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【關鍵詞】卵巢癌；免疫組織化學；原位分子雜交；

摘要：為探討抑癌基因 pten表達在卵巢癌發生和演進中的作用及其與uPA、MMP2的相互關系，對8例正常上皮來源的卵巢組織、18例卵巢交界性腫瘤、60例上皮性卵巢癌石蠟切片組織，應用免疫組織化學SP法檢測PTEN蛋白、MMP2蛋白的表達，分子原位雜交法檢測uPA蛋白的表達。結果顯示，PTEN在正常卵巢、卵巢交界性腫瘤、上皮性卵巢癌中的陽性表達率分別為87.50%（7/8）、50.00%（9/18）、23.33%（14/60），PTEN的陽性表達率在上皮性卵巢癌中低于正常卵巢、卵巢交界性腫瘤，差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)；I/II期陽性表達率37.50%明顯高于III/IV期的13.89%（P<0.05）；卵巢內膜樣癌PTEN陽性表達率7.14%，顯著低于漿液樣34.78%或黏液樣囊腺癌44.44%（P<0.05）。PTEN表達與uPA表達呈負相關（P<0.05），與MMP2表達呈負相關（P<0.01）。

關鍵詞：卵巢癌；免疫組織化學；原位分子雜交；

PTEN腫瘤的發生與多種癌基因及抑癌基因的異常激活、表達有關，腫瘤的侵襲和轉移是一多步驟、多因素參與的極其復雜的過程，涉及腫瘤細胞的黏附、分離、遷移，基底膜及細胞外基質的降解，腫瘤新生血管生成的諸多方面。PTEN是迄今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，在生長因子的細胞信號傳遞中起著復雜而重要的作用，通過抑制細胞有絲分裂、誘導細胞凋亡、參與調節細胞的黏附、轉移和分化等發揮抑癌基因的作用。尿激酶型纖維蛋白激活系統（uPA）通過水解纖溶酶原轉變為纖溶酶降解細胞外基質進而使腫瘤不斷浸潤和擴散。金屬基質蛋白酶(MMPs)是降解細胞外基質組分時最重要的一大分子蛋白。我們應用免疫組化、分子原位雜交技術檢測正常卵巢、卵巢交界性腫瘤和上皮性卵巢癌中PTEN、uPA、MMPs的表達，探討其在卵巢癌發生及演進中的作用及其在卵巢癌預后評估中的意義。

1材料和方法

11標本來源

研究標本86例取自武漢市第八醫院1999年~2005年病理存檔的石蠟標本，所有手術患者術前均未接受過放療、化療或激素治療，診斷均經常規病理切片證實。患者年齡32~65歲，中位年齡48歲。正常上皮來源的卵巢組織8例，卵巢交界性腫瘤18例，上皮性卵巢癌60例（其中漿液性囊腺癌23例，黏液性囊腺癌9例，卵巢內膜樣癌28例；高~中分化卵巢癌25例，中~低分化卵巢癌35例；按FIGO分級，I/II期24例，III/IV期36例；卵巢癌伴淋巴結轉移15例，無淋巴結轉移45例）。

12實驗試劑

鼠抗人PTEN單克隆抗體、尿激酶型纖溶酶型活化因子即用型原位雜交試劑盒、鼠抗人MMP2單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司。

13方法

石蠟塊標本制成4μm厚的切片，免疫組織化學染色程序按SP試劑盒說明進行，PBS代替一抗作陰性對照，已知乳腺癌陽性片作陽性對照。PTEN陽性表達為淡黃色至棕褐色物質，定位于細胞漿，高倍鏡下每張切片選5個視野，每個視野記數100個細胞。(-)：<25%;(+)：>25%。MMP2以細胞出現棕黃色顆粒為陽性判定標準，MMP2表達的判定以染色強度和陽性細胞百分率的得分之積進行評估。（-）：0；（+）：1~3；（++）：4~6；（+++）：7~9。分子原位雜交按試劑盒說明，以未加入探針的預雜交液代替探針作為空白對照，已知乳腺癌陽性片作陽性對照。每張切片在高倍鏡下隨機選取10個視野，計算各實驗陽性細胞的平均百分數，陽性染色均為細胞質著色呈棕黃色顆粒。根據著色范圍劃分，（-）：無陽性染色細胞或著色率<5%；（+）：陽性細胞數5%~25%；（++）：陽性細胞數25%~50%；（+++）：陽性細胞數>50%。

14統計學處理

所有數據采用CS2000軟件包分析，根據適用條件以Pearson未校正法或Yates校正法計算χ2值,或直接用確切概率法計算P值。PTEN、upa與mmp2的表達關系采用配對四格表的相關分析Yates校正法。

2結果

21PTEN在正常卵巢、卵巢交界性腫瘤、上皮性卵巢癌中的表達

PTEN在正常卵巢、卵巢交界性腫瘤、上皮性卵巢癌中的陽性表達率分別為87.50%（7/8）、50.00%（9/18）、23.33%（14/60），PTEN的陽性表達率在上皮性卵巢癌中低于正常卵巢、卵巢交界性腫瘤，差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。

22PTEN表達與卵巢癌臨床病理分期的關系

PTEN表達與卵巢癌的臨床病理分期呈負相關（P<0.05），I/II期陽性表達率高于III/IV期，差異有顯著性。在卵巢癌的組織類型中，卵巢內膜樣癌PTEN表達最低，顯著低于漿液樣或黏液樣囊腺癌（P<0.05）。PTEN表達與卵巢癌的分化程度及有無淋巴結轉移無明顯相關（P>0.05）。

23卵巢癌組織PTEN表達與uPA、MMP2表達的關系

uPA表達陽性的卵巢組織中，PTEN的表達率為16.67%（8/48）；uPA表達陰性的卵巢組織中，PTEN的表達率為50.00%（6/12），兩者的表達呈負相關（P=0.0394<0.05，R=-0.3152）；MMP2表達陽性的卵巢組織中，PTEN的表達率為15.38%（8/52）；MMP2表達陰性的卵巢組織中，PTEN的表達率為75.00%（6/8），兩者的表達呈負相關（P=0.0011<0.01，R=-0.4791）。表1卵巢癌PTEN的表達與臨床病理特征及與uPA、MMP2蛋白表達的關系

3討論

腫瘤抑制基因PTEN在細胞凋亡、遷移和腫瘤演進中發揮作用。目前，研究發現PTEN通過突變、雜交性缺失（LOH）、過甲基化、微衛星不穩定或轉錄抑制等遺傳學改變，導致PTEN基因表達"沉默"［1］。PTEN基因的突變和純合性丟失見于多種原發性惡性腫瘤，包括子宮內膜癌、膠質母細胞瘤、腎癌、前列腺癌、卵巢癌等，提示其與多種腫瘤的發生、發展關系密切。PTEN基因定位于染色體10q23.3上［2］，其編碼的產物PTNE蛋白是由403個氨基酸組成的一條多肽鏈［3］，有四個結構域，具有蛋白磷酸酶和脂磷酸酶的雙重特異活性。PI3K/PIP3/Akt胞內信號傳導通路對細胞的分裂周期起著正性調控作用，經一系列級聯反應最終促使細胞有絲分裂增強，凋亡受到抑制［4］。PTEN的磷酸酶活性促使PIP3的3''''位點脫磷酸化，抑制依賴PIP3激活的絲、蘇氨酸激酶PKB/Akt活性，影響其下游通路的作用靶因子，包括BAD、G1期CDK抑制因子P27、翻譯抑制因子4EBP1等的磷酸化水平，從而誘導凋亡，并介導G1期停頓，影響基因的表達，從而抑制細胞增殖。MARK信號通路能活化cfos、TCF、CJun等核轉錄因子而促進細胞分裂增生，PTEN對MAPK通路的多種上游信號分子具有去磷酸化調節的作用，影響細胞生長［5］。FAK是整合素信號傳導通路的關鍵性調控因素，引起細胞基質局部粘附以及細胞骨架蛋白的組裝。PTEN能對FAK及其通路中多種信號分子予以脫磷酸化調節，影響其正常信號傳導，導致細胞局部粘附和運動遷移功能受到抑制［6］。

本研究結果顯示，PTEN表達在卵巢癌發生過程中逐漸降低，提示PTEN基因表達在卵巢癌發生中作為早期分子事件發揮重要作用。PTEN表達與卵巢癌的臨床病理分期呈負相關，提示PTEN表達下調可能與卵巢癌的演進關系密切。在卵巢癌的組織類型中，卵巢內膜樣癌PTEN表達水平顯著低于漿液性或黏液性囊腺癌，提示PTEN基因與卵巢內膜樣癌的發生和病理生物學行為關系更為密切，支持起源于異位子宮內膜的卵巢內膜樣癌的發生途徑與其他卵巢上皮源性癌不同的觀點。

尿激酶型纖維蛋白激活系統（uPA）在腫瘤的侵襲轉移中起重要的調節作用。uPA與uPAR結合，降解ECM等主要結構成分，還與整合素結合形成uPAR整合素復合物［7］，在Caveolin蛋白的協助下，將細胞外的信號傳遞至細胞內，Src家族的酪氨酸酶的磷酸化及焦點粘附激酶（focaladhesionkinase,FAK）酪氨酸磷酸化等，最終通過細胞骨架蛋白重排，促進細胞增殖、遷移。ECM降解后，釋放大量儲存于ECM的生長因子，VEGF、FGF等與受體結合后直接刺激腫瘤及腫瘤新生血管形成，并上調內皮細胞表達uPA/uPAR，形成正反饋調節環，極大增加uPA產物，為內皮細胞遷移、增殖及腫瘤新生血管形成創造有利的微環境。本實驗證明卵巢癌中PTEN和uPA的表達呈負相關。PTEN對uPA的影響為下調FAK等的磷酸化水平，阻斷整合素介導的細胞局部粘附與遷移，此外，PTEN通過影響VEGF的信號傳導通路及下調VEGF的轉錄表達，降低了正反饋調節環作用，不利于uPA作用的腫瘤增殖、新生血管形成、遷移等。近來研究表明，轉化生長因子TGFβ1與腫瘤細胞的侵襲能力呈正相關［8］。Tanaka等［9］認為TGFβ1通過兩種不同的（SrcMAPKPI3KNFκB依賴的和SrcMAPKAP1依賴的）信號途徑上調uPA的表達。由此而來，PTEN通過此途徑下調uPA的表達。

金屬基質蛋白酶(MMPs)為腫瘤侵襲另一重要因素，它們幾乎能降解細胞外所有成分。本實驗證明卵巢癌中PTEN和MMP2的表達呈負相關。MMP2的表達調控受磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）途徑和有絲分裂原激活蛋白（MAPK）途徑共同調節［10］，因此不難理解PTEN對MMP2的負調節作用。

總之，在卵巢癌的發生及演進過程中，PTEN基因表達降低是一個重要的分子事件。對PTEN作用機制與功能的全面認識，將會為腫瘤的早期診斷和預后提供新的指標，為腫瘤的臨床治療開辟新的思路。PTEN與其它癌基因/抑癌基因調控網絡間的關系有待進一步闡明。

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