線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注鼠模型的腦水腫和腦梗死比的變化

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【關(guān)鍵詞】大腦中動(dòng)脈閉塞；局灶性腦缺血/再灌注；腦水腫；

摘要：目的：探討短暫性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注模型的腦梗死比和腦水腫的變化。方法：線栓法制作大鼠腦缺血/再灌注不同時(shí)間點(diǎn)模型，行TTC染色測(cè)量腦梗死比及干濕稱重法測(cè)量腦含水量。結(jié)果：腦缺血再灌注6h時(shí)大鼠腦組織即有含水量的增加，并隨著時(shí)間的推移呈上升趨勢(shì)，且未損傷側(cè)中段腦組織含水量升高最為顯著。TTC染色在缺血再灌注6h即可見白色梗死灶，梗死比在再灌注72h內(nèi)逐漸增加。結(jié)論：局灶性腦缺血再灌注72h內(nèi)腦梗死比和腦水腫均呈進(jìn)行性加重。

關(guān)鍵詞：大腦中動(dòng)脈閉塞；局灶性腦缺血/再灌注；腦水腫；

腦梗死比缺血性腦損傷（ischemiabraininjury）是危及患者生命的疾病之一。而腦缺血及再灌注引起的腦水腫（hydrocephalus）是影響病人急性期與亞急性期生存的重要因素。較大面積的缺血因腦水腫致病變腦組織體積急劇增大，可誘發(fā)腦疝。缺血后的腦水腫被認(rèn)為是加重腦缺血原有病變，導(dǎo)致腦疝及危及患者生命的主要原因［1~3］。另外，血腦屏障（bloodbrainbarrier,BBB）破壞也是缺血性中風(fēng)繼發(fā)出血的原因，而這也是患者死亡的原因之一。目前缺血后BBB破壞引起血管源性腦水腫（vasogenicbrainedema,VBE）及其對(duì)缺血病變進(jìn)展的影響尚未引起足夠的重視。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步明確局灶性腦缺血再灌注后腦水腫的時(shí)程變化，為臨床診治提供參考資料。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

SD大鼠56只（由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），SPF級(jí)，雄性，體重280～320g。隨機(jī)分為空白組（n＝8）、假手術(shù)組（n＝8）和缺血再灌注組2h、6h、12h、24h、48h每組各8只。尼龍線為上海申丁實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，TTC為Amresco公司（美國(guó)）生產(chǎn)。其余試劑均為市售。

12栓線的制備

采用6cm長(zhǎng)3/0單股尼龍線，用記號(hào)筆在雙側(cè)距頭端18mm、20mm和22mm點(diǎn)分別作標(biāo)記，然后浸入肝素鈉（12500單位）中浸泡30min后晾干備用。

13右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）局灶性腦缺血再灌注改良模型的建立

采用longa法，略有改良。采用10％水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，頸部正中略偏右側(cè)長(zhǎng)約2cm的豎直切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。用6/0絲線結(jié)扎CCA近心端和ECA起始端，在CCA遠(yuǎn)心端和ICA起始端各置6/0絲線備用，用眼科剪在CCA近心端和遠(yuǎn)心端之間距離頸總動(dòng)脈分叉約5mm處剪一個(gè)小口，經(jīng)CCA插入3/0尼龍線至大腦中動(dòng)脈起始段，插入深度為19.5±0.5mm；術(shù)中維持體溫37.0±0.5℃。術(shù)后兩小時(shí)用乙醚再次麻醉老鼠后將尼龍線輕輕拔退約1cm，此時(shí)記為再灌注0h。假手術(shù)插線深度為10mm，余同實(shí)驗(yàn)組。空白組不作任何處理。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，進(jìn)食顆粒食物。剔除術(shù)中出血較多、呼吸困難、取腦時(shí)有蛛網(wǎng)膜下腔出血及提前死亡的大鼠。

14神經(jīng)功能缺損評(píng)分

動(dòng)物缺血2h待蘇醒后,按ZeaLonga方法評(píng)定神經(jīng)功能缺損現(xiàn)象。0分:無(wú)任何神經(jīng)功能缺失體征；1分:未損傷側(cè)前肢不能伸展；2分:向未損傷側(cè)行走；3分:向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀；4分:意識(shí)障礙,無(wú)自主行走［4］。動(dòng)物評(píng)分在1～3分之間為造模成功,否則棄之不用。

15紅四氮唑（TTC）染色確定梗死效果

每組取4只大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，從前額極開始行冠狀切片，片厚約2cm，置入2％TTC水溶液中，37℃避光孵育30min后，用眼科鑷分離白色區(qū)(梗死區(qū))和紅色區(qū)(正常區(qū)),分別稱取重量,計(jì)算梗死比。梗死比(%)=白色區(qū)重量/(白色區(qū)重量+紅色區(qū)重量)［5］。

16腦含水量的測(cè)定

剩余每組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉后斷頭取腦，以視交叉前2mm和乳頭體為標(biāo)志冠狀切為前、中、后三段，每段分為健側(cè)和患側(cè)。萬(wàn)分之一電子分析天平稱取腦濕重,置100℃烤箱中烘烤至恒重（即兩次測(cè)量重量相同）時(shí)稱取腦干重,按公式:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重,測(cè)算出腦組織的含水量［6］。

17統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

組間行單因素方差分析，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2結(jié)果

21神經(jīng)病學(xué)表現(xiàn)

缺血組所有動(dòng)物在麻醉清醒后均出現(xiàn)不同程度的偏癱，缺血再灌注組每只大鼠在麻醉清醒后均出現(xiàn)左前肢不能伸展，其中15只大鼠出現(xiàn)向左側(cè)行走的癥狀，18只大鼠出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈的癥狀，平均評(píng)分為2.28分；而假手術(shù)組和空白組未出現(xiàn)任何神經(jīng)功能缺損癥狀，平均評(píng)分為0分。缺血再灌注組與空白組和假手術(shù)組間差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05；P<0.05）。

22TTC測(cè)量梗死比（％）

正常組織經(jīng)TTC染色呈紅色，而梗死組織呈白色。空白組和假手術(shù)組經(jīng)TTC染色后均未見有白色梗死灶（圖1、2），其梗死比為0；缺血再灌注12h即可見有白色梗死灶形成(圖3)，隨著再灌注的進(jìn)行，白色梗死灶區(qū)域逐漸增大(圖4)，梗死灶主要分布于損傷側(cè)頂葉皮質(zhì)，部分額葉皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)。缺血再灌注組與空白組和假手術(shù)組間的梗死比的差異均具有顯著性（P<0.01；P<0.01），再灌注各組間差異均具有顯著性（P<0.01）。其梗死比的時(shí)程變化見圖51。表1各組大鼠腦梗死比的比較

23腦含水量（％）的測(cè)定

正常大腦外觀左右兩側(cè)對(duì)稱，背側(cè)表面血管呈淡紅色，左右分布大體均一。損傷1d和2d，肉眼可見右側(cè)腦組織腫脹明顯，MCA供血區(qū)組織蒼白。各組腦組織含水量的變化如表2所示，缺血再灌注各組損傷側(cè)腦組織含水量明顯高于未損傷側(cè)（P<0.05），且損傷側(cè)中段腦組織水腫最為突出。如圖52我們可以看到各部位腦水腫的時(shí)程變化，在腦缺血再灌注2h后腦組織含水量開始增加，在再灌注48h時(shí)增加比較明顯，并持續(xù)至再灌注72h。再灌注各組間差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。表2各組大鼠各腦段不同時(shí)段含水量（％）的比較注：*：與空白組比較，P<0.01；#：與前一組比較，P<0.05；##：與前一組比較，P<0.01。

3討論

31建模的改進(jìn)

在腦血管疾病的研究中，動(dòng)物模型是研究缺血性腦損傷必不可少的方法，模型成功與否關(guān)鍵在于腦梗塞部位與范圍的恒定，重復(fù)性好，并且病理生理過(guò)程盡可能模擬人的發(fā)病過(guò)程。臨床上出現(xiàn)較多的就是頸內(nèi)動(dòng)脈系的大血管栓塞造成的缺血性腦損傷，其中大腦中動(dòng)脈栓塞較為多見。因此本實(shí)驗(yàn)采用線栓法閉塞大腦中動(dòng)脈所致的局灶性腦缺血與臨床腦缺血的病理過(guò)程類似，具有一定的參考價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用longa線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈閉塞所致的缺血性腦損傷模型，并有了以下改進(jìn)：①采用略偏右側(cè)切口。此種切口更容易暴露頸動(dòng)脈鞘，且可以避免從氣管旁分離血管，從而可以避免刺激氣管而造成呼吸道分泌物增加，改善了術(shù)后生存質(zhì)量。②栓線的預(yù)處理。本實(shí)驗(yàn)所用栓線事先經(jīng)肝素浸泡，一者可以軟化栓線，避免因栓線過(guò)硬造成插線時(shí)刺破血管，二者可以減緩血液在栓線頭端凝固而減輕拔線的困難度。③拔線時(shí)的二次麻醉。拔線時(shí)用乙醚麻醉可以避免大鼠因拔線的痛苦而掙扎從而增加死亡率，而且乙醚麻醉為吸入麻醉，起效快，蘇醒快，可以避免因水合氯醛二次麻醉不易掌握劑量而造成麻醉意外，也可以減短動(dòng)物的麻醉時(shí)間，增加術(shù)后生存質(zhì)量。此外，本實(shí)驗(yàn)采用單一性別的大鼠可以避免雌激素的干擾，因?yàn)榇萍に貙?duì)梗死灶的大小有影響，同時(shí)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中剔除術(shù)中呼吸困難，出血較多，取腦時(shí)有蛛網(wǎng)膜下腔出血和提前死亡的大鼠，可以避免人為誤差，增加模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

32腦梗死比

腦代謝非常活躍，對(duì)血流和氧的需要量很高，而且?guī)缀鯖]有葡萄糖和氧的儲(chǔ)備，完全依賴血流供給葡萄糖和氧氣，供應(yīng)相應(yīng)腦組織區(qū)的某支大的動(dòng)脈一旦閉塞，就會(huì)造成局部腦損傷［1］。通常急性腦梗死病灶由中心壞死區(qū)及周圍的缺血半暗帶（ischemicpenumbra）組成。壞死區(qū)由于完全性缺血導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡，為不可逆損傷；而缺血半暗帶仍存在側(cè)支循環(huán)，可獲得部分血液供應(yīng)，且神經(jīng)元死亡方式主要為凋亡，尚存在大量可存活的神經(jīng)元，因此對(duì)于該區(qū)的腦組織，如果能夠及時(shí)中和由死亡的細(xì)胞釋放的毒性代謝產(chǎn)物和恢復(fù)血供，則可能獲得挽救［8，9］。在本實(shí)驗(yàn)中，由腦梗死比測(cè)量結(jié)果可以看出，再灌注各組腦梗死比與空白組和假手術(shù)組間均有差異，且腦梗死比在再灌注72h內(nèi)呈逐漸增加的趨勢(shì)，提示除了恢復(fù)血供外可能尚需要其它的處理措施。目前相關(guān)研究認(rèn)為MMP29［5］、MMP3、TIMP3［15］等的表達(dá)與腦梗死比高度相關(guān)，這為缺血性腦損傷發(fā)生后早期防止腦梗死體積的增大提供了一定的參考價(jià)值。

33腦水腫

通常腦水腫是指腦組織含水量增加所引起的腦體積增大，它有3種類型：細(xì)胞毒性腦水腫、血管源性腦水腫和混和性腦水腫。腦缺血再灌注后的腦水腫是一種細(xì)胞毒性和血管源性腦水腫的混和型。細(xì)胞毒性腦水腫在缺血性腦卒中時(shí)即刻發(fā)生，是由于急性腦缺血死亡細(xì)胞釋放的細(xì)胞毒性物質(zhì)引起，繼發(fā)于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，這個(gè)階段全腦體積下降。隨著缺血再灌注的進(jìn)行，由于各種分子生物學(xué)機(jī)制導(dǎo)致血腦屏障（bloodbrainbarrier,BBB）的開放或破壞，引起血漿成分外滲至細(xì)胞外間隙，出現(xiàn)血管源性腦水腫（vasogenicbrainedema,VBE）。血管源型水腫伴有細(xì)胞外液體聚積，發(fā)生在梗死后24～48h［12］。當(dāng)出現(xiàn)大面積的腦水腫可導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高，使得血管受壓阻塞、管腔變窄，引起腦循環(huán)機(jī)能障礙，形成缺血、水腫和顱內(nèi)高壓惡性循環(huán)，甚至發(fā)生腦疝危及生命。如在腦梗死超早期給予溶栓治療，可以減輕腦損傷，改善腦梗死患者的預(yù)后，而溶栓也就是再灌注的過(guò)程，它可以通過(guò)氧自由基的釋放、興奮性氨基酸的作用等而引起非缺血性、缺氧性的損傷而加重原有的損傷，加重病情。

根據(jù)文獻(xiàn)指出［13、14］，腦組織含水量增加的多少，反映腦水腫的程度。從本實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織含水量的變化結(jié)果可以看出，正常鼠腦的含水量約為7454%，在再灌注6h時(shí)含水量即有增加(7623%)，隨著再灌注的進(jìn)行，含水量逐步增加，在再灌注12h時(shí)顯著增加，再灌注48h～72h達(dá)到高峰，這說(shuō)明在72h內(nèi)腦水腫程度都是呈進(jìn)行性加重，這與其他結(jié)果也是相類似的［13］。此外，水腫部位位于損傷側(cè)，以中段為主，也就是大腦中動(dòng)脈供應(yīng)區(qū)域?yàn)橹鳎磽p傷側(cè)未出現(xiàn)明顯水腫，因此導(dǎo)致一側(cè)腦容積增大，顱內(nèi)壓力不均衡，如果損傷側(cè)水腫過(guò)于嚴(yán)重，就會(huì)因?yàn)閴毫Σ疃l(fā)腦疝，危及患者生命。

本實(shí)驗(yàn)中，空白組和假手術(shù)組均未見腦梗死和腦水腫，缺血再灌注組則在再灌注72h內(nèi)隨著時(shí)間的推移梗死比和腦水腫逐漸加劇。當(dāng)缺血持續(xù)時(shí)，缺血中心區(qū)域逐漸擴(kuò)大，半暗帶的可逆損傷也逐漸變?yōu)椴豢赡鎿p傷，因此出現(xiàn)了梗死比逐漸增加的結(jié)果。急性腦缺血后死亡細(xì)胞釋放的細(xì)胞毒性物質(zhì)可以引起細(xì)胞毒性腦水腫，因此在缺血的同時(shí)死亡細(xì)胞的不斷增加也不斷加重細(xì)胞毒性腦水腫，同時(shí)由于各種分子生物學(xué)機(jī)制導(dǎo)致血腦屏障（bloodbrainbarrier,BBB）的開放或破壞，引起血漿成分外滲至細(xì)胞外間隙，出現(xiàn)血管源性腦水腫（vasogenicbrainedema,VBE），所以腦水腫在72h內(nèi)呈加重趨勢(shì)。腦梗死區(qū)血流再通后氧與葡萄糖供應(yīng)及腦代謝恢復(fù)，腦組織損傷理應(yīng)得到恢復(fù)。然而，實(shí)際上并非如此，這是因?yàn)榇嬖谠俟嘧p傷（reperfusiondamage）。目前認(rèn)為再灌注損傷的機(jī)制可能為：①毛細(xì)血管水平無(wú)復(fù)流或不再流現(xiàn)象；②細(xì)胞膜與線粒體受損引起鈣超載；③缺血后白細(xì)胞粘附引起局部血流環(huán)境改變，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變形，毛細(xì)血管狹窄、痙攣；④氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞損傷［10，11］。腦缺血再灌注后繼發(fā)的腦水腫，會(huì)降低腦的灌注壓，損害毛細(xì)血管和增大氧氣從血液彌散到細(xì)胞的距離，從而進(jìn)一步加重原有的腦缺血改變。

缺血半暗帶和再灌注損傷概念的提出更新了急性腦梗死的臨床治療觀念，搶救缺血半暗帶的關(guān)鍵是超早期溶栓治療，減輕再灌注損傷核心是積極采取腦保護(hù)治療。本實(shí)驗(yàn)僅僅模擬了大腦中動(dòng)脈閉塞造成局灶性腦梗塞后的腦梗死比及腦水腫的變化，而對(duì)其影響因素的研究將在日后的實(shí)驗(yàn)工作中作進(jìn)一步探討。

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