雷帕霉素同種異體血管病研究

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作者：盧衡,陳良萬,邱罕凡,黃雪珊

【摘要】目的研究雷帕霉素(RPM)和卡托普利單獨或聯(lián)合用藥對大鼠同種異體血管病(CAV)的作用。方法建立大鼠同種異體頸動脈移植模型,分別給予蒸餾水、卡托普利、RPM及聯(lián)合用藥（卡托普利+RPM）處理,在移植前和移植后8周查血清NO含量,取組織檢測血管內(nèi)膜厚度,免疫組織化學(xué)檢測移植動脈中TGFβ1、VCAM1的表達(dá)和PCNA陽性細(xì)胞百分率及CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤情況。結(jié)果卡托普利和RPM均可減輕移植動脈血管內(nèi)膜的增厚程度,聯(lián)合用藥組動脈血管內(nèi)膜增厚程度最小。各組的血管因子表達(dá)情況和CD4＋T細(xì)胞的浸潤存在差異。結(jié)論RPM和卡托普利均可延緩移植后CAV的發(fā)生、發(fā)展,二者聯(lián)合用藥效果更好。

【關(guān)鍵詞】雷帕霉素;卡托普利;心臟移植;血管疾病;移植,同種;疾病模型,動物

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofsirolimusorcatoprilandtheircombinationonallograftangiopathyinrats.MethodsTheestablishmentofallograftmodelwasachievedbycarotidtransplantationinrats.60ratswererandomlyclassifiedintofourgroupsaccordingtobeinggivendifferentmedicine:thecontrolledgroup(A),catopriltreatedgroup(B),sirolimustreatedgroup(C)andcombinationtreatedgroup(D).At0,8weeksaftertransplantationtheNOcontentinbloodserumweremeasuredandthegraftswereharvestedforobservingtheregionalchangesintheintimallayersbylightmicroscopyandtheexpressionofTGFβ1,VCAM1,PCNA%andCD4+Tcellscountintheallograftbyimmunohistochemistry.ResultsTherewasareducedintimalthicknessinbothcatopriltreatedgroupandsirolimustreatedgroup,especiallyinthecombinedtreatedgroup.ThenumberofCD4+TcellinfiltrationinallograftofgroupB,groupCandgroupDwaslessthanthatofgroupA(P<0.05).TheNOcontentinserumofgroupBandgroupDwashigherthanthatofgroupA(P<0.05).TherewasweakexpressionofTGFβ1,VCAM1inallograftandlowerPCNA(%)ingroupB,groupCandgroupDthanthoseingroupA(P<0.05).ConclusionThepreventionofcatoprilandsirolimusonallograftangiopathyissignificantandtheeffectwasmostobviouswhendrugswereusedcombinedly.

KEYWORDS:catopril;sirolimus;allograftangiopathy;rats

心臟移植后同種異體血管病(CAV)是影響心臟移植病人長期存活的一個主要原因。CAV病變呈現(xiàn)多樣性,既有向心性纖維內(nèi)膜增生的改變,也有類似于普通冠心病的偏心性粥樣斑塊形成[1]。筆者應(yīng)用大鼠同種異體頸動脈移植模型,對雷帕霉素(RPM)和ACEI類藥物卡托普利在移植物慢性血管病變中的作用進(jìn)行研究,報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物供體Wistar大鼠[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,合格證號:SCXK(滬):20030003],受體SD大鼠[福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(閩):20040002],各24只,均為雄性,體質(zhì)量200～250g。

1.1.2分組配對移植后受體隨機均分成4組(各6只)。蒸餾水組：移植當(dāng)天經(jīng)口灌胃蒸餾水;卡托普利組：卡托普利50mg·kg-1·d-1;RPM組：RPM3mg·kg-1·d-1;聯(lián)合用藥組:卡托普利(50mg·kg-1·d-1)+RPM（1.5mg·kg-1·d-1）]。給藥濃度根據(jù)實際體質(zhì)量調(diào)整。

1.1.3藥品、試劑及器械卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號:0503061H);RPM(福建微生物研究所,批號:040301);一氧化氮試劑盒酶法(深圳晶美生物制品工程有限公司);TGFβ1試劑盒(美國SantaCruz生物公司);PCNA、VCAM1試劑盒(美國NeoMarkers公司);鼠抗兔CD4試劑盒(英國Serotec公司);S105酶標(biāo)儀,BX41雙目顯微鏡,ImageproPlus計算機顯微攝像系統(tǒng)和JD801形態(tài)分析軟件(美國捷達(dá)科技公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立供、受體以1％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。切除受體部分頸總動脈,將供體頸總動脈植入受體頸部,110無損傷絲線間斷內(nèi)膜外翻縫合供、受體頸總動脈的兩端(端端吻合),吻合時間＜20min。移植后1周打開切口觀察,動脈通暢為手術(shù)成功,血管栓塞為移植失敗。

1.2.2受鼠血清提取分別于移植時和切取標(biāo)本時抽取靜脈血3mL,離心吸取上層血清0.5mL查NO的含量。

1.2.3移植物切取和組織學(xué)研究術(shù)后第8周切取移植動脈。切取的移植血管固定、包埋、切片,行蘇木精染色。每個標(biāo)本隨機取5個不連續(xù)切面,計算機顯微攝像系統(tǒng)將染色的病理圖像輸入計算機,JD801形態(tài)分析軟件分析測量內(nèi)膜厚度。

1.2.4移植物CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)計算以細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色、黃色者為陽性細(xì)胞,在高倍鏡下(×400)連續(xù)選取5個視野,網(wǎng)格目鏡計數(shù)得出每個視野的陽性數(shù),取平均值。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色法檢測移植物轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子1（VCAM1）的表達(dá)光學(xué)顯微鏡觀察陽性為細(xì)胞質(zhì)中有棕色、黃色顆粒,測灰度值(JD801形態(tài)分析軟件測得平均灰度,以灰度值大小與表達(dá)多少成反比)。核細(xì)胞增殖抗原（PCNA）陽性細(xì)胞的表達(dá)(陽性細(xì)胞核染色為棕褐、棕黃、淺黃色),隨機計數(shù)500個細(xì)胞,以陽性細(xì)胞為分子計算PCNA表達(dá)指數(shù)并用百分比表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示,應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及兩兩比較,P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況實驗中無動物死亡,全部移植血管取材時均通暢。

2.2形態(tài)學(xué)觀察移植后8周:蒸餾水組移植動脈管腔明顯變窄,內(nèi)皮細(xì)胞基本覆蓋整個管腔,內(nèi)膜增厚明顯,血管壁有多量的炎癥細(xì)胞浸潤;卡托普利組內(nèi)皮細(xì)胞增多,內(nèi)皮輕度增厚,血管壁各層可見少量炎癥細(xì)胞;RPM組動脈內(nèi)膜輕度增厚,各層炎癥浸潤明顯減少;聯(lián)合用藥組內(nèi)膜未見明顯增厚,未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(圖1)。

A：內(nèi)膜增厚明顯;B：內(nèi)皮細(xì)胞增多,內(nèi)皮輕度增厚;C：動脈內(nèi)膜輕度增厚;D：內(nèi)膜未見明顯增厚.

圖1移植后8周4組內(nèi)膜厚度的變化(HE染色×400)（略）

Fig1Thechangeofendomembraneinthefourseriesofallograftsafter8weeks(HEstaining×400)

2.3內(nèi)膜厚度移植前內(nèi)膜厚度為(4.26±0.17)μm,移植后8周蒸餾水組、卡托普利組、RPM組及聯(lián)合用藥組移植物內(nèi)膜厚度依次為(47.46±3.20),(8.66±1.09),(5.04±0.22)及(4.54±0.10)μm,前3組與移植前比較,P＜0.05,聯(lián)合用藥組P＞0.05;移植后4組兩兩比較，P＜0.05。

2.4病理組織化學(xué)血清NO含量、血管壁VCAM1與TGFβ1的表達(dá)(平均灰度)、PCNA陽性細(xì)胞百分比和CD4+T細(xì)胞浸潤數(shù)見表1。

2.5免疫組織化學(xué)表達(dá)移植后8周各組血管壁VCAM1、TGFβ1、PCNA陽性細(xì)胞的表達(dá)情況(圖2)。蒸餾水組平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞核PCNA陽性表達(dá)明顯增多,表明平滑肌增殖明顯,且有向內(nèi)膜層生長傾向;聯(lián)合用藥組表達(dá)最少,且在內(nèi)膜層未發(fā)現(xiàn)PCNA陽性細(xì)胞。

表14組移植動脈病理組織學(xué)檢查結(jié)果（略）

Tab1Theoutputofdetectioninallografts

NO：一氧化氮；VCAM1：血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1；TGFβ1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；PCNA：核細(xì)胞增殖抗原；RPM：雷帕霉素.與蒸餾水組比較,☆:P<0.05;與卡托普利組比較,#:P<0.05.

3討論

目前國際上普遍認(rèn)為CAV發(fā)病的主要因素包括了免疫性和非免疫性(再灌注損傷、病毒尤其是巨細(xì)胞病毒感染、肥胖、高血壓、高脂血癥等)因素,在防治CAV時主要采取服用免疫抑制劑方法從而抑制免疫反應(yīng)和減少非免疫因素。

根據(jù)“損傷反應(yīng)”理論,移植物血管病變是持續(xù)血管損傷產(chǎn)生的結(jié)果,這些損傷因素包括免疫反應(yīng)和一些非特異性損傷[2]。血管內(nèi)皮的損傷觸發(fā)了一連串“組織修復(fù)”機制引起血管細(xì)胞增殖、纖維化及血管重構(gòu)。NO是抗黏附分子,體外NO供體給藥可以抑制VCAM1的表達(dá),體內(nèi)給藥可抑制中性粒細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞,中性粒細(xì)胞黏附于毛細(xì)血管的作用可被外源性NO阻斷。缺血再灌注損傷是冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的起始點,給予LArg可以促進(jìn)NO的生成,減輕缺血再灌注對內(nèi)皮的損傷,對預(yù)防CAV的形成有一定的意義。NO還能抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖,抑制血小板聚集、白細(xì)胞的黏附及大量細(xì)胞外基質(zhì)的累積。動物實驗與臨床研究表明ACEI類藥物有保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,能夠逆轉(zhuǎn)高血壓與高血脂引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷,表現(xiàn)出抗動脈粥樣硬化作用[3]。本研究顯示,卡托普利能提高血清中NO含量,保護內(nèi)皮細(xì)胞,抑制VCAM1、TGFβ1的表達(dá),抑制平滑肌細(xì)胞的增殖(降低PCNA陽性細(xì)胞的百分比),延緩CAV的發(fā)生發(fā)展。

A:蒸餾水組；B：聯(lián)合用藥組.NO：一氧化氮；VCAM1：血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1；TGFβ1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；PCNA：核細(xì)胞增殖抗原.

圖2移植后8周對照組與聯(lián)合用藥組移植血管免疫組織化學(xué)表達(dá)(×400)（略）

Fig2Theexpressionofimmunochemistryinallograftsonthecontrolledgroupandthecombinationtreatedonegroups(×400)

RPM作為一種新的免疫抑制劑具有多重功能,在臨床應(yīng)用后,已經(jīng)證明對急性排斥反應(yīng)有良好防治效果。研究發(fā)現(xiàn)急性排斥反應(yīng)發(fā)生的頻率及嚴(yán)重程度和CAV的發(fā)病密切相關(guān),而RPM已在動物實驗和臨床器官移植中被證明能夠抑制心臟移植后急性排斥反應(yīng)[4]。RPM對CAV的防治作用,一部分歸功于它對急性排斥反應(yīng)的抑制作用。RPM強大的抗平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的特性在防治CAV上也起到非常重要的作用。在CAV的發(fā)病過程中,生長因子參與了血管平滑肌細(xì)胞損傷后的增殖和遷移,而RPM具有下調(diào)大部分生長因子和生長因子受體的表達(dá)[5],抑制生長因子(如表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子)的作用。本研究顯示,RPM組血管的CD4＋T細(xì)胞的浸潤數(shù)明顯少于另兩組,說明其有強大的免疫抑制作用,同時明顯抑制了TGFβ1的表達(dá),減少內(nèi)膜中PCNA陽性細(xì)胞數(shù),起到抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用。

本研究提示,卡托普利主要通過增加NO的合成和減少炎癥因子起到保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,同時具有部分的免疫調(diào)節(jié)功能;而RPM同時具有強大的抑制免疫反應(yīng)和抑制生長因子表達(dá)的功能。兩者合用,可以在抑制免疫反應(yīng)的同時保護內(nèi)皮細(xì)胞的功能,減低細(xì)胞間的反應(yīng),抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和移行,從而更好的延緩和減輕移植物血管病變的發(fā)生、發(fā)展,預(yù)防CAV發(fā)生。

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