人體充質干細胞分離的生物學分析論文

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【摘要】目的比較人羊水源性及臍血源性的間充質干細胞(MSCs)分離、培養及其生物學特性，為組織工程選取種子細胞提供實驗依據。方法用貼壁分離培養的方法分離兩種來源的間充質干細胞，觀察其形態與生長曲線，并用細胞化學染色的方法測定其生物化學特性。結果兩種來源的標本均可成功分離出MSCs，但是孕中期羊水源性MSCs增殖能力要明顯強于新生兒臍血源性的MSCs，二者有相似的生物化學特性。結論孕中期羊水與新生兒臍血來源的MSCs是很好的組織工程種子細胞,新生兒臍血來源的MSCs的增殖能力相對較弱，應用受到一定的限制。

【關鍵詞】孕中期羊水;間充質干細胞;臍血

間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化潛能,是細胞治療及基因治療的理想種子細胞。已有研究顯示羊水[1]和臍血[2]可以分離出MSCs，那么這兩種來源的MSCs有哪些異同呢?為此本研究將對孕中期人的羊水及新生兒的臍血進行間充質干細胞的分離與培養，并對其基本生物學特性進行了比較研究，為組織工程選取種子細胞提供基礎性實驗依據，現報告如下論文。

1材料與方法

1.1標本來源

羊水標本取自2008年3月至2010年3月吉林醫藥學院附屬465醫院婦產科，妊娠在15～22周的引產羊水35份;32份臍帶血標本取自正常足月剖腹產或足月正常產乙肝病毒檢測陰性的孕婦。取標本前均征得孕婦本人同意，研究獲得吉林醫藥學院附屬465醫院道德倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器

PRMI1640(GIBCOBRL)，胎牛血清(GIBCOBRL)，馬血清(GIBCOBRL)，1.077×103g/LFicoll淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，細胞化學染色試劑盒(BASO公司)，CO2培養箱(FormaScientific公司)，熒光倒置顯微鏡(TE300,Nikon公司)。

1.3孕中期羊水MSCs的分離與培養羊水標本在室溫下1500r/min離心5min，棄上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI1640培養液，制成密度為(1～5)×105個/mL的單細胞懸液，接種到φ60mm塑料培養皿中，置飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中培養。第3天首次換液，去除非貼壁細胞，當類成纖維樣細胞鋪滿平皿達80%時，用0.25%的胰酶消化，用PRMI1640培養液制成濃度為4×104個/mL的細胞懸液，接種到新培養皿中，記為第1代(P1)。每3d用含10%FBS的PRMI1640培養液換液1次，細胞生長達到90%融合時按1∶4的比例傳代。

1.4新生兒臍帶血MSCs的分離與培養無菌條件下取正常足月剖腹產或足月正常產乙肝病毒檢測陰性孕婦的臍帶血50～80mL，放于含CPDA1復合抗凝劑的采血袋中，所有樣本均在采集后12h內進行分離;將臍血用等量的DHank′s液稀釋制成細胞懸液,細胞懸液沿管壁緩慢加入到相對密度為1.077×103g/LFicoll人淋巴細胞分離液上層,其比例為2∶1,注意液面清晰分層，以1500r/min進行梯度離心20min，然后緩慢吸取中間交界面細胞懸液至另一離心管，獲得含人MSCs的單個核細胞懸液，加入含10%FBS的PRMI1640完全培養基,吹打并計數。以5×105個/mL的密度接種到φ60mm培養皿中，48h首次換液,以后每3d換液。換液用含10%FBS的PRMI1640完全培養基。在細胞80%左右融合時,用0.25%胰酶室溫消化5min，適量小牛血清終止消化反應，吸管輕輕吹打，轉入離心管中1500r/min離心10min，棄上清，按1∶3比例傳代。

1.5MSCs的生長曲線測定將傳至3、5、8代的MSCs制備成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104/mL，接種于24孔培養板，每孔0.5mL;每天取3孔，消化后進行細胞計數，共8d。以時間(d)為橫坐標,細胞數為縱坐標，繪制生長曲線。

1.6MSCs的代謝情況檢測傳3代的羊水MSCs按5×104/mL密度接種于φ35mm的培養皿中。2d后分別對培養皿中的細胞進行POX、SB、PAS、αNAE和ALP細胞化學染色，顯微鏡觀察、拍照。同樣，新生兒臍血源性MSCs取第3代以后細胞進行細胞化學染色分析。

2結果

2.1羊水MSCs

從羊水中分離出的細胞,將之接種于PRMI1640培養基中,2～3d部分細胞開始貼壁,4～7d逐漸出現貼壁的MSCs,開始為圓形,逐漸伸出突起,呈成纖維樣、梭形，最初散在分布,后逐漸在局部形成集落生長(圖1)。一周以后MSCs迅速擴增(圖2),約10d后可達80%～90%融合,擴增變緩,即可傳代。傳代后羊水MSCs5～6h即可貼壁,2～4d生長迅速,1周后即可再次傳代。形態為均一的成纖維樣的MSCs，呈漩渦樣生長,即為羊水源性的MSCs(圖3)。

2.2新生兒臍血MSCs

臍血的單個核細胞懸液接種于φ60mm的塑料培養皿中，原代培養6d后，在倒置顯微鏡下可見單個或少量呈集落生長的貼壁細胞，形態大多為橢圓形或短梭形，凸出于培養皿表面。粘附于貼壁細胞之上的造血細胞和其他細胞在換液的過程中逐漸被清除，10d后就形成細小纖維狀小集落，20～25d后細胞集落不斷地擴大并形成融合超過80%，細胞形態大多呈短梭形。傳代培養后的臍血MSCs12h即可貼壁，4～14d生長迅速,10d后即可再次傳代,細胞呈短梭形生長(圖4，25×)。10代左右細胞生長狀態開始急劇衰退,細胞顆粒化嚴重，增殖速度嚴重放慢。

2.3MSCs的生長曲線

人羊水源性MSCs生長曲線呈“S”形，傳代后第1、2天為潛伏適應期，從第3天開始細胞增殖加速并進入對數生長期，第6至7天達到高峰，以后進入平臺期。通過對第3、5、8代新生兒臍血源性的MSCs細胞計數,繪制的生長曲線形狀與羊水源性MSCs生長曲線形狀相似，呈S形(圖5);傳代第1至3天為生長停滯期，第4對14天為快速增殖期，后即進入平臺期。隨傳代次數增加,MSCs的增殖能力有所減弱。第3、5代細胞增殖能力最強,第8代細胞較第3、5代細胞增殖能力減弱較明顯，但亦呈“S”形。

2.4不同源性MSCs的生物化學特征

羊水源性MSCs及臍血源性MSCs具有相同的生物化學特征，染色結果都顯示：POX、SB染色為陰性，αNAE、PAS為強陽性，ALP染色有1%為弱陽性，這與文獻報道的MSCs的染色特點相一致[34]。進一步證明了培養出的成纖維樣細胞為MSCs。圖1.4d羊水貼壁細胞圖2.7d羊水貼壁細胞圖3.10d羊水貼壁細胞圖4.10d臍血貼壁細胞圖5.羊水臍血MSCs生長曲線

3討論

間質干細胞具有多向分化潛能，是細胞組織工程的首選種子細胞之一。然而人骨髓中的MSCs含量較少，大約104～105個骨髓單個核細胞中只含有一個MSCs[5],這顯然難以滿足細胞組織工程的實際需要，因此尋找MSCs的來源和如何在體外分離擴增MSCs就顯得較為重要。為了更好的得到MSCs，我們分別對孕婦的羊水和新生兒臍帶血進行了MSCs的分離，并對所得的MSCs生物學特性進行了比較，以期得到更好的MSCs來源。

間充質干細胞的分離,我們主要參考了Friedenstein建立的MSC分離方法并做了適當的改進，利用MSCs的粘附性來獲得MSCs。本實驗將羊水細胞和臍血單個核細胞接種于含10%胎牛血清PRMI1640培養基中，3d后去除未貼壁細胞，待細胞單層長滿80%后，用胰酶消化傳代，本法可去除一些貼壁的非間質干細胞，經過幾次傳代后即可得到相對較純的MSCs。

本研究中采用孕婦的羊水和新生兒臍帶血標本都可以成功地得到MSCs，這與國外報道的相一致[6]，可作為未來組織工程學的一個不可或缺的來源[7]。兩者在形態和生物學特性上都非常類似，但是臍血源性的MSCs形態呈短梭形。明顯不同的就是人羊水源性MSCs增殖能力明顯要優于臍血源性MSCs,這一點可以從生長曲線與傳代能力都得到較好體現。人羊水源性MSCs群體倍增時間較臍血源性MSCs倍增時間短，且人羊水源性MSCs的傳代能力明顯強于臍血源性MSCs。

綜上所述，與臍血源性間充質干細胞增殖能力相比,羊水MSCs的獲得更為可觀，是組織工程種子細胞的又一可靠來源。

【參考文獻】

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[2]田少奇，王麗，孫康，等.人臍血間充質干細胞的分離培養及其多向分化潛能的實驗研究[J].中國骨與關節損傷雜志，2009，24(2)：108111.

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