（Westernblot）（略）

2.2宮內發育遲緩新生大鼠Munc131基因及蛋白的表達與正常新生大鼠相比，宮內發育遲緩新生大鼠insulin基因表達無明顯變化，PDX1表達相對減少，而Munc131的基因表達明顯減少（圖3）.宮內發育遲緩新生大鼠Munc131蛋白表達量比正常對照組明顯減少（圖2B）.

N:正常新生大鼠；IUGR：宮內發育遲緩新生大鼠.

圖3正常及宮內發育遲緩新生大鼠insulin，PDX1，Munc131的基因表達（略）

2.3大鼠不同發育階段血胰島素水平自E18.5即檢測到血中胰島素的存在，但濃度較低，隨著胚胎的發育，血胰島素濃度明顯升高，新生和成年期血胰島素水平無顯著差異.另外，宮內發育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠血胰島素濃度低.

3討論

胞吐是胰島素釋放出β細胞的重要過程.胰島素分泌顆粒分別位于貯存池（約95%～99％）和釋放池（約1%～5％），釋放池的胰島素顆粒經過胞吐介導一相胰島素分泌，貯存池的胰島素顆粒經過轉位、錨定、成熟等過程，補充釋放池的不足，完成二相胰島素分泌.雖然循環胰島素的量與胰島素合成有關，但與胰島素釋放的調節關系更加密切［7-9］，本實驗室最近的結果顯示，上述胰島素分泌關鍵因子在胚胎及成年大鼠胰腺有表達（結果未列），為明確各關鍵因子的具體作用，我們首先選擇了Munc131作進一步的研究.Munc家族成員中較重要的是Munc13（包括Munc131，Munc132，Munc133）和munc18.有研究提示，Munc131不僅可以與Munc18結合，使Munc18與syntaxin解離，還能直接作用于syntaxin，使syntaxin從syntaxinMunc18復合體中游離出來，此時SNARE復合體才能從沒有胞吐能力的松散狀態變成致密復合體，促使胞吐的發生［10-12］.但Munc131在胰島素分泌過程中的確切作用顯有報道，對其胚胎發育期的研究更是少.我們發現，大鼠E12.5胰島素基因即開始表達，Munc131從E15.5開始出現，說明胚胎胰腺發育早期即有了合成胰島素的能力，隨后才出現胰島素胞吐關鍵調節基因，隨著胚胎的生長，二者表達量增多.Munc131蛋白在E15.5，E18.5已有少量表達，出生以后表達明顯增多，與基因水平表達趨勢基本一致.另宮內發育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠血胰島素水平降低，從基因水平及蛋白水平上看，宮內發育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠Munc131的表達明顯減少，而胰島素基因的表達無明顯變化，這提示宮內發育遲緩新生大鼠胰島素的合成能力可能不變，其血胰島素水平下降可能發生在胰島素釋放的環節，即可能是Munc131等胞吐調節因子表達下降，從而造成胰島素胞吐能力減弱，導致循環胰島素減少.

因此，我們可以得出以下結論：①大鼠胚胎胰腺有分泌胰島素的能力，以調節自身血糖水平，但胚胎發育晚期才開始有較多的胰島素分泌，且隨著胚胎生長，胰島素分泌增多；②Munc131在胰島素釋放過程中起著重要作用，隨著胚胎發育期胰島素分泌的增多，Munc131的表達同時增多，而宮內發育遲緩新生大鼠胰島素分泌減少時，Munc131的表達亦減少.

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