切除部分Ranvier 區對骺板軟骨細胞 bcl-2和ba表達的影響

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【關鍵詞】bax

摘要:目的:探討凋亡相關基因bax、bcl-2在Ranvier區部分切除后骺板軟骨組織中的表達。方法:切除12mm長的新西蘭大耳白兔的脛骨近端Ranvier區，于術后1、4周處死實驗兔，從免疫組化方面觀察凋亡相關基因bax、bcl-2在Ranvier區部分切除后不同周齡的兔脛骨近端骺板軟骨組織中表達的變化特征。結果:隨著Ranvier區部分切除后，骨橋形成前骺板軟骨組織中的軟骨細胞凋亡率明顯低于對照組，骨橋形成后軟骨細胞凋亡率明顯高于對照組。結論:Ranvier區和骨橋對骺板軟骨細胞的凋亡率有促進作用，骨橋的促進作用更明顯。

關鍵詞:bax;bcl-2;Ranvier區;骺板

累及Ranvier區的損傷常導致骺板橫向和縱向的發育紊亂［1］，也有可能導致骨軟骨瘤等骨腫瘤的發生［2］，Ranvier區在骨發育中的作用越來越受到重視。Ranvier區的損傷對骺板軟骨細胞凋亡相關基因bax和bcl-2的表達是否有影響，目前仍然不清楚。因此，本研究利用切除Ranvier區后的骺板軟骨作為研究模型，試圖從骺板軟骨組織的整體上了解bax及bcl-2在切除Ranvier區后的骺板軟骨細胞增殖和凋亡過程中的表達，探討bax及bcl-2在切除Ranvier區后骺板軟骨細胞凋亡中的分子生物學機理。

1材料與方法

1.1動物模型制作

選用封閉群系日本大耳白兔24只，兔齡5周，體重0.5～0.7kg，隨機分為兩個實驗組，每組12只。兩個實驗組均采用一側脛骨近端骺板為實驗部位，另一側作對照組。1%戊巴比妥鈉3ml/kg靜脈麻醉，手術野常規消毒，根據兔的解剖作各實驗側膝前內側直切口，長約3cm切開皮膚皮下組織，暴露脛骨結節以上脛骨體前內側面。暴露干骺端骺板骨軟骨膜環，于骺板上方1.5mm至下方1.0mm處以小尖刀環形切除，厚約0.5mm、寬2～3mm、長度為12mm骨軟骨膜。然后結扎止血，逐層縫合組織。對照組暴露干骺端骺板骨軟骨膜環后，不作切除，全層縫合組織。分別于術后1、4處死實驗兔，每次每組處死6只。解剖出雙側脛骨。

1.2檢測方法及指標項目

1.2.1組織學觀察新鮮標本在10%中性甲醛溶液中固定1周，然后用10%EDTA室溫下脫鈣1月。冠狀面縱行剖開，制作成4μm連續石蠟切片，HE染色染色。鏡下觀察骺板損傷后的病理改變。

1.2.2bcl-2和bax表達檢測方法bcl-2、bax單克隆抗體、SP試劑盒均為武漢博士德生物技術公司產品。采用SP免疫組化染色法，按照試劑盒的操作步驟進行。400倍顯微鏡下分別觀察bcl-2和bax蛋白的表達，并計算每10個隨機高倍鏡視野中陽性細胞的表達率。1.3統計學處理應用SPSS11.5統計軟件包進行統計，采用方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1骺板損傷后的病理演變術后1周:RG切除區由開始纖維化的肉芽組織覆蓋，骺板外側軟骨細胞增生帶明顯增厚。有薄層骨質從二次骨化中心緊貼骺板外緣向下爬行至骺板外側軟骨細胞增生帶，肥大帶向下延長，骺板呈向下彎曲現象（圖1A）。術后4周:RG切除區由纖維結締組織覆蓋，骺板外緣的骨質明顯增厚，覆蓋整個骺板，骺板外側軟骨細胞較一周時細胞數量明顯減少，并向下延續形成一條由增生、肥大及鈣化軟骨細胞組成的軟骨帶（圖1B）。

2.2bcl-2蛋白的表達結果bcl-2蛋白在細胞內為胞漿表達，光鏡下呈現棕黃色顆粒，正常細胞表達程度較強而凋亡細胞表達程度較弱或不表達。本實驗1W切除組bcl-2蛋白表達的細胞數量多，顏色深，呈強表達（圖2A）;對照組則表達細胞數少，且色澤淺，呈弱表達（圖2B）;1W切除組的陽性表達率為41.53%，對照組的陽性表達率為32.46%，兩者的差異具有顯著性（χ2=14.32，P<0.05）。4W切除組的表達程度弱于對照組（圖2C，D）。

2.3bax蛋白的表達結果bax蛋白在細胞內表達部位及表達形態、色澤與bcl-2蛋白相同，但表達強度和意義有所區別，即正常細胞表達程度通常較弱或不表達而凋亡細胞表達程度較強。本實驗1W切除組細胞數表達且色澤淺，呈弱表達（圖3A）;對照組表達細胞數量多，顏色深，呈強表達（圖3B）。1W切除組的陽性表達率為30.44%，對照組的陽性表達率29.02%，兩者的差異不具有顯著性（χ2=8.64，P>0.05）。4W切除組的表達程度強于對照組（圖3C，D）。表1兩組骺板軟骨bcl-2和bax的RNA表達陽性率比較

3討論

早在1873年Ranvier曾描述了骨骺板周圍有一個環形切跡3］，該區包含三個不同的細胞群［4，最內層有一組密集成團的細胞，它們和骺生長板增生層上部的軟骨細胞大約在同一水平，系胚胎的原始細胞演變成能生成骨皮的前骨母細胞，骨鈣素（BGP）免疫組化定位染色陽性［5］，細胞核癌基因蛋白myc、jun免疫活性呈陽性［6］，具有成骨特性及非常活躍的增生、分裂和/或遷移的活性。該層細胞生成的骨皮除對骺板有機械支持作用外［7、8］，是否對骺板軟骨細胞的凋亡有影響，目前仍不清楚。與骺板軟骨細胞的凋亡有關的基因中，bcl-2是體內細胞重要的抗凋亡基因之一［9］。bcl-2抑制細胞凋亡，在免疫調節中發揮重要的作用，其高表達可阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，促進細胞生存。bax是bcl-2的同源基因，其過度表達可拮抗bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡。在體內bcl-2家族的成員通常以bcl-2/bax二聚體的形式發揮作用，兩者的比值決定了細胞對凋亡信號敏感性。當bcl-2/bax升高，表示細胞對凋亡信號敏感性減弱，呈現抑制凋亡作用。兩者的比例決定細胞的生死，如bcl-2過量，形成bcl-2二聚體，那么細胞就存活;如bax過量，形成bax二聚體，細胞就會凋亡［10］。本實驗首次觀察到，隨著Ranvier區部分切除后，凋亡相關基因bcl-2、bax在骺板軟骨中的表達具有數量積累的趨勢。首先，骨橋形成前在靠近Ranvier區切除部分，骺板軟骨細胞凋亡率明顯低于對照側，bcl-2表達明顯增高而bax表達差異不具有顯著性，同時，骺板軟骨基質表現出相應的增生，同一骺板的Ranvier區相對未切除側骺板軟骨細胞凋亡率較對照側沒有明顯差異。說明骺板軟骨細胞凋亡率的改變與局部細胞或炎性因子有關。其次，骨橋形成后軟骨細胞凋亡率明顯高于對照側，切除組較對照側bcl-2表達降低而bax表達增高，其軟骨細胞凋亡率明顯增高，說明骨橋引發骺板軟骨細胞凋亡，引起bcl-2與bax表達改變。研究表明參與軟骨細胞的凋亡進程的細胞因子中，目前研究較多的NO、PGE2、TNF-α、IL-l等炎性因子多抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞的凋亡。僅甲狀旁腺激素相關肽（para-thyroidhormone-relatedpeptide，PTHrP）等既抑制軟骨細胞凋亡，又促進軟骨基質表現出相應的增生，其作用最符合本實驗的觀察結果。故認為PTHrP在Ranvier區部分切除后，骺板軟骨細胞相應的凋亡率變化中，具有重要意義。Amling等［11］的研究則顯示PTHrP可以上調bcl-2的表達，并指出這一作用可能是PTHrP抑制細胞分化和凋亡的機制所在。PTHrP選擇性抑制col-Ⅹ的合成，合成col-Ⅹ是軟骨細胞分化成熟的標志，提示PTHrP可抑制軟骨細胞成熟過程［12］。PTHrP又可顯著刺激軟骨基質-蛋白多糖的合成［13］。PTHrP促進軟骨細胞增殖及合成軟骨基質同時其分化成熟的機制尚未完全明確根據本實驗的觀察結果，可以認為Ranvier區內層細胞生成的骨皮除對骺板有機械支持作用外，尚具有屏障作用，參與Ihh/PTHrP負反饋環路［14］，在骺板軟骨細胞增生層上部的水平上，阻斷PTHrP等細胞因子對軟骨細胞增殖及軟骨基質合成的促進作用，防止軟骨細胞過度增殖所致的軟骨發育不全，在保持骺板的生理發育過程中具有重要作用。其具體機制有待進一步研究。

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