姜黃素衍抑制K562細胞增殖研究

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作者：李娜,吳麗賢,溫彩霞,黃秀旺,許建華

【摘要】目的研究姜黃素衍生物Fm04對K562細胞的增殖及對P210bcr/abl信號通路的影響。方法應用MTT法檢測姜黃素衍生物Fm04對K562細胞增殖的影響;應用Westernblot法檢測P210bcr/abl及其下游通路蛋白表達的變化和線粒體細胞色素C的變化;比色法測定Caspase3、Caspase9活化程度。結果Fm04對K562細胞的抑制作用呈量效、時效關系,4μmol/LFm04作用24h,抑制率88.4%,半數抑制濃度1.45μmol/L,強度約為姜黃素的7倍;Westernblot表明Fm04可顯著下調P210bcr/abl及其下游信號通路蛋白,減少細胞線粒體內細胞色素C含量;Fm04處理組Caspase3、Caspase9濃度值增加。結論Fm04顯著抑制k562細胞的增殖并減少P210的蛋白含量從而下調P210bcr/abl下游多種信號分子表達,通過激活caspase的活化和線粒體內細胞色素C的釋放,最終誘導K562細胞的凋亡。

【關鍵詞】姜黃素;細胞凋亡;白血病,髓樣,慢性;融和蛋白質類;bcrabl;K562細胞;信號傳導

ABSTRACT:ObjectiveTostudytheapoptosisinducingeffectsofthesyntheticalcurcuminderivativeFm04onchronicmyelogenousleukemia(CML)cell.MethodsMTTwasusedtodeterminetheapoptoticeffectsofFm04onK562cells.ThesignalproteinmoleculesexpressedinK562cellswasexaminedbyWesternBlotting.ThespectrophotometerkitwasusedtodetecttheactivityofCaspase3andCaspase9.ResultsExposureofK562cellstoFm04producedbothconcentrationandtimedependentincreaseintheantiproliferativerate.K562cellsweremuchmoresensitivetofm04thantocurcumin,4μmoL/LFm04for24htheinhibitingratsreached88.4%andtheIC50ofFm04was1.45μmol/L.Moreover,thelevelofP2l0bcr/ablaswellasthedownstreamsignalproteinwasstronglydownregulatedinfm04treatedK562cells,andtheDvalueofCaspase3andCaspase9wasupregulatedinFm04treatedK562cells.ConclusionFm04exhibitsstrongeractivityininducingapoptosisinchronicmyelogenousleukemia(CML)cellsthancurcuminbyhavingstrongeractivityofthedownregulationoftheP2l0bcr/ablandotherproteins,andbyactivingthecaspasecascadesandinducingthestrongerreleaseofcytochromeCfrommitochondria.Fm04mightbeworthyofbeingconsideredasapotentialchemotherapeuticagentofCML.

KEYWORDS:curcuminderivative;apoptosis;leukemia;P210bcr/abl

姜黃素(curcumin,Cur)系從姜黃中提取的酚性有效單體化合物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變、抗炎、抗血小板聚集等廣泛的藥理作用[1]。近年來,有關姜黃素的藥理學研究尤其在抑制細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等方面的作用日益受到重視，并發現Cur與STI571體外聯合應用可明顯協同下調P210bcr/ab1的表達水平，這對于降低慢性粒細胞白血病對STI571的耐藥性的一定的意義[2]。但姜黃素水溶性差,水溶液易水解,首過消除現象明顯,生物利用度低,成為限制其臨床應用的主要因素和產業化的瓶頸[3]。本實驗保留分子中共扼β二酮鏈等活性必需基團,設計合成新的姜黃素衍生物Fm04。

P210bcr/abl融合蛋白定位于細胞質內,依靠Bcr的雙聚體區,以形成二聚體。P210bcr/abl蛋白可通過其酪氨酸激酶(PTK)的持續激活而活化下游相關的信號轉導通路,包括Ras/MAPK、PI3K、Erk、NFκB、JakSTAT通路等[49],并阻斷線粒體內的細胞色素C(CytC)的釋放引起caspases級聯的激活[10],從而阻止細胞凋亡,導致細胞過度增殖,是治療慢性粒細胞白血病的分子靶點。筆者以K562細胞為模型,對新合成姜黃素衍生物Fm04的體外抗慢性粒細胞白血病細胞活性進行初步評價及探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑姜黃素(上海試劑三廠,批號980825),純度99%;姜黃素衍生物Fm04由本實驗室合成并提純,經核磁共振光譜驗證,經HPLC及薄層層析分析鑒定,純度>90%;Westernblot試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術有限公司];抗ABL單克隆抗體、Erk1/2、pErk、AKT、pAKT、CytC、NFκB(P65)、βactin抗體(美國SantaCruz公司);Caspase3、Caspase9分光光度法檢測試劑盒(南京凱基生物發展有限公司)。

1.1.2細胞株及培養條件人慢性粒細胞白血病細胞株K562(中科院上海細胞研究所),培養于含10%新生牛血清,1×108U/L青霉素及100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養液,在37℃、體積分數為0.05、飽和濕度的CO2培養箱培養。細胞接種24h后進入指數增長期。

1.2方法

1.2.1細胞增殖采用MTT法,觀察Fm04對K562細胞作用的量效與時效關系,接種指數生長期的K562細胞于96孔板上,分別設置空白組,Fm04組（1,2,4,8μmol/L）,Cur組（5,10,20,40μmol/L）。將培養板置于37℃、體積分數為0.05、飽和濕度的CO2培養箱培養至所需的時間,加入MTT溶液,繼續培養4h后,離心,棄上清,加入DMSO,顆粒完全溶解后用酶標儀在570nm處測定每孔的光密度值(D)。

1.2.2P210bcr/abl等信號蛋白表達采用Westernblot法,藥物處理細胞24h,收集細胞,以0.01mol/L浴冷PBS(pH7.2)洗2次,加入去污裂解緩沖液于4℃裂解30min,離心,吸出上清,即為細胞總蛋白,用BCA蛋白定量,各組均采用同樣的蛋白量上樣,在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后轉膜,封閉液封閉過夜,加一抗室溫作用1h,洗去未結合的一抗,以Westernblot試劑盒加二抗,DAB染色。

1.2.3Caspase3和Caspase9活性藥物處理細胞24h,收集細胞,采用Caspase3、Caspase9分光光度法檢測試劑盒,用分光光度計在λ=405nm測定其D值。通過計算D誘導劑/D陰性對照的倍數來確定Caspase3和Caspase9活化程度。

2結果

2.1Fm04對K562細胞增殖的抑制K562細胞增殖抑制率隨Fm04濃度增大而提高,呈劑量依賴關系(圖1A),其IC50為1.45μmol/L,強度約為姜黃素的7倍;K562細胞增殖抑制率隨著Fm04作用時間的延長而提高,呈時間依賴關系(圖1B),且低濃度Fm04在12,24及48h對K562細胞抑制率均比高濃度姜黃素高。

A:不同濃度Fm04和Cur;B:Fm044μmol/L和Cur10μmol/L.

圖1Fm04對K562細胞增殖抑制的影響（略）

Fig1InhibitoryeffectofFm04onproliferationofK562cells福建醫科大學學報2008年5月第42卷第3期李娜等：姜黃素衍生物Fm04抑制K562細胞增殖及其對P210bcr/abl信號通路的影響

2.2Fm04對K562細胞中P210bcr/abl及其下游信號通路蛋白的影響

2.2.1Fm04下調K562細胞P210bcr/abl蛋白含量隨Fm04劑量增大,P210bcr/abl蛋白條帶灰度逐漸變淡,Fm041μmol/L就可下調P210bcr/abl蛋白,Fm044μmol/L最明顯,條帶基本消失,呈量效關系(圖2A)。Fm044μmol/L作用12h即對p210bcr/abl蛋白有抑制作用,隨著時間的延長,條帶逐漸變淡,至48h,P210bcr/abl蛋白條帶幾乎消失，可見明顯的時效關系(圖2B)。

A:Fm04;B:4μmol/LFm04.

圖2Fm04對K562細胞P210bcr/abl蛋白含量的影響（略）

Fig2EffectofFm04onP210bcr/ablinK562cells

2.2.2Fm04對K562細胞P210bcr/abl下游相關信號通路蛋白含量的影響分別以Fm041,2,4μmol/L處理K562細胞12h,隨著劑量增加,NFκB蛋白逐漸減少;而以Fm041,2,4μmol/L處理K562細胞24h,對于PAKT來說,隨劑量增加,其蛋白含量減少;而對于PErk來說,其蛋白含量隨劑量增加而增加(圖3A)。用Fm044μmol/L分別處理K562細胞1,3,6,12,24,48h,PErk蛋白含量在1～6h。隨時間延長而減少,處理6h蛋白基本消失,而12～48h,蛋白含量隨著時間延長而逐漸增加,此現象于姜黃素并未發生。Cur40μmol/L處理K562細胞,0～48h內,PErk蛋白含量隨時間變化逐漸減少(圖3B)。

2.3Fm04對線粒體凋亡途徑的影響

2.3.1Fm04觸發K562細胞線粒體細胞色素C釋放Fm041,2,4μmol/L處理K562細胞24h能促進K562細胞線粒體細胞色素C釋放,細胞質S100中的含量逐漸增加,相反,線粒體中的細胞色素C含量逐漸減少(圖4)。

2.3.2Fm04活化Caspase3、Caspase9Fm041,2,4μmol/L處理K562細胞24h后,Caspase3、Caspase9的活化程度增高,能將偶聯有發色基團的Caspase3序列特異性的多肽底物被剪切,發色基團游離出來,D值升高。

3討論

3.1Fm04下調K562細胞P210bcr/abl及其下游相關信號通路蛋白含量本實驗合成的姜黃素衍生物Fm04,化學結構經1HNMR和13CNMR確證。細胞增殖抑制實驗表明，Fm04對K562細胞有明顯的抑制作用,呈量效和時效關系,其抑制活性明顯優于姜黃素。P210bcr/abl是CML的特征性蛋白,具有異常活躍的酪氨酸激酶活性,是CML發病的主要原因,并與其對多種化療藥物耐藥有關,且由于P210bcr/abl含有磷酸化位點,可與含SH2的信號分子相結合,從而活化下游相關的多條信號途徑[49],促進細胞增殖。從實驗結果表明,新合成姜黃素衍生物Fm04可下調K562細胞P210bcr/abl含量并呈量效和時效關系;Fm04還可下調與K562細胞增殖和凋亡有關的P210bcr/abl下游信號分子pErk(如6h)、pAKT、NFκB。

A:不同劑量Fm04;B:不同時間Fm04及Cur.

圖3Fm04對K562細胞P210bcr/abl下游相關信號分子的影響（略）

Fig3EffectofFm04onthebcr/ablrelatedsignalingmoleculesinK562cells

圖4Fm04對K562細胞線粒體細胞色素C(CytC)的影響（略）

Fig4EffectofFm04oncytochromeCofmitochondriainK562cells

圖5Fm04對K562細胞Caspase3和Caspase9活化程度的影響（略）

Fig5EffectofFm04onactivationofCaspase3andCaspase9inK562cells

3.2Fm04對K562細胞PErk的影響細胞外調節蛋白激酶(ERK)分為ERK1和ERK2,統稱為ERK1/2,主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活,進入細胞核作用于E1k1,cmyc,cfos,cjun,ATF,NFκB和AP1等轉錄因子,促進某些基因的轉錄與表達,和細胞的增殖與分化密切相關。本實驗結果表明,Fm04作用K562細胞24h,pErk蛋白含量隨Fm04劑量增大而增加(圖3A),而細胞增殖實驗結果顯示(圖1)Fm04對K562細胞的增殖有很強的抑制作用,通過觀察不同時間點Fm04對pErk蛋白表達的影響發現,Fm04作用于K562,早期引起pErk減少,而晚期引起其增多,Chunrong等發現Sti571作用于bcr/abl陽性細胞也有類似狀況[11]。有報道顯示,細胞外信號調節激酶(ERK)1/2是Ca2+/CaM信號通路的重要調節因素[1213],許多Ca2+/CaM抑制劑均可引起(ERK)1/2的持續磷酸化并抑制細胞增殖。Shim合成研究的姜黃素衍生物HBC可通過引起HCT15細胞(ERK)1/2的持續磷酸化而阻斷Ca2+/CaM信號通路而抑制細胞增殖[14],因此可推斷Fm04除了P210bcr/abl信號通路,或許對Ca2+/CaM信號通路也有一定的抑制作用,該方面機制有待進一步研究。

3.3Fm04對K562細胞Caspase3和Caspase9的影響Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,Caspase9是級聯酶的上游分子,在正常狀態下以酶原的形式存在于細胞漿中,沒有活性,可被從線粒體向細胞質釋放的細胞色素C激活。Caspase3在正常狀態下以酶原的形式存在于細胞漿中,沒有活性;但在細胞發生凋亡階段,它被激活,活化的Caspase3由兩個大亞基和兩個小亞基組成,裂解相應的胞漿胞核底物,最終導致細胞凋亡。Fm04可促進細胞色素C從線粒體釋放放入細胞質,活化Caspase9和Caspase3,激活下游的凋亡通路。

筆者認為,新合成姜黃素衍生物Fm04可顯著抑制K562細胞增殖并下調P210bcr/abl信號通路,具有顯著的體外抗慢性粒細胞白血病活性,筆者將進行進一步的在體實驗,為進一步改造開發高效低毒的抗腫瘤藥物奠定基礎。

【參考文獻】

[1]AggarwalBB,KumarA,BhartiAC.Anticancerpotentialofcurcuma:preclinicalandclinicalstudies[J].AnticancerRes,2003,23(1A):363398.

[2]張昆仲，許建華，黃秀旺，等.姜黃素與STI571對慢性粒細胞白血病細胞株K562作用的體外研究[J].福建醫科大學學報，2006，40（5）：427430.

[3]lresonCR,JonesDJ,OrrS.Metabolismofthecancerchemopreventiveagentcurcumininhumanandratintestine[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2002,11(1):105111.

[4]MandanasRA,LeibowitzDS,GharehbaghiK,etal.Roleofp21rasinP210bcr/abltransformationofmurinemyeloidcells[J].Blood,1993(82):18381847.

[5]PuilL,LiuJ,GishG,etal.BcrAbloncoproteinsbinddirectlytoactivatorsoftheRassignalingpathway[J].EMBOJ,1994,13(4):764773.

[6]CortezD,ReuterG,PendergastAM.TheBcrAbltyrosinekinaseactivatesmitogenicsignalingpathwaysandstimulatesG1toSphasetransitioninhematopoieticcells[J].Oncogene,1997,15(19):23332342.

[7]SkorskiT,BellacosaA,NieborowskaSkorskaM,etal.TransformationofhematopoieticcellsbyBCR/ABLrequiresactivationofaPI3k/Aktdependentpathway[J].EMBOJ,1997,16(20):61516161.

[8]KawaiH,NieL,YuanZM.InactivationofNFkappaBdependentcellsurvival,anovelmechanismfortheproapoptoticfunctionofcAbl[J].MolCellBiol,2002,22(17):60796088.

[9]BuettnerR,MoraLB,JoveR.ActivatedSTATsignalinginhumantumorsprovidesnovelmoleculartargetsfortherapeuticintervention[J].ClinCancerRes,2002,8(4):945954.

[10]OkadaM,AdachiS,ImaiT,etal.AnovelmechanismforSTI571mesylateinducedcelldeathofBCRABLpositivehumanleukemiccells:caspaseindependent,necrosislikeprogrammedcelldeathmediatedbyserineproteaseactivity[J].Blood,2004,103(6):229922307.

[11]YuC,KrystalG,VarticovksiL,etal.Pharmacologicmitogenactivatedprotein/extracellularsignalregulatedkinase/mitogenactivatedproteinkinaseinhibitorsinteractsynergisticallywithSTI571toinduceapoptosisinBcr/Ablexpressinghumanleukemiacells[J].CancerRes,2002,62(1):188199.

[12]HoshinoM,NakamuraS.CalmodulinbindstoKRas,butnottoHorNRas,andmodulatesitsdownstreamsignaling[J].BiochenBiophysResCommun,2002,295(3):651656.

[13]ShinSY,KimSY,KimJH,etal.Inductionofearlygrowthresponse1geneexpressionbycalmodulinantagonisttrifluoperazinethroughtheactivationofElk1inhumanfibrosarcomaHT1080cells[J].BiolChem,2001,276(11):77977805.

[14]ShimJS,LeeJ,ParkHJ,etal.Anewcurcuminderivative,HBC,interfereswiththecellcycleprogressionofcoloncancercellsviaantagonizationoftheCa2+/calmodulinfunction[J].ChemBiol,2004,11(10):14551463.