吡格列酮對游離脂肪酸介導思考

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【摘要】目的研究吡格列酮對游離脂肪酸(FFA)誘導的小鼠胰島βTc3細胞凋亡的影響及其作用機制。方法以βTc3細胞為研究對象,分為對照組及FFA組(0.25,0.5,1.0mmol/L)。檢測不同濃度FFA干預后βTc3細胞的增殖抑制率、細胞周期、細胞凋亡率;檢測吡格列酮對FFA誘導的βTc3細胞凋亡的干預作用。結果FFA干預后的βTc3細胞增殖抑制率隨FFA作用時間延長、濃度增加而進行性增加。各濃度FFA干預24h后βTc3細胞周期于G1/S檢測點明顯阻滯,凋亡細胞比例增加。吡格列酮干預FFA誘導的βTc3細胞后24h,βTc3細胞周期阻滯減少,凋亡細胞比例明顯減少。結論FFA水平異常不利于胰島βTc3細胞生存,并可誘導βTc3細胞凋亡;吡格列酮有助于維護在FFA誘導下的胰島βTc3細胞的生存能力,并避免或減少其凋亡。

【關鍵詞】噻唑烷二酮類脂肪酸類菲酯化胰島糖尿病2型細胞凋亡

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofpioglitazoneonFFAinducedapoptosisofβTc3cell,apancreaticβcelllineinvitro.MethodsβTc3wassubjecttodifferenttreatmentswithablankandthreekindconcentrationsofFFA,thatwere0.25,0.5and1.0mmol/LFFA.TheMethodofMTTwasusedtomeasuretheproliferationinhibitionratesforsuccessivethreedaysafterFFAintervention.Thechangesofcellcycleweredetected24hoursaftertreatmentbyaflowcytometry.TUNELwasusedtodeterminetheapoptosisrateofcells24hoursaftertreatment.TUNELandflowcytometrywereusedtodetermineinterventioneffectofPioglitazoneontheapoptosisofβTc3cellinducedbyFFA.ResultsInhibitionofβTc3wasincreasedwithprolongedtreatmentofFFAandincreasedFFAconcentrations.FlowcytometryanalysisshowedthatcellcycleofβTc3celltreatedwithFFAofalltheconcentrationwasblockedinphaseofG1/S.ThepercentageofβTc3cellapoptosissubstantiallyincreasedduetoFFAtreatment.NoobviousabnormalchangeofcellcycleofβTc3cellandasubstantiallydecreaseofpercentageofapoptosiscellsafterpioglitazoneintervention.ConclusionAbnormalFFAlevelisextremelyharmfulforsurvivalofβTc3cellculturedinvitro,butpioglitazonecouldmaintainthesurvivingabilityofinsulinβTc3celldamagedbyFFA.

KEYWORDS:thiazolidinediones;PPARgamma;fattyacids,nonesterified;diabetesmellitus,type2;apoptosis

福建醫科大學學報2008年7月第42卷第4期程惠希等：吡格列酮對游離脂肪酸介導的βTc3細胞凋亡的干預作用2型糖尿病是糖尿病的主要類型,但其發病機制尚未闡明。迄今的研究顯示,胰島β細胞功能缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病主要病理生理基礎,而游離脂肪酸(freefattyacids,FFA)水平異常可能為重要的致病因素,長期暴露于高FFA可引起人和鼠胰島β細胞脂質過載,細胞增殖下調和凋亡增加,胰島素分泌減少[13]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferatorsactivatorreceptorsgamma,PPAR)是一類由配體激活的核內受體轉錄因子超家族成員,存在3種亞型,即PPARα、PPARβ和PPARγ。筆者既往研究顯示,PPARγ高表達可保護胰島βTC3細胞免于FFA介導的損傷[4]。噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinedionecompounds,TZD)是PPARγ的高親和力配體,也是重要的抗糖尿病藥物。筆者應用TZD類藥物——吡格列酮干預FFA對βTC3細胞的有害影響,以期進一步分析FFA水平異常介導β細胞損害的機制及為吡格列酮的抗糖尿病作用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

βTC3細胞源自轉基因小鼠的胰島素瘤細胞(福建醫科大學分子醫學中心惠贈);RPMI1640培養基(美國Gibco公司)培養,內含10％小牛血清、2mmol/L的L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素;油酸、棕櫚酸(美國Sigma公司);吡格列酮(江蘇德源藥業有限公司);甲基偶氮唑藍(MTT,廈門泰京生物有限公司);TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.2方法

1.2.1FFA制備

FFA貯備液中油酸與棕櫚酸的比例為2∶1。溶解所需劑量的油酸和棕櫚酸于99%乙醇10mL,振搖1h。每10mmol/LFFA加入0.4g/mLNaOH40μL,混勻,置于通風櫥中過夜干燥。后加入蒸餾水10mL,加熱溶液至透明皂液樣時,加入10%冷小牛血清40mL,混勻。經0.22μmCA過濾器過濾消毒后貯存于-20℃備用。

1.2.2吡格列酮配制

吡格列酮5mg用二甲亞砜(DMSO)溶解,再用DMSO溶液稀釋配置成1mmol/L的母液,過濾除菌,4℃保存,使用前用RPMI1640培養基稀釋,培養基中DMSO終濃度≤0.01％。

1.2.3MTT法測定FFA對βTc3細胞的影響

取對數生長期的βTc3細胞接種于96孔培養板,溫育24h后吸去上清液,每孔加含10%小牛血清的RPMI1640培養基180μL。繼續溫育24h后,藥物組每孔加不同濃度的FFA20μL,使其工作濃度分別為0.25,0.5,1.0mmol/L,對照組加等量的含10%小牛血清的RPMI1640培養基。反應結束前4h吸去培養上清液,每孔加5mg/mL的MTT溶液50mL。繼續培養4h后,吸去MTT溶液,每孔加入DMSO150μL充分溶解MTT還原產物。于酶標儀上檢測490nm波長光密度值(D)。測定FFA干預后12,24,48h的細胞D值,繪制各組細胞生長曲線,取各組平均值計算細胞生長抑制率。

1.2.4流式細胞儀測定βTc3細胞周期

取對數生長期的βTc3細胞接種于6孔培養板,分別設置對照組、A組(FFA0.25mmol/L)、B組(FFA0.5mmol/L)、C組(FFA1mmol/L)。培養細胞24h后以0.25％的胰蛋白酶充分消化細胞,500～1000r/min離心5min,棄去培養液。PBS3mL洗滌1次,離心去PBS,加入預冷的70％乙醇固定,4℃1h。離心棄去固定液,PBS3mL重懸5min。400目篩網過濾1次,500～1000r/min離心5min,棄去PBS。用碘化丙啶1mL染液,4℃避光30min。于流式細胞儀上檢測各組細胞周期。

1.2.5TUNEL法檢測細胞凋亡

(1)培養細胞并加不同濃度的FFA,24h后經空氣干燥后用4%多聚甲醛溶液固定,PBS洗片后,與0.3%H2O2甲醇溶液室溫孵育。(2)PBS洗片,與通透液在冰浴中孵育2min。(3)PBS沖洗2次,滴加TUNEL反應混合液50μL,對照組以PBS緩沖液取代TUNEL反應混合溶液,在濕盒中37℃孵育60min。(4)PBS沖洗3次,加入轉化劑POD50μL,在濕盒中37℃孵育30min。PBS沖洗3次,加入DAB底物溶液,室溫孵育10min。DAB顯色凋亡陽性細胞后(凋亡陽性細胞核呈棕黃色),蘇木精對比染色陰性細胞核。每份樣品于高倍鏡下隨機選取5個視野,計數100個細胞核,計算凋亡細胞百分率。

凋亡指數(%)=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%

1.2.6流式細胞儀檢測吡格列酮對細胞凋亡的干預作用

取對數生長期的βTc3細胞接種于6孔培養板,設置FFA1mmol/L組和100μmol/L吡格列酮+FFA1mmol/L組。培養細胞24h后以0.25％胰蛋白酶充分消化細胞,離心、PBS洗滌、離心,收集細胞,PBS洗滌后過濾,于流式細胞儀上檢測各組細胞周期。

1.2.7TUNEL法檢測吡格列酮對細胞凋亡的干預作用

培養細胞,設置FFA1mmol/L組和吡格列酮100μmol/L+FFA1mmol/L組,24h后同前述方法檢測βTc3細胞凋亡,計算凋亡細胞百分率。

1.3統計學處理

實驗數據以x±s表示,SPSS10.0軟件處理數據。組間差異采用方差分析,各實驗組與對照組比較采用Dunnettt檢驗,P<0.05為差別有統計學意義。

2結果

2.1MTT分析FFA誘導的βTc3細胞的增殖活性變化

不同濃度的FFA作用于βTc3細胞12,24,48h后,MTT法測定各組細胞D值。與對照組比較,FFA0.25mmol/L誘導12h后的細胞增殖活性無明顯降低(P＞0.05);0.5mmol/L和1mmol/LFFA誘導12h后的細胞增殖活性明顯降低(P<0.05);不同濃度FFA誘導24,48h后的細胞增殖活性與對照組比較均明顯降低,細胞增殖抑制率上升。FFA對于βTc3細胞的增殖抑制作用具有明顯的時間和濃度依賴性(表1)。表1FFA誘導后MTT檢測的增殖抑制率（略）

2.2流式細胞儀測定FFA誘導后24h細胞周期

0.25,0.5,1mmol/LFFA作用于βTc3細胞24h后,各濃度FFA對于細胞周期具有明顯的G1/S阻滯作用。隨濃度增加,G1期(DNA合成前期)細胞明顯增多,S期(DNA合成期)細胞明顯減少,FFA阻滯細胞周期具有明顯的濃度依賴性。與對照組比較,差別有統計學意義(表2)。1mmol/LFFA誘導的βTc3凋亡明顯,加入100μmol/L的吡格列酮干預1mmol/L的FFA誘導的βTc3細胞24h后,吡格列酮干預組的βTc3細胞的細胞周期的G1/S阻滯作用明顯減少,與未干預組比較,差別有統計學意義(P<0.05,表3)。表2FFA誘導24h后βTc3細胞周期（略）表3吡格列酮和FFA對βTc3細胞周期的影響（略）

2.3TUNEL法檢測FFA誘導的細胞凋亡

0.25,0.5,1mmol/L的FFA作用于βTc3細胞24h后,TUNEL實驗表明上述各濃度FFA均可誘導βTc3細胞凋亡,且呈明顯的濃度依賴性,與對照組相比差別有統計學意義。加入100μmol/L的吡格列酮干預1mmol/L的FFA誘導的βTc3細胞24h后,βTc3細胞的凋亡細胞比例(40.30±3.40）%,較未干預組(77.20±2.30）%明顯減少,差別有統計學意義(P<0.05,圖1)。

3討論

近年對2型糖尿病發病機制的研究已取得很大進展,多數學者認為胰島β細胞的進行性衰竭是2型糖尿病的發生發展的決定因素。但β細胞功能缺陷的機制目前尚未完全闡明。肥胖者脂肪組織分解產生的FFA明顯增加,而FFA不僅參與了胰島素抵抗的發生,也被證實可損害β細胞功能,并可導致β細胞凋亡[2,5]。PPARγ是脂肪細胞分化的重要調節因子,也是新一代的抗糖尿病藥物TZD的作用靶分子。已知FFA可作為配體與PPARγ結合,激活PPARγ,使Caspases蛋白表達增高,引起細胞凋亡[2,6],但具體途徑不明。文獻顯示,β細胞也有PPARγ表達。筆者前期研究表明,高水平的FFA對βTc3細胞的生存能力有明顯的抑制作用,表現為細胞生存率降低或出現凋亡,進一步提示FFA對胰島β細胞的損害可能是2型糖尿病患者胰島β細胞功能失代償的原因之一。

本研究中,筆者應用PPARγ的激動劑——吡格列酮干預FFA對βTc3細胞的損害,結果顯示具有明顯的保護細胞免于FFA的損害,可使βTc3細胞的凋亡明顯減少,提示吡格列酮與PPARγ結合后,抑制FFA誘導的β細胞凋亡,表明FFA與PPAR間的反應可能參與胰島β細胞的凋亡。TZD還也可限制β細胞內TG的堆積,改善這些組織的功能,并可使β細胞葡萄糖刺激的胰島素分泌有所恢復,繼而預防β細胞的凋亡。TZD可增加前脂肪細胞的分化和成熟,增加脂肪細胞的數量,儲存更多的TG,減少循環中FFA水平及非脂肪組織FFA的流入,還可以降低非脂肪組織內原有的脂肪高合成代謝,其關鍵酶表達下調,從而降低細胞內TG含量,對TG在β細胞內堆積引起的β細胞功能障礙起到保護作用[7]。筆者既往研究發現,TZD可抑制NFκB的活性保護β細胞免于TNFα誘導的細胞凋亡[8],此次研究顯示吡格列酮保護βTc3細胞免于FFA誘導的細胞凋亡，是否與抑制NFκB的活性有關值得探討。

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