抗Stat3多克隆抗體的制備和其在乳腺癌診斷中的應(yīng)用

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【關(guān)鍵詞】信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3；抗體；乳腺腫瘤；組織學分級

Preparationofpolyclonalantibodyagainststat3anditsapplicationinthediagnosisofbreastcancer

【Abstract】AIM:TopreparerabbitantibodyagainstStat3andanalyzeitsapplicationinthediagnosisofbreastcancer.METHODS:ThemalerabbitswereimmunizedwithrecombinantmouseStat3proteintoprepareantibodyagainstStat3.ThepurityandspecificityoftheantibodywereanalyzedbyWesternBlot.TheexpressionofStat3proteininthe65casesofbreastcancerand30casesofnormalbreasttissuewasdetectedbyimmunohistochemicalstaining.RESULTS:ThetiterofantiStat3antibodyinserumwas>1∶256000(A450=0.40)atthe6thweekaftertheimmunization.BothSDSPAGEandWesternBlotanalysisshowedthattherewasanobviousproteinbandwithMr92000,TheintracytoplasmicexpressionlevelsofStat3proteininthedifferenthistologicalgradingsof65casesofbreastcancershowedsignificantdifference(P<0.05),sodidtheintranuclearexpressionlevels(P<0.05).CONCLUSION:PolyclonalantibodyagainstStat3withhightiterandspecificitycanbepreparedsuccessfully,anditcanbeusedtodetecttheexpressionofStat3proteininbreastcancertissue.

【Keywords】Stat3;antibodies;breastneoplasms;histologicalgrading

【摘要】目的：制備兔抗信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Stat3）抗體，分析其在乳腺癌診斷中的價值.方法：應(yīng)用人工重組小鼠Stat3蛋白，免疫雄性家兔制備抗Stat3抗體；用免疫印跡法分析檢測抗Stat3抗體的純度和特異性；應(yīng)用免疫組化染色法檢測65例乳腺癌和30例正常乳腺組織中Stat3蛋白的表達.結(jié)果：用Stat3蛋白免疫家兔被免疫6wk后，其血清中抗Stat3抗體效價>1∶256,000（A450nm=0.40）；SDSPAGE和免疫印跡分析均在分子質(zhì)量（Mr）92000處有明顯的帶；65例乳腺癌組織的細胞漿和細胞核中，Stat3蛋白表達量在不同的組織學分級之間有統(tǒng)計學差異(P<0.05).結(jié)論：高效價和特異性強的抗Stat3抗體被成功制備.該抗體可用于乳腺癌組織細胞Stat3蛋白表達的檢測.

【關(guān)鍵詞】信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3；抗體；乳腺腫瘤；組織學分級

0引言

信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription;Stat3)是一類脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，于細胞漿內(nèi)有少量表達，細胞核內(nèi)無表達，是信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員之一.

異常的信號轉(zhuǎn)導使Stat3磷酸化而被持續(xù)激活，促進細胞的惡性轉(zhuǎn)化［1］和阻斷細胞凋亡［2］.Stat3也可以被多種細胞因子、生長因子、非受體酪氨酸激酶、G蛋白等分子激活，將細胞外信號轉(zhuǎn)導至細胞核，激活基因的轉(zhuǎn)錄和表達［3］.Stat3表達的變化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，然而，有關(guān)Stat3在乳腺癌診斷中的作用還沒有詳細報道.我們用本室制備的小鼠重組Stat3蛋白，再制備兔抗Stat3抗體，來分析Stat3蛋白在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達，以及在乳腺癌診斷中的價值.

1材料和方法

1.1材料雄性，新西蘭兔，體質(zhì)量3.0kg(河北醫(yī)科大學動物中心).福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑為美國GibcoRBL產(chǎn)品.HRP標記的羊抗兔IgG和免疫組化顯色試劑盒（購自北京中山生物工程公司）.重組小鼠Stat3蛋白由本室和美國MD公司共同制備（蛋白含量1.63g/L，經(jīng)SDSPAGE分離顯示單一條帶，Mr為92000）.30例正常乳腺組織來自良性增生和良性腺病的患者，65例乳腺癌組織來自女性乳腺癌患者，年齡(48±15)歲.這些研究對象經(jīng)冰凍切片和免疫組化同時證實確診，病理學分級由病理科提供，常規(guī)方法做病理切片.

1.2方法

1.2.1免疫動物將Stat3蛋白（0.336g/L）0.2mL與福氏完全佐劑0.5mL混勻后，注射于家兔腹股溝和后腳掌進行初次免疫.14d將同樣量的Stat3蛋白與福氏不完全佐劑0.5mL混勻后進行第二次免疫，注射部位同前.28d取Stat3蛋白（0.25g/L）0.15mL用福氏不完全佐劑0.5mL混勻后，于背部皮下多點注射進行最終免疫.42d處死兔子收集全血.其中于初次免疫前取耳靜脈血2mL；第1次免疫后12d，第2次免疫后7d，第3次免疫后9,14d分別抽血3mL用于抗體效價測定.

1.2.2抗體效價的檢測用0.05mol/LpH9.5CBS稀釋Stat3蛋白，用常規(guī)方法包被酶標板，ELISA法檢測兔血清中抗Stat3抗體的效價.

1.2.3抗體的純化用330g/L飽和硫酸胺鹽析抗血清，離心沉淀后，用生理鹽水透析24h，8h換1次生理鹽水，將透析液用DEAE32層析柱進行濃縮，收集洗脫液，測A280nm值.

1.2.4抗體純度和特異性檢測將Stat3蛋白進行SDSPAGE分離（分離膠濃度為120g/L）.電泳后，用考馬斯亮藍R250染液染色確認蛋白條帶，將分離膠中的蛋白用電泳轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜用50g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜.洗膜后，與兔抗Stat3抗血清(1∶1000稀釋)37℃反應(yīng)2h；加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5000稀釋)，于37℃反應(yīng)1h，以DAB顯色.

1.2.5乳腺組織細胞Stat3表達的檢測200309/200403取本院外科65例乳腺癌患者手術(shù)切除的乳腺癌組織標本，30例良性增生和良性腺病的乳腺組織進行組織切片.將上述方法制備的兔抗Stat3抗體用PBS做1∶400稀釋，按常規(guī)SP方法進行乳腺組織免疫組化染色.結(jié)果判斷標準：按照Laird標準［4］進行，Stat3陽性表達為細胞質(zhì)呈棕黃色云霧狀，細胞核呈棕色顆粒狀.每個視野中陽性細胞>50%為強陽性（），5%～50%的為陽性（+），<5%為陰性（-）.Stat3蛋白胞質(zhì)表達：細胞質(zhì)呈深棕色云霧狀>80%（），細胞質(zhì)呈棕色云霧狀>50%（），細胞質(zhì)呈棕黃色云霧狀>5%～50%（+），細胞質(zhì)呈淡棕黃色云霧狀<5%（-）.Stat3蛋白胞核表達：細胞核呈深棕色顆粒狀>80%（），細胞核呈棕色顆粒狀>50%（），細胞核呈棕黃色顆粒狀>5%～50%（+），細胞核不染色或呈淡棕黃色顆粒狀<5%（-）.

統(tǒng)計學處理：免疫組化染色所得結(jié)果用SPSS11.5軟件分析，統(tǒng)計方法為非參數(shù)秩和檢驗，Spearmans等級相關(guān).P<0.05為有統(tǒng)計學意義.

2結(jié)果

2.1兔抗Stat3血清效價基礎(chǔ)免疫后2,3,5,6wk分別采取靜脈血，間接ELISA法檢測抗Stat3抗體的血清效價，分別為1∶6400,1∶32000,1∶240000和>1∶256000(A450nm=0.40).

2.2抗Stat3抗體的特異性和純度鑒定Stat3蛋白經(jīng)SDSPAGE分離，用考馬斯亮藍R250染液染色，分離出1條Mr為92000的蛋白條帶，大小與Stat3理論值相符（圖1中M和1）.將凝膠中的Stat3轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用制備好兔抗Stat3抗體進行免疫印跡，也出現(xiàn)Mr為92000左右的帶（圖1中2），證明此抗體為抗Stat3的特異性抗體.

M:marker;1:Stat3蛋白考馬斯亮藍R250染色；2：Stat3蛋白免疫印跡.

圖1兔抗Stat3血清特異性的免疫印跡分析（略）

2.3抗Stat3抗體在乳腺癌診斷中的應(yīng)用將正常乳腺組織30例和乳腺癌組織65例組織切片進行抗Stat3抗體免疫組化染色（表1，圖2），Stat3在正常乳腺組織細胞質(zhì)中呈淡棕黃色云霧狀，胞核不著色.乳腺癌組織在不同組織學分級的細胞質(zhì)中Stat3蛋白表達量有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；細胞核中Stat3蛋白表達在不同組織學分級乳腺癌組織中也有統(tǒng)計學差異(P<0.05).正常乳腺組織細胞質(zhì)中可見棕黃色霧狀著色，胞核不著色（圖3A）；在低分化癌細胞質(zhì)呈棕色云霧狀，胞核呈顆粒狀深棕色（圖3B）；而高分化癌組織的細胞質(zhì)呈棕黃色云霧狀，胞核著色呈棕色顆粒狀（圖3C）.

表1不同組織學分級的乳腺癌組織中Stat3的表達（略）

圖2Stat3蛋白在乳腺癌細胞質(zhì)（A）和細胞核（B）中的表達量與組織學分級（略）

A：正常乳腺組織；B：Ⅲ級；C：Ⅱ級.

圖3Stat3在不同分級乳腺癌組織中表達SP×400（略）

3討論

Stat3分子由750～795個氨基酸組成，Mr約為92000.編碼Stat3的基因在鼠科動物定位于第11號染色體，在人類定位于第17號染色體q21.Stat3在信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活途徑中發(fā)揮著重要作用，細胞膜上的細胞因子受體及非細胞因子受體與相應(yīng)配體相結(jié)合后，使胞質(zhì)內(nèi)的Jauns激酶（JaunsKinase;JAK）處于適當空間位置而相互磷酸化，然后募集Stat3蛋白到胞質(zhì)區(qū)磷酸化激酶的酪氨酸殘基上，以激活該蛋白，活化的Stat3形成同源或異源二聚體迅速轉(zhuǎn)位進入細胞核，與其特異的DNA序列結(jié)合，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄［5］.Stat3持續(xù)活化可引起急性髓細胞性白血病、磷狀細胞癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞異常增生［6-8］.細胞核內(nèi)Stat3含量的高低標志著該細胞JAkStat途徑的持續(xù)激活程度，只有激活的Stat3才能從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核，參與基因的表達調(diào)控［9］.Berclaz等［10］報道，正常人乳腺上皮細胞、肌上皮細胞、纖維母細胞周圍的脂肪性乳腺間質(zhì)等組織，檢測到細胞質(zhì)有微量Stat3的表達；在乳腺癌組織胞質(zhì)內(nèi)和胞核，都有非常強的Stat3表達，比正常乳腺組織高出很多倍.信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活可使下游癌基因獲得轉(zhuǎn)錄活性并表達，最終有可能形成癌癥.因此，信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活是疾?。ㄈ缒[瘤）形成的一個早期事件，Stat3的激活可能發(fā)生在疾病進程的早期，檢測Stat3蛋白在細胞質(zhì)、細胞核中的表達量將可能用于乳腺癌的診斷.

本實驗結(jié)果顯示，乳腺癌組織的細胞質(zhì)Stat3蛋白表達量與組織學分級成正相關(guān)，在不同組織學分級的細胞質(zhì)中Stat3蛋白表達量有顯著性差異(P<0.05).乳腺癌組織的細胞核中Stat3蛋白表達量與組織學分級成正相關(guān)，Stat3蛋白表達的含量也與組織學分級有顯著性差異(P<0.001)，組織學分級越高，細胞分化程度越低，胞核Stat3量越高.當乳腺癌發(fā)生時，Stat3的胞漿表達量增高，而胞核Stat3的含量從無到有，即胞核中Stat3蛋白呈陽性，因此Stat3蛋白的過量表達可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用.

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