茵陳水溶性提取物體外抗巨細胞病毒效應的實驗研究

導語：茵陳水溶性提取物體外抗巨細胞病毒效應的實驗研究一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關鍵詞】茵陳；,,抗病毒作用；,,巨細胞病毒,

摘要：目的：探討茵陳水溶性提取物溶液體外抗人巨細胞病毒(HCMVAD169)的效應。方法：采用細胞病變（CPE）抑制法觀察茵陳水溶性提取物溶液對HCMVAD169毒株的抑制作用，使用MTT比色法檢測細胞的損傷程度，并利用吸光度（A）值評價茵陳水溶性提取物溶液的抗HCMV的效應。結果：茵陳水溶性提取物溶液半數中毒濃度(TC50)為904.49mg・L-1，半數有效濃度(IC50)為195.11mg・L-1mg・L-1，治療指數(TI)為4.64。茵陳水溶性提取物溶液具有抗HCMV的作用，且其作用隨藥物濃度的增高而增強。結論：體外實驗證實，茵陳水溶性提取物是理想的抗HCMV中藥。

關鍵詞：茵陳；抗病毒作用；巨細胞病毒

巨細胞病毒（cytomegalovirus）是一種皰疹病毒科β屬的雙螺旋DNA病毒，在自然界廣泛存在。正常人中CMV的潛伏感染率很高,血清學檢查陽性率達40%~90%。普通人群感染后并不表現出癥狀,但在免疫缺陷或免疫抑制人群中卻有極強的致病性,腎移植后有癥狀的臨床感染發病率是20%～60%,如果沒有有效治療,死亡率可高達90%。在器官移植術后,尤其在使用免疫抑制劑的情況下,受體感染CMV的機率更高［1］，甚至引起嚴重的CMV疾病。CMV病治療目前國內外都以更昔洛韋作為首選［2］,而目前常用的更昔洛韋等幾種西藥都存在毒副作用大、價位高、長時間使用耐藥等缺點,臨床觀察表明在更昔洛韋耐藥病人中易產生嚴重的并發癥,包括異體移植物的喪失、持久的視力損害等的發生率高達80%［3］。而傳統的中藥制劑毒副作用小,價格低廉,服用方便，同時還有其他如抗菌、提高免疫力等效能。本研究所采用CPE和MTT方法觀察并測定茵陳水溶性提取物溶液對HCMVAD169毒株液的抗病毒效用，為發現有效藥物應用于臨床防治巨細胞病毒感染提供實驗依據。

1材料與方法

11材料

111人胚肺成纖維細胞(HEL)由山東省醫學科學院基礎研究所微生物研究室提供。實驗所用為413代細胞。細胞生長液為RPMI1640溶液加10%新生小牛血清,200kU・L-1青霉素,200kU・L-1鏈霉素。細胞維持液為RPMI1640溶液加2%新生小牛血清,所加抗生素同生長液。

112病毒HCMVAD169由山東醫學科學院基礎研究所微生物研究室提供,按常規增殖至實驗需求量,測定半數組織培養感染數量TCID50=10-3.71。

113藥物注射用更昔洛韋(GCV)購于廣東陽江制藥有限公司,批號：國藥準字H20033717,粉劑,每支250mg。將GCV溶于注射用水中,配制成50g/L濃度,臨用時用維持液配成不同濃度的溶液。茵陳水溶性提取物由北京師范大學資源學院資源藥物工程研究中心提供，臨用時用維持液配成不同濃度的溶液。

114主要試劑MTT［3(4,6二甲基噻唑2xl)2,5乙苯基四唑溴鹽］、新生小牛血清、胰蛋白酶、Hank氏液、HEPES及二甲基亞砜(DMSO)均購自北京鼎國生物技術公司;RPMI1640粉劑購自GIBCO。

115主要儀器設備超級酶標測試儀購自美國,型號規格550;二氧化碳培養箱購自美國，型號規格Nu1700E。

12方法

121病毒感染性滴度的測定取經24小時培養后生長良好的HEL細胞,加入96孔板中，每孔100mL(約1.5×105/孔),將培養板置于5%CO2培養箱中,37℃培養18小時,待細胞長成單層,將病毒原液以10倍遞次稀釋法［4］稀釋成9種不同濃度(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9),每個稀釋度設8個孔,將9種不同濃度的病毒液分別接種到長成單層HEL細胞的96孔板,每孔25μL,,置于5%CO2恒溫培養箱內,37℃吸附1h后,棄上清,以Hank氏液洗3次,加維持液0.1mL/孔,同時設細胞對照孔8孔,置37℃,5%CO2培養箱培養,每日檢查病毒生長情況,在光學倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態變化并記錄特征性細胞病變(CPE)的孔數,12d后記錄結果。用ReedMuench法［5］計算病毒的半數感染量(TCID50)。

ReedMuench法計算公式：TCID50=10-［（H－R）/（H－L）+E］

注：R為計算的死亡率，H為略高于50%的死亡率，L為略低于50%的死亡率，E為對應H死亡率的負指數。

122藥物細胞毒性試驗取生長良好的HEL細胞,將細胞加入96孔板,每孔100μL(約1.5×105/孔),待細胞長成單層后,同步化24h,用未含抗生素的維持液將GCV(藥物對照組)稀釋成200,100,50,25,12.5,6.25，3.2mg・L-1等7個濃度;將茵陳水溶性提取物溶液亦稀釋成2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1等7個濃度,將各濃度藥物以每孔200μl加入培養板,每個濃度設4孔做實驗孔,同時設正常細胞對照組各4孔。細胞MTT比色法：以CPE法觀察記錄藥物對HEL細胞的毒性結果后，每孔加入MTT染液20μL（5mg/ml）,置5%CO2培養箱中，37℃培養4h,可見細胞內形成甲贅結晶,棄染色液,每孔加入DMSO150μL,振蕩10min,直至紫藍色沉淀(甲贅)充分溶解后,在超級酶標儀490nm波長處測吸光度(A)值,計算各藥物濃度時TC50及細胞的存活率。試驗重復3次，取3次平均值作為試驗結果。

123藥物體外對病毒增殖的抑制作用取生長良好的HEL,以每孔100μL(約9.5×104個細胞/孔)的細胞懸液加入96孔板,5%CO2培養箱中37℃培養24h,細胞長成單層,同步化24h后以每孔約100TCID50攻擊量攻擊細胞,于5%CO2培養箱中,37℃吸附1h,棄上清;將藥液以低于IC50作8個稀釋濃度分別加入細胞孔中,每孔150μL,每一稀釋度設8孔,同時設立細胞對照組、病毒對照組;更換維持液隔天1次;在5%CO2培養箱中,37℃培養約8d,待病毒對照組細胞病變達到70%~80%時,每孔加入MTT20μL,繼續培養4h,吸棄上清,每孔加入DMSO150μL,振蕩10min,在超級酶標儀490nm波長下測吸光度(A)值,按下列公式計算細胞存活率及治療指數(TI)并采用用統計學軟件SPSS11.5的Probit回歸法計算半數有效濃度(IC50)。試驗重復3次,取平均值作為試驗結果。

細胞存活率(%)=(試驗組A值/對照組A值)×100%

TI=TC50/IC50

124光學倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態學變化細胞培養96h后，IC50下,光學倒置相差顯微鏡下觀察并比較各組的細胞形態。

13統計分析

使用SPSS11.5專業統計軟件進行數據分析。實驗數據以平均數±標準差(±s)表示,各試驗組與病毒對照組間差異性采用t檢驗,P<0.05認為有顯著差異。

2結果

21藥物的細胞毒性

GCV、茵陳水溶性提取物溶液分別在50mg・L-1，500mg・L-1以內均未見明顯的細胞毒性作用,但經較高濃度的藥物作用后,細胞死亡數增加,藥物有明顯的細胞毒性作用。GCV及茵陳水溶性提取物對HEL細胞毒性作用表現為:細胞變大變圓,顆粒增多,少量細胞聚集成團,培養液混濁,折光性增強以及吸光值明顯改變。注射用更昔洛韋200，100，50，25，12.5，6.25，3.2mg・L-1對HEL細胞的細胞存活率分別為4.15%，66.8%，82.6%，90.1%，97.8%，98%，99%；茵陳水溶性提取物溶液不同藥物濃度時(2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1)對HEL細胞的細胞存活率分別為18.6%，51.7%，81.8%，87.5%，90.8%，98%，100%。用統計學軟件SPSS11.5的Probit回歸法,計算藥物的半數毒性濃度TC50分別為98.8mg・L-1和904.49mg・L-1。

22GCV及中藥對巨細胞病毒增殖的抑制作用

HCMV對HEL的CPE的表現為細胞腫脹,變大變圓,折光性改變,胞漿內顆粒增多。將GCV以50,25,12.5,6.25，3.2mg・L-1;茵陳水溶性提取物溶液以500，250，125，63，32mg.L-1進行抑制HCMV實驗,大于32mg.L-1濃度的茵陳水溶性提取物溶液均表現出較強的抑制病毒對細胞的病變作用。經統計分析,5種不同濃度下茵陳水溶性提取物溶液均具有抗病毒作用,結果見表1。用統計學軟件SPSS11.5的Probit回歸法,計算出GCV、茵陳水溶性提取物溶液對HEL細胞的半數有效濃度(IC50)分別為9.6mg・L-1,195.11mg・L-1。同時,采用前述的公式可計算出GCV、茵陳水溶性提取物溶液對HEL細胞的治療指數(TI)分別為10.29,4.64。

表1GCV和茵陳水溶性提取物溶液抗巨細胞病毒效應（測定OD值）（略）

注：與病毒對照組比較，*P<0.05。

23茵陳水溶性提取物溶液及GCV抗巨細胞病毒作用的比較

在IC50下,檢測茵陳水溶性提取物溶液和GCV抗巨細胞病毒的作用。經比較,發現茵陳水溶性提取物溶液的抗巨細胞病毒作用(A值)與GCV組比較差異均有顯著性(P<0.05),且GCV組的平均A值高,表明茵陳水溶性提取物溶液抗HCMV作用較GCV弱。結果在IC50下GCV(9.6mg・L-1)、茵陳水溶性提取物溶液(195.11mg・L-1)的抗巨細胞病毒作用(測得A值)分別為(0.711±0.003),(0.663±0.004),P<0.05。在IC50下,GCV和茵陳水溶性提取物溶液對HCMV的抑制率分別為58.7%和42%。

病毒抑制率=（藥物處理組OD值-病毒對照組OD值）/（細胞對照組OD值-病毒對照組OD值）×100%

24不同藥物致HEL的形態學變化

細胞培養96h后，IC50下,光學倒置相差顯微鏡下可見：細胞對照組細胞貼壁生長，增殖活躍，細胞成梭型緊密排列，有極少量圓形增殖細胞，見圖1；病毒對照組大量細胞變圓并脫離瓶壁，還可見到少量細胞碎片，僅少量細胞貼壁，無增殖細胞，見圖2；茵陳水溶性提取物+病毒組大部分細胞貼壁生長，見一些圓型細胞在液體中漂浮，約45%細胞變成圓型或發生腫脹，其余貼壁細胞未見異常變化，見圖3；更昔洛韋+病毒組細胞均貼壁生長，約20%細胞變成圓型或發生腫脹，其余細胞未見明顯異常變化，見圖4。4組細胞的形態學改變形象表明茵陳水溶性提取物具有抗HMCV的效用，其對HMCV的抑制作用較更昔洛韋弱。

圖1細胞對照組(×40)（略）

圖2病毒對照組(×40)（略）

圖3茵陳+病毒組(×40)（略）

圖4更昔洛韋+病毒組(×40)（略）

3討論

中藥茵陳為菊科植物茵陳蒿(ArtemisiacapillarisThunb)或豬毛蒿(ArtemisiaScopariaWaldst.etKit.又名濱蒿)的干燥地上部分,首載于《神農本草經》,性微寒,味苦、辛。有清熱利濕,利膽退黃的功效。主要用于黃疸尿少,濕瘡瘙癢,傳染性黃疸型肝炎等癥,是臨床上常用的保肝中藥。近年來有關茵陳的化學成分及藥理作用的研究報道甚多,一些新的有效成分及藥理作用不斷被發現,茵陳除具有利膽保肝的作用外,還具有抗病原微生物、抗癌、降血脂、抗動脈粥樣硬化(AS)、興奮平滑肌等多方面的活性。復方茵陳一直都是解放軍302醫院乙型肝炎治療的首選藥物。

本研究的體外實驗證明,茵陳水溶性提取物溶液能有效抑制HCMV在細胞內的繁殖。其半數有效濃度為195.11mg・L-1,治療指數為4.64。與病毒組比較,有顯著性差異(P<0.05)。茵陳水溶性提取物溶液在半數有效濃度時,表現出較強抑制病毒對細胞的病變作用,且隨藥物濃度的增高抑制作用增強。實驗還顯示茵陳水溶性提取物溶液在32~500mg・L-1濃度時對巨細胞病毒均有明顯抑制作用，說明該藥的有效濃度范圍寬，使用安全范圍大。

姚艷紅等［6］研究表明茵陳可抑制2.2.15細胞HBsAg和HbeAg的復制和表達,對細胞培養上清和細胞內DNA復制有抑制作用，該藥在抗HCMV國內外尚無報道。本研究表明,茵陳單體溶液能有效抑制HCMV在細胞內的繁殖。姚艷紅等［6］研究認為該藥抗乙肝病毒的作用機理可能是抑制細胞內的DNA復制。該藥抗HCMV機制可能與之有相似之處，但仍需深入研究。

綜上所述,茵陳水溶性提取物溶液抗HCMV的效應盡管比更昔洛韋弱，但其作為中草藥提取物有著價位低、毒副作用小、口服方便、長期使用不易耐藥等特點，本實驗已經證實了茵陳水溶性提取物溶液對HCMV有較明顯的抑制作用，待深入研究其抗病毒的作用機理和進行動物實驗研究取得療效后，該藥可推廣到臨床進行預防HCMV感染和治療CMV病，對腎移植術后巨細胞病毒感染的防治也將取到積極作用。

參考文獻

1KazoryA,DuclouxD,CoaquetteA,etal.Cytomegalovirusassociatedvenousthromboembolisminrenaltransplantrecipients:areportof7cases.Transplantation,2004,77(4):597~599.

2PalmerSM,GrinnanDC,DianeReamsB,etal.DelayofCMVinfectioninhighriskCMVmismatchlungtransplantrecipientsduetoprophylaxiswithoralganciclovir.ClinTransplant,2004,18(2):179~185.

3LimayeAP,CoreyL,KoelleDM,etal.EmergenceofganciclovirresistantCMVdiseaseamongrecipientsofsolidorgantransplant.Lancet,2000,356(9230):645~649.

4黃禎祥，主編.醫學病毒學基礎及實驗技術.科學出版社,1990，267.

5孫瑞元，主編.數學藥理學新論.人民衛生出版社，2004，49~50.

6姚艷紅,趙艷玲,山麗梅,等.復方茵陳片對乙肝病毒HBsAg和HbeAg表達的影響.抗感染病學,2004,1(3):127~128.