白細胞抗原鑒定管理論文

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摘要目的：用單克隆抗體鑒定白細胞共同抗原并對其性質進行初步分析。方法：用B細胞株3D5免疫Balb/c小鼠得到單抗5H12，借助間接免疫熒光及流式細胞儀分析，檢測5H12抗原在多種白細胞表面的表達情況，并從白細胞膜中提取5H12抗原，通過增殖試驗、聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡對其特性進行初步分析。結果：5H12抗原表達于多種白細胞表面，包括休止T細胞、休止B細胞、單核細胞、中性粒細胞、體外PHA激活的T細胞、體外anti-μ激活的B細胞、也表達在T細胞株(Jurkat、Peer)、B細胞株(3D5、Daudi、CESS、BJAB)、單核細胞株U937和髓細胞株K652表面。增殖試驗表明，該抗原與相應單抗結合后導致B細胞活化抑制。對抗原的初步分析顯示：5H12是一種單鏈蛋白質分子，分子量為22kD。結論：5H12是一種單鏈膜蛋白分子，屬于白細胞共同抗原，與B細胞活化有關。

關鍵詞白細胞共同抗原5H12分子量

Identificationofleukocytecommonantigen(LCA)5H12anddiscoveryofitseffectonBcellactivation

WANGYun-Ping,ZHANGShu-Zhen,ZHULi-Ping.

DepartmentofImmunology,BinzhouMedicalCollege,Binzhou256603

AbstractObjective:Toidentifyleukocytecommonantigen(LCA)withmonoclonalantibody(McAb)andanalyzetheLCA.Methods:ImmunizedBalb/cmicewithBcellline3D5andobtainedMcAb5H12，thendetectedtheexpressionof5H12antigenonvariouskindsofleukocytesandwhitecelllinesbyindirectimmunofluorescenceandflowcytometricanalysisandfinallyisolatedandpurified5H12antigenfromcellmembraneandanalyzedthe5H12byproliferationtest,SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)andWestern-blotting.Results:5H12wasexpressedonapanelofhumanleukocytesandwhitecelllinesincludingrestingTcells,restingBcells,monocytes,neutrophils,PHA-activatedTcells,anti-μ-activatedBcells,Tcelllines(Jurkat,Peer),Bcelllines(3D5,Daudi,CESS,BJAB),binationof5H12antigenwith5H12McAbcouldinduceinhibitionofBcellactivationinadose-dependentmannerandthissuggestedthat5H12mightplayaroleintheprocessthatledtoBcellactivationandproliferation.SDS-PAGEandWestern-blottinganalysisindicatedthat5H12isa22kDone-peptide-chainprotein.Conclusion:5H12isaone-peptide-chainmembraneproteinmolecule,itisaLCAandrelatedtocellactivation.

KeywordsLeukocytecommonantigen5H12Molecularweight

白細胞共同抗原(leukocytecommonantigen,LCA)表達于多種白細胞表面，是一大類粘附分子，具有多種功能，與細胞活動密切相關。在免疫應答過程中，LCA參與免疫細胞間的粘附，充當協同刺激分子，與免疫細胞的識別活化、增殖分化、發揮效應有密切關系。LCA表達缺陷，可導致免疫反應異常。由于其作用重要，LCA已受到廣泛重視。本實驗鑒定了一種LCA5H12，并對其功能進行了初步分析，為深入研究打下基礎。

1材料與方法

1.1儀器、材料與試劑541型流式細胞儀(美國Coulter)；CO2培養箱(美國Shel-Lab)；FITC標記的羊抗鼠IgG，堿酶標記的羊抗鼠IgG，DEAE-SephadexA50，anti-μ，PHA，SDS，過硫酸銨，HAT，TEMED(均為美國Sigma)；RPMI1640(美國GIBCO)；CNBr活化的Sepharose4B(瑞典Pharmacia)；3H-TdR(中國原子能研究所)；NP-40，PEG(瑞士Fluka)；硝酸纖維素膜(美國Bio-Rad)；其它均為國產試劑。各種細胞株由醫科院基礎所單抗室提供。

1.2單抗制備用人活化的B細胞株3D5免疫Balb/c小鼠。在50%PEG(MW：1450)條件下，將小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合。融合后的細胞在HAT培養液中培養，雜交瘤細胞經兩步進行篩選。先用ELISA法篩選產生高滴度小鼠Ig的陽性孔。再用3D5細胞和人T細胞株Jurkat作靶細胞，經間接免疫熒光染色，用流式細胞儀進行分析，然后對與3D5和Jurkat兩種細胞均呈陽性反應孔的細胞作連續3次克隆，最后得到雜交瘤細胞株5H12。接種5H12雜交瘤細胞于Balb/c小鼠腹腔以制備腹水。單克隆抗體5H12的血清型用雙向瓊脂擴散試驗檢測。

1.3人外周血單個核細胞(PBMNC)的制備方法見文獻［1］。

1.4人外周血T細胞、B細胞、單核細胞、中性粒細胞和紅細胞的分離方法見文獻［1］。

1.5活化T、B細胞的制備用24孔板培養細胞，每孔加T細胞懸液2ml(含2×106個細胞)，T細胞懸液中加PHA至終濃度2μg/ml，B細胞懸液中加anti-μ至終濃度100μg/ml，5%CO2培養箱孵育72h。

1.6間接免疫熒光試驗一抗用5H12單抗腹水。二抗為FITC標記的羊抗鼠IgG抗體，用流式細胞儀檢測［2］。

1.7流式細胞儀分析儀器的工作條件為488nm，每個樣品均檢測10000個細胞，檢測參數為FALS，L90°LS和LIGFL，用儀器中的計算機分析陽性細胞百分率及熒光強度。

1.8T、B細胞增殖試驗96孔尖底培養板，每孔置1×105個PBMNC，分加PHA(終濃度2μg/ml)，anti-μ(終濃度100μg/ml)和/或5H12單抗腹水(稀釋度為1∶1000.0、1∶500.0、1∶250.0、1∶125.0、1∶62.5)，對照用SP2/0腹水，培養板置37℃、5%CO2培養箱孵育72h，孵育前16h加3H-TdR，用細胞收集器收集細胞，液閃計數cpm值，每一條件均設3個平行孔。

1.95H12單抗的純化先用硫酸銨分級沉淀法，后用DEAE-SephadexA50離子交換法得到純化的5H12單抗。

1.10膜蛋白的提取、純化和鑒定按文獻［3］提取3D5細胞膜蛋白，按文獻［4］用親和層析法從膜蛋白中純化5H12抗原，親和層析柱用的載體為CNBr活化的Sepharose4B，配基為5H12單抗，純化抗原先經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再進行Western印跡分析，印跡分析時，一抗用1∶200稀釋的5H12單抗腹水，對照為CD8單抗腹水，二抗為1∶3000稀釋的堿酶標記的羊抗鼠IgG［5］。

2結果

2.1雜交瘤的篩選與克隆用3D5和Jurkat作靶細胞，用間接免疫熒光染色法對產生較多小鼠IgG的雜交瘤進行篩選。取兩種細胞同時染色(5H12)的細胞，用有限稀釋法經連續3次克隆，得5H12雜交瘤。把5H12雜交瘤注射入Balb/c小鼠腹腔制備5H12單抗腹水。瓊脂擴散試驗表明5H12單抗為IgG2b。

2.25H12抗原的表達間接免疫熒光染色后經流式細胞儀分析可見休止T細胞、休止B細胞、單核細胞均明顯表達5H12抗原，而中性粒細胞弱表達，紅細胞不表達，B細胞經anti-μ激活后及T細胞經PHA激活后，細胞表面仍表達5H12抗原。各種細胞株包括T細胞株(Jurkat,Peer)、B細胞株(3D5、Daudi、CESS、BJAB)、單核細胞株U937和髓樣細胞株K562均表達5H12抗原。上述結果說明5H12抗原表達于多種白細胞表面，屬白細胞共同抗原。

2.35H12抗原對人B細胞增殖的影響功能試驗表明5H12單抗能夠抑制anti-μ誘導的B細胞增殖。

表15H12單抗抑制anti-μ誘導的PBMNCs的3H-TdR摻入

Tab.1Inhibitionof3H-TdRuptakeofanti-μ-inducedPBMNCsbymonoclonalantibody5H12

3H-TdRuptake(cpm)

—1∶1000.01∶500.01∶250.01∶125.01∶62.5

—1)—5H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/0

EXP1.1501324118753631131729921114243689425037432041

±243±616±92±183±67±352±165±203±112±442±83±428

EXP2.116528232155267118852858184929721358278913102453

±167±403±391±264±442±50±379±361±110±67±327±537

EXP3.164934112570332223513508221043431748450714562928

±400±386±90±274±86±238±594±404±245±223±251±92

EXP4.1266249750344174103647546353965830927482968

±461±1333±318±2029±74±111±91±1106±135±1182±338±702

Note：1×105PBMNCsin0.2mlof10%FCSRPMI1640wereincubatedatthepresenceof100μg/mlofanti-μfor72h，variousconcentrationsofMcAb5H12orSP2/0wereappliedtothecellcultureatthe0h;1)Withoutanti-μ，EXP：experiment

anti-μ為B細胞絲裂原，對T細胞無作用，因此用anti-μ刺激PBMNC就是刺激B細胞增殖。4次實驗表明，anti-μ誘導的B細胞增殖均受到5H12單抗的抑制，此抑制作用隨5H12單抗濃度的升高而增強，但抑制作用因個體而異。對照SP2/0腹水則無此作用(表1)。5H12單抗對PHA誘導的T細胞增殖無影響，也不能誘導人PBMNC增殖。

2.45H12抗原的鑒定純化的5H12抗原在還原和非還原條件下經SDS-PAGE，均只顯示一條帶，據標準曲線測得其分子量為22kD。Western印跡分析證明這條22kD的蛋白帶就是5H12抗原。

3討論

LCA表達于多種白細胞表面，對細胞發揮生理功能具有重要作用，目前已發現LCA60余種，作用極為廣泛，有些LCA的作用已經清楚，而有些尚需探討。本實驗中，我們用制備的單抗鑒定了一種LCA5H12，具有調節B細胞活化的作用。5H12的分子量與已知的LCACD81分子量相同，均為22kD。CD81主要表達在B細胞表面，也表達在單核細胞及T細胞表面，屬白細胞分化抗原4次跨膜分子家族(TM-4)成員，具有離子通道作用，但CD81為增殖性抗體的靶抗原，而實驗中的5H12為抑制性抗體的靶抗原(對B細胞而言)。因此兩者分子量雖然相同，但作用不同。但5H12與CD81的區別尚有待于對多肽鏈的進一步分析，包括氨基酸的組成、排列、二硫鍵的數目與位置以及羧基端與氨基端的氨基酸種類。至于T、B細胞5H12抗原與相應單抗結合后表現出不同效應、可能涉及多種因素，如T、B細胞活化的途徑不同，表面抗原分布不同，受體與配體親和力不同，活化途徑不同，細胞基因功能活動情況不同等。但只有對5H12抗原進行深入的分子生物學研究，才能完整揭示其生理和病理功能。

張淑珍朱立平中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京100730

作者簡介：王運平，男，34歲，碩士，講師，主要從事BRM的研究；

朱立平，男，59歲，教授，博士生導師，主要從事分子免疫學研究

作者單位：（山東濱州醫學院免疫學教研室，濱州256603)

4參考文獻

1楊景山.血細胞的分離.見：楊景山主編.醫學細胞化學與細胞生物學技術.北京：北醫協和聯合出版社，1990：4-18

2王德斌，張叔人，劉卓如．細胞免疫學方法選編.北京：人民衛生出版社，1986：289-308

3HarlowE,LaneD.Antibodies：Alaboratorymanual.NewYork:Coldspringharborlaboratory,1988:446-450

4王傳懷.親和層析.見：張承圭，王傳懷，袁玉蓀etaleds.生物化學儀器分析及技術.北京：高等教育出版社，1990：215-244

5HarlowE,LaneD.Antibodies：Alaboratorymanual.NewYork:Coldspringharborlaboratory,1988:473-506