小鼠前向運動精子分離采集思考

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【摘要】目的提高從小鼠附睪采集的精子中前向運動精子的比例。方法設計“雙艙培養皿”和“雙艙浮游法（B法）”采集小鼠精子,并與當前普遍采用的“常規浮游法（A法）”進行配對比較實驗。采用A,B法分別采集同一只小鼠的雙側附睪精子。結果前向運動精子活躍地從“雙艙培養皿”的內艙游出至外艙。A、B兩法分離得到的前向運動精子百分率分別為(56.83±7.23)％和(77.33±5.69)％,變異系數分別為12.72％和7.36％,差別具有統計學意義。結論“B法”能穩定顯著地提高前向運動精子的百分率,優于“A法”。

【關鍵詞】附睪精子精子能動性疾病模型動物

ABSTRACT:ObjectiveThetechniqueofmousespermcollectioniscommonusedinmanyfieldsoflifesciencecurrently.Theaimofthisresearchisinordertoimprovetheratioofforwardmotilespermcollectingfrommouseepididymides.MethodAnovel"doublechambersdish"andconvenient"doublechambersswim"methodweredesignedandcomparedwith"conventionalswimup"methodwhichisincommonusednowadays.Experimentsshowedthattheforwardmotilespermswimoutactivelyfromtheinnerchamberandtherateofforwardmotilespermincreased.Spermwascollectedfromdifferentsideofthesamemousebyusing"conventionalswimup"or"doublechambersswim"method,respectively.ResultThemeansoftherateofforwardmotilespermcollectedwere56.83％±7.23％withCV12.72％in“conventionalswimup”groupand77.33％±5.69％withCV7.36％in“doublechambersswim”group,respectively.Statisticalanalysisshowedtherearesignificantdifferencesbetweentwodatasaccordingtothepairedttest.ConclusionThe“doublechambersswim”methodcanimprovetheratiooftheforwardmotilespermstablyandobservablyandwouldbeabettermethodinmousespermcollection.

KEYWORDS:epididymis；sperm；permmotility；diseasemodels,animal

福建醫科大學學報2008年7月第42卷第4期江帆等：小鼠前向運動精子分離采集技術改良小鼠精子采集技術是受精機制研究和生殖工程中常用的實驗方法[1]。自然小鼠精液中含有結構、功能并不一致的多種精子和少量生殖道脫落細胞,只有活躍向前運動的精子（前向運動精子）具有正常生理功能,才能游到受精地點與卵細胞發生受精。因此,快速簡便地獲得高百分率的前向運動精子,是進行實驗的重要前提。目前國內外普遍采用的“常規浮游法（A法）”是將含有成熟精子的小鼠附睪尾或輸精管放在培養液里剪開,讓其中的前向運動精子浮游到培養液中[2],其收獲的前向運動精子的百分率不高且不穩定。筆者改良設計一種新型簡便的“雙艙浮游法（B法）”,并與A法進行比較。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器

35mm塑料培養皿（江蘇海門聯合塑料制品公司）,0.5mL微型塑料離心管（EP管,江蘇碧云天生物技術研究所）,20mL一次性無菌注射器（福建莆田仁德醫療器械有限公司）,血球分類計數器（福建羅源醫療器械二廠）,超凈工作臺（HFsafe1200,上海力申科學儀器有限公司）,CO2培養箱（BB16HF,上海力申科學儀器有限公司）,光學顯微鏡（BHT112,日本Olympus公司）。

1.1.2動物

8～12周齡的普通級雄性昆明小鼠，體質量18～25g（福建醫科大學實驗動物中心）。

1.1.3試劑

小鼠精子培養液M16按文獻[3]配制,配方主要成分為：NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4·7H2O，乳酸鈉,葡萄糖,青霉素,鏈霉素,碳酸氫鈉,丙酮酸鈉,氯化鈣（均為國產分析純試劑）,BSA（FractionⅤ,美國SigmaA3311）；胚胎培養級輕質礦物油（Sigma，M8410）,氯仿（廣東汕頭西隴化工廠）,生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司）。

1.2方法

1.2.1“B法”精子采集方案設計

“A法”是在直徑35mm的培養皿中央加入約1.0mL培養液形成一個液滴,液滴四周及其表面覆蓋礦物油；小鼠附睪尾放在液滴中央剪開,使精液從組織中擴散到培養液里；培養一段時間后從液滴的上層吸取懸液以收獲游出的精子（圖1A）。

本研究設計的“B法”在上述培養皿中央增加2個直徑不同的同心圓環,制成“雙艙培養皿”。內環加入培養液并使其溢出至外環形成一個大液滴,液滴覆蓋的區域構成內、外半隔斷的2個“艙”；小鼠附睪尾放在內艙中剪開,精液只在內艙中擴散,而前向運動精子則可以跨越內環而游到外艙；培養一段時間后從外艙底部吸取懸液以收獲游出的精子,大部分運動功能差及或死亡的精子將被擋在內艙而被排除（圖1B）,從而分離出前向運動精子。

1.2.2雙艙培養皿制作

用手術刀平整切下0.5mLEP管內蓋上凸出的圓環（直徑約8mm,高約3mm）,于氯仿中浸泡下緣3min左右,鑷子夾起圓環立即貼于35mm塑料培養皿中央作為內環；再從20mL塑料注射器上剪下一圈圓環(直徑約22mm,高約2mm)同法浸泡后套在內環之外作為外環,高度略矮于內環。內外2圓環組成同心圓,確認內外環都貼緊培養皿而無縫隙,即制成雙艙培養皿（圖2）,內環之內的區域稱為內艙,內、外環之間的區域稱為外艙。

1.2.3附睪尾取材

在超凈工作臺無菌條件下操作。“脊椎錯位法”處死小鼠,仰臥,酒精噴灑體表消毒,在其下腹部橫向剪開一道小口,縱向撕開,暴露腹壁肌肉,組織鑷捏起膀胱投影區上方腹壁肌肉,輕微抖動避免內臟粘連,提起后橫向剪開至腹壁兩側,充分暴露其下脂肪囊；拉出脂肪囊,暴露睪丸和附睪,鑷子夾住附睪體的尾部末端,剝離附睪尾周圍的脂肪和血管,沿鑷子夾取部位剪下雙側附睪尾,放入生理鹽水中清洗表面殘留脂肪及血污。

1.2.4精子采集

每次實驗對同一只小鼠左右兩側附睪尾分別隨機編為A、B組：A組將附睪尾置于培養皿液滴中央,采用“A法”采集精子；B組將附睪尾置于培養皿內環中,采用“B法”采集。切碎附睪尾時注意動作盡量輕巧,避免過分振動。將培養皿移入培養箱中，37℃、體積分數為0.05％的CO2培養15min后移出至超凈臺上,用1000μL可調微量移液器分別從2組吸取500μL精子懸液并裝入2個1.5mLEP管中。A組從液滴的上層吸取懸液,B組則從外艙的底部貼近內環處吸取懸液（圖1）。將EP管中的1只移回培養箱中培養等待檢查,另1只EP管的精子懸液立即進行顯微觀察與計數。

1.2.5顯微觀察與計數

用200μL可調微量移液器對EP管中的精子懸液反復吹吸數次使精子混勻,吸取40μL精子懸液滴加在載玻片上,覆蓋蓋玻片后觀察。對蓋玻片中央和四角（避免蓋玻片邊沿）的5個區域內精子進行觀察和計數。利用血球分類計數器對“前向運動精子”和“非前向運動精子”的數目進行分別計數,每片樣本計數精子總數（前向運動精子數＋非前向運動精子數）200個。

1.2.6前向運動精子百分率計算

分別計算A、B樣品的前向運動精子百分率,計算方法為：前向運動精子數（forwardmovementspermnumber,FMSN）除以精子總數（totalspermnumber,TSN）再乘以100%,即等于前向運動精子百分率（forwardmovementspermrate,FMSR）。

FMSR=FMSN/TSN×100%

1.3統計學處理

采用MicroCalOringin3.0（MicroCalSoftwareInc.）分別統計出2組前向運動精子百分率的x±s,計算變異系數（CV=Mean/SD）并繪制成柱形圖。采用配對資料t檢驗對均數進行顯著性檢驗,P<0.05為差別有統計學意義。

2結果

共進行12例配對實驗。A,B組的前向運動精子百分率均值分別(56.83±7.23)％和(77.33±5.69)％,CV分別為12.72％和7.36％。配對資料t檢驗顯示差別具有顯著統計學意義（P＜0.01）,B組顯著高于A組（圖3）。

3討論

3.12種精子采集技術的比較

小鼠精子采集技術不僅應用于直接與生殖相關的研究課題,如受精機制研究、輔助生殖醫學技術研發和生殖毒理學研究等,也是當前功能基因組學時代轉基因小鼠制備中不可或缺的實驗步驟[46]。在常用的多種活細胞分離技術中,密度梯度離心和流式細胞儀的分離純度高,但要求樣本量較大,且耗時較長,所需材料和設備昂貴。由于小鼠的原始精液量少、精子獲能時程短（60～120min）,精子離開附睪尾后將較快發生生理生化的改變。因此,與其它體細胞或大型動物的精子不同,小鼠精子的分離采集不宜采用密度梯度離心和流式細胞儀這類高技術,而是利用精子的前向運動特性,采用“浮游”法分離。但此法要求較高的操作技巧,且方法不穩定,難于獲得滿意的百分率,失敗率較高[2]。“A法”中不同狀態的多種細胞混雜在同一個“艙”里,收獲精子懸液時,一些運動功能差及或死亡精子也隨液流被吸出。基于此現狀,本研究設計“B法”以改良小鼠前向運動精子的分離采集技術。此法除了采用的培養皿與常規法有別外,整體實驗程序與常規方法一樣簡便、快速,在操作手法上甚至比常規方法更易于把握。實驗結果提示,“B法”采集到的前向運動精子百分率高于“A法”,CV明顯低于“A法”,說明“B法”得到的數據穩定性較高,且可以極顯著地提高前向運動精子的百分率。

3.2“B法”技術優勢分析

“B法”顯著提高前向運動精子比例的原因：（1）附睪尾放在內艙中,在剪碎組織和隨后將培養皿移入或移出培養箱等操作中,附睪尾被局限于相對狹小的內艙不易移動,避免造成較大的液體波動而減少非前向運動精子及其它組織碎片在培養液中隨機擴散；（2）附睪尾切開,精液流出組織后將主要在內艙中擴散。內環具有一定高度,只有前向運動精子能夠游到其頂端并跨越到外艙,而非前向運動精子絕大部分將被內環阻擋在內艙區域并逐漸沉降于內艙底部,從而實現了前向運動精子與非前向運動精子在一定程度上的區域分離。因重力的關系,游出到外艙的精子可能逐漸沉降到艙底而比較難于游回到內艙。故隨時間推移,外艙中的前向運動精子數量將有富集的趨勢；（3）在吸取精子懸液時,“B法”要求從外艙的底部貼近內環處吸取懸液,可最大限度減少內艙中產生液流,避免內艙區域中高比例的非前向運動精子被吸出。

在實際操作過程中,培養皿及其液滴難免受到一些振動,大量前向運動精子從內艙游出時也會形成微小的液體潛流,這些因素都可造成一些非前向運動精子漂浮于液滴中,在吸取懸液時被采集。因此,“B法”采集到的精子中,仍將有一部分非前向運動精子。另外,本研究為了適應多種實驗目的需要,采用了較短的分離采集時間（15min）,內艙區域中漂浮的“非前向運動精子”可能還未充分沉降,以致其中的一部分隨吸取懸液時產生的液流被吸出,從而降低了前向運動精子的百分率。這可能是本研究中平均前向運動精子百分率尚不是很高的原因。對于單純為了獲取前向運動精子進行體外受精的研究而言,可以將精子采集步驟與隨后的精子獲能步驟合二而一,故允許培養皿在CO2培養箱里停留更長時間,則將有更多的非前向運動精子充分沉降于內艙,有望進一步提高前向運動精子百分率。

3.3“B法”的推廣價值

“B法”的基本原理是促使前向運動精子與非前向運動精子的區域分離,所有哺乳動物的正常精子皆有前向運動特性,故此法不僅可應用于大鼠、金黃地鼠及其它在體積、附睪結構和精子結構及功能特性上與小鼠相類似小動物的前向運動精子分離采集,也可以推廣設計出適應于各種哺乳動物精子的分離采集技術。

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