恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理與用途探究

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即通過(guò)對(duì)靶序列的特異性擴(kuò)增，使其產(chǎn)生大量拷貝，以達(dá)到檢測(cè)水平。主要包括以下技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，又稱(chēng)為環(huán)媒恒溫擴(kuò)增技術(shù)或連環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是由Notomi等于2000年所開(kāi)發(fā)的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)[7]。LAMP的核心是具有鏈置換活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的應(yīng)用以及基于靶核酸6個(gè)特異性片段（即5’端的F1、F2和F3區(qū)和3’端的B3c、B2c和B1c區(qū)，其中F2區(qū)和B2區(qū)為目的擴(kuò)增片段）的4條特殊引物的設(shè)計(jì)，分別為上游內(nèi)部引物（FIP，由F1c區(qū)和F2區(qū)組成）、下游內(nèi)部引物（BIP，由B1c區(qū)和B2區(qū)組成）、上游外部引物（F3，由F3區(qū)組成）及下游外部引物（B3，由B3組成）。整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分為起始階段和循環(huán)擴(kuò)增階段。⑴起始階段：FIP的F2序列首先和模板F2c結(jié)合，引導(dǎo)合成互補(bǔ)鏈；隨后，F(xiàn)3與模板F3c結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下啟動(dòng)鏈置換合成并釋放出結(jié)合有FIP的完整互補(bǔ)鏈。此單鏈5’端F1c和F1自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模版，引物BIP和B3以相同的方式引導(dǎo)另一端鏈合成、鏈替換，從而形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。F1c末端可自發(fā)引導(dǎo)補(bǔ)齊中間單鏈缺口,使啞鈴狀單鏈轉(zhuǎn)化為雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。此產(chǎn)物可作為下一階段的起始物為L(zhǎng)AMP基因的擴(kuò)增循環(huán)提供模板。⑵循環(huán)擴(kuò)增階段：引物FIP與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合,以雙鏈中一條鏈為模板延伸,并釋放出另一條鏈,；釋出鏈游離3c端自身成環(huán),引發(fā)鏈延伸取代并釋放FIP引導(dǎo)合成的鏈,兩產(chǎn)物均可作為下一循環(huán)的起始物。引物BIP和FIP與上述產(chǎn)物的莖環(huán)結(jié)合重復(fù)以上延伸過(guò)程,使產(chǎn)物延長(zhǎng)同時(shí)釋放新的鏈成環(huán)并作為新的起始物。其最終產(chǎn)物為一系列長(zhǎng)度不同的莖環(huán)狀雙鏈DN段。LAMP靈敏度高、特異性好，且操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果易于判定，這些優(yōu)點(diǎn)使得該技術(shù)自成立十余年以來(lái)在病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等各類(lèi)病原體的基因檢測(cè)上得到了廣泛應(yīng)用。如：Suzuki、Iwata、Ihira等分別建立了巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、人類(lèi)皰疹病毒6型（HSV6）的LAMP檢測(cè)方法[8-10]；Iwanoto、Hara-Kudo、Seki等分別針對(duì)肺結(jié)核分支桿菌、沙門(mén)氏菌、肺炎鏈球菌建立了LAMP檢測(cè)體系，并對(duì)其靈敏度和特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)[11-13]；而Lin、Han等分別以弓形蟲(chóng)病、四種瘧原蟲(chóng)疾病為研究對(duì)象，比較了LAMP與real-timePCR、nestedPCR的檢測(cè)效能，證明LAMP技術(shù)可以作為流行區(qū)現(xiàn)場(chǎng)快速而簡(jiǎn)便的疾病篩選工具[14,15]。但因建立時(shí)間較短，LAMP仍存在一些不足，其中最大的缺點(diǎn)就是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。由于LAMP采用了多條引物，而且是在同一溫度條件下擴(kuò)增，引物之間有可能互補(bǔ)而擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性條帶。此外，產(chǎn)物鑒定只針對(duì)有或無(wú)，缺乏一定的特異性。

1989年首先報(bào)道的以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的和核酸擴(kuò)增技術(shù)[16]。該技術(shù)從互補(bǔ)的靶核酸（一般為RNA）合成DNA分子開(kāi)始，以新合成的cDNA為模版進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系主要涉及三種酶活性（T7RNA聚合酶、核糖核酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶）和兩條特異引物。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可分為非循環(huán)相和循環(huán)相。在非循環(huán)相中，以單鏈RNA為模板，先后在逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶和DNA聚合酶的催化作用下，生成帶有T7RNA啟動(dòng)子的雙鏈DNA（cDNA）；此雙鏈DNA在T7RNA聚合酶的催化下合成大量互補(bǔ)于靶序列的反義RNA，由此進(jìn)入循環(huán)相。循環(huán)相中，以反義RNA為模板，經(jīng)重復(fù)循環(huán)的進(jìn)行cDNA合成、RNA降解、T7RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄，使目的RNA不斷得以擴(kuò)增。TAS主要包括兩種反應(yīng)體系，即依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增（nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA）和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（transcriptionmediatedamplification,TMA）。前者又稱(chēng)為自主序列復(fù)制系統(tǒng)（self-sustainedsequencereplication,3SR），于1990年由Guatelli等首先報(bào)道[17]；1991年，Compton對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)描述[18]。該反應(yīng)體系所涉及的三種酶為：AMVRT（鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶）、RNaseH和T7RNA聚合酶。反映在42℃條件下，1.5h內(nèi)即可將RNA模版擴(kuò)增至109~1012倍。相對(duì)于NASBA的三酶體系，TMA使用的是二酶體系，即MMRT（money鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶）和R7RNA聚合酶。MMRT兼具有逆轉(zhuǎn)錄酶和RNaseH的活性，因此可省略RNaseH，從而降低反映成本，且使體系更穩(wěn)定。近年來(lái)，TMA與實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，出現(xiàn)了實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT），以直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況。TAS非常適用于單鏈靶RNA的擴(kuò)增，且不需RT-PCR中的RNA分離過(guò)程，從而使RNA病毒的檢測(cè)變得更加方便。Lau等人利用以NASBA為基礎(chǔ)的方法對(duì)包括禽流感病毒（AIV）、手足口疾病病毒（FMDV）在內(nèi)的多種動(dòng)物病毒進(jìn)行了檢測(cè)，證明了NASBA在動(dòng)物疾病監(jiān)測(cè)中的適用性[19]；Mohammadi-Yeganeh等針對(duì)HIV-1/HCV建立了實(shí)時(shí)多重NASBA，并對(duì)該方法的分析性靈敏度和特異性以及臨床靈敏度和特異性進(jìn)行了評(píng)估，得出結(jié)論：該方法可以作為HIV-1/HCV雙重感染病人篩查的廉價(jià)工具。此外，TAS在支原體、衣原體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原體的檢測(cè)中也得到了應(yīng)用[20,21]。然而，TAS循環(huán)過(guò)程較為復(fù)雜，須重復(fù)加入轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶，因此還有待進(jìn)一步改善。

SDA是1992年美國(guó)學(xué)者Walker等首次提出的基于酶促反應(yīng)的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)[22]。反應(yīng)體系涉及一種限制性?xún)?nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對(duì)引物、dNTP及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。反應(yīng)過(guò)程可分為DNA模版的制備、兩端帶有酶切位點(diǎn)的目的DN段的生成和SDA循環(huán)三個(gè)階段。基本原理是：引物與靶DNA序列在3’端雜交，形成兩端均為5’懸端的雙鏈。引物鏈的5’懸端含有限制酶（HincⅡ）的識(shí)別位點(diǎn)，外切酶缺陷的DNA聚合酶以dNTP（其中一種為-磷酸硫酸化三磷酸腺苷）為底物延伸3’端。HincⅡ限制性核酸內(nèi)切酶在半磷酸硫酸化識(shí)別位點(diǎn)的未保護(hù)鏈上打開(kāi)缺口，而修飾的互補(bǔ)鏈保持完整。切口處DNA聚合酶通過(guò)延伸其3’端而替代另一條DNA鏈；該替代鏈與引物雜交后又可作為另一反義擴(kuò)增的靶源，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的指數(shù)增長(zhǎng)。SDA的擴(kuò)增效率高，反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的儀器設(shè)備。Walker等采用SDA擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌總DNA中的一段序列，37℃2h后即可將靶序列擴(kuò)增108倍[23]。然而，SDA所存在的一些缺陷，如需四條特異性引物及經(jīng)修飾的dNTP作為底物、靶序列準(zhǔn)備復(fù)雜、產(chǎn)物不均一等，限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。為此，很多研究者在普通SDA的基礎(chǔ)上做了近一步改善。如DeanF.B和DetterJ.C等分別利用兩組特異引物和一組隨機(jī)引物建立了兩種新的鏈置換擴(kuò)增技術(shù)，即等溫多重鏈替換擴(kuò)增（isothermalmulti

HAD是由美國(guó)NewEnglandBiolabs的MyriamVincent等模擬動(dòng)物體內(nèi)的DNA復(fù)制機(jī)制所發(fā)明的一種新的體外基因擴(kuò)增技術(shù)[26]。其基本原理是：利用解旋酶打開(kāi)雙鏈DNA；再依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）與模板結(jié)合，使模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)其完整性；隨后引物與模板雜交，并在DNA聚合酶的催化下擴(kuò)增；新生成的雙鏈DNA可作為底物進(jìn)入下一輪的反應(yīng)。與其他恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，HAD操作過(guò)程更加簡(jiǎn)單，且整個(gè)過(guò)程可在同一溫度下進(jìn)行，可謂是真正的等溫?cái)U(kuò)增。HAD的這一優(yōu)勢(shì)表明，該技術(shù)在研發(fā)現(xiàn)場(chǎng)和作為基層DNA診斷工具方面具有很大潛力。在HAD的基礎(chǔ)上，Xu,Y等開(kāi)發(fā)了一種T7復(fù)制機(jī)器(包括T7解旋酶、外切酶缺陷的T7DNA聚合酶和T7Gp2.5SSB)，從而建立了一種新的擴(kuò)增方式—依賴(lài)解旋酶的環(huán)形擴(kuò)增（circularhelicase-dependentamplification,cHDA），利用cHDA可以在同一溫度下同時(shí)篩選和擴(kuò)增環(huán)形DNA樣本，如質(zhì)粒[27]。Tong等采用新型的恒溫?zé)晒舛亢怂釘U(kuò)增分析技術(shù)(HDA-TaqMan)檢測(cè)炭疽桿菌與霍亂弧菌等病原菌，提出此技術(shù)比傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增技術(shù)具有更好的穩(wěn)定性和特異性，明顯改善了PCR技術(shù)的假陽(yáng)性與假陰性的問(wèn)題[28]。作為一種嶄新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，HDA目前僅處于初期階段，從敏感性、準(zhǔn)確性和可操作性幾方面看，該方法還具有很大的發(fā)展空間。受DNA解旋酶的限制，目前主要用于擴(kuò)增小片段的DNA序列，還有待于尋找更有效的解旋酶以擴(kuò)大該技術(shù)的應(yīng)用空間。RCA技術(shù)是借鑒自然界中環(huán)狀病原微生物DNA分子的滾環(huán)式復(fù)制方式而建立的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，包括線性擴(kuò)增和指數(shù)擴(kuò)增兩種方式[29]。線性擴(kuò)增是指將一條引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上后，在DNA聚合酶的作用下延伸，產(chǎn)生大量與靶核酸互補(bǔ)的、含重復(fù)序列的線狀單鏈DNA。DNA的延伸可不斷進(jìn)行，產(chǎn)生的DNA鏈在長(zhǎng)度上連續(xù)分布，因此經(jīng)凝膠電泳后可見(jiàn)一條寬彌散帶。線性RCA用于靶核酸的擴(kuò)增時(shí)，僅限于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體，而且限于200bp以下長(zhǎng)度的環(huán)。由于其單鏈擴(kuò)增性，擴(kuò)增產(chǎn)物一般可始終連接在固相支持物的引物上，非常適宜于固相形式微陣列局部特異信號(hào)的檢測(cè)。指數(shù)RCA技術(shù)，又稱(chēng)之為超分支滾環(huán)擴(kuò)增（hyper-branchedrollingcircleamplification,HRCA）或分支擴(kuò)增（ramificationamplification,RAm）。此技術(shù)是在線性RCA的基礎(chǔ)上增加一條與環(huán)狀DNA序列完全一致的引物，該引物與線性RCA產(chǎn)物雜交并酶促延伸，延伸產(chǎn)物可作為第一條引物的模版進(jìn)行擴(kuò)增。如此一來(lái)，擴(kuò)增產(chǎn)量在短時(shí)間內(nèi)成指數(shù)遞增。曹娜娜等將RAM方法與電子芯片有機(jī)結(jié)合起來(lái)，在電子芯片上進(jìn)行RAM擴(kuò)增，以大腸埃希菌的O157志賀毒素基因2（shigatoxin2，stx2）作為檢測(cè)靶基因，確定了該方法的可行性[30]。DeanF.B.等利用φ29DNA聚合酶和一組隨機(jī)引物，在RCA的基礎(chǔ)上建立了一種新的擴(kuò)增技術(shù)，即多重引物滾環(huán)復(fù)制（multiply-primedrollingcircleamplification），其擴(kuò)增產(chǎn)物可用于DNA測(cè)序、體外克隆、文庫(kù)建立及其他分子生物學(xué)研究，目前該技術(shù)在DNA病毒基因組學(xué)的研究上已得到了廣泛應(yīng)用[31,32]。

核酸信號(hào)放大技術(shù)主要用于核酸分子不能直接擴(kuò)增或核酸分子濃度過(guò)低而無(wú)法檢測(cè)的情況。目前主要包括以下技術(shù)。2.1分支DNA放大系統(tǒng)（branchedDNAsignalamplificationassay,bDNA）bDNA,即分支DNA，是人工合成的帶有多個(gè)分支的DN段，其每個(gè)分支均可作為酶標(biāo)位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。bDNA技術(shù)由Chrion公司的Hom、Urdea等所構(gòu)建，其基本原理是：用親和素包被微孔；加入5’端標(biāo)記有生物素的第一組探針（捕獲探針），該探針不僅可與微孔中的親和素結(jié)合，且與待檢靶序列上的某區(qū)域互補(bǔ)；然后在微孔中加入待檢靶片段，與固定于微孔中的捕獲探針結(jié)合；再加入第2組探針，該探針一段與靶片段的某一區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，另一段與bDNA的主鏈部分序列互補(bǔ)結(jié)合；bDNA的每一分枝上都標(biāo)記堿性磷酸酶；以金剛烷（Dioxetane）作為底物，經(jīng)堿性磷酸酶作用可發(fā)射光子，由熒光分析儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)報(bào)告結(jié)果。Flagella等將bDNA技術(shù)與以液相芯片熒光微珠為基礎(chǔ)的平臺(tái)相結(jié)合，建立了一種高特異性的檢測(cè)方法—多重分支DNA。該方法不需經(jīng)過(guò)RNA的純化或目的片段的擴(kuò)增，直接以細(xì)胞裂解物和組織勻漿為標(biāo)本即可測(cè)定多重基因mRNA的表達(dá)水平。多重bDNA技術(shù)為大規(guī)模樣本特定基因表達(dá)圖譜的測(cè)定提供了強(qiáng)有力的工具[33]。2.2侵染探針（invader）Invader技術(shù)是美國(guó)三波技術(shù)公司所開(kāi)發(fā)的一種等溫DNA和RNA定性和定量檢測(cè)方法。該技術(shù)使用一個(gè)耐熱的內(nèi)切核酸酶，根據(jù)結(jié)構(gòu)特征在特異位點(diǎn)切割核酸分子。Invader體系包括兩個(gè)特異性寡核苷酸引物：上游引物和下游引物，又分別稱(chēng)之為侵染探針和信號(hào)探針。反應(yīng)過(guò)程中，上游引物全部序列和下游引物3’端均能與靶核酸雜交結(jié)合，下游引物帶有熒光標(biāo)記的5’端因不能與靶核酸結(jié)合，就如同在上游引物的侵入下而形成的翼狀突出。內(nèi)切核酸酶可識(shí)別這種特定結(jié)構(gòu)并將其突出的5’端剪切下來(lái)，被剪切的信號(hào)探針則與靶核酸分離。隨后新的信號(hào)探針再次與靶核酸雜交結(jié)合，而后被剪切。每個(gè)靶核酸每小時(shí)能促使釋放上千個(gè)“翼”，所釋放的5’翼在含有熒光共振能量傳遞的通用報(bào)告系統(tǒng)（FRET）中，又可作為第二次入侵的侵染探針，再次形成侵入結(jié)構(gòu)從而被內(nèi)切酶識(shí)別切割，從而進(jìn)一步達(dá)到信號(hào)放大的效果。切割下來(lái)的5’翼可用熒光板讀取器檢測(cè)，其熒光強(qiáng)度與靶分子量成正比。Invader體系無(wú)需核酸擴(kuò)增即可直接從基因組DNA中檢測(cè)目的基因。該方法方便、快捷，同時(shí)具有較高靈敏度，因此可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。此外，因堿基錯(cuò)配可抑制內(nèi)切酶的識(shí)別與剪切，所以該體系也適用于大范圍檢測(cè)基因組單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[34]。

恒溫?cái)U(kuò)增各技術(shù)原理不同，這使得每一項(xiàng)技術(shù)在其發(fā)展應(yīng)用過(guò)程形成了自己的特色，總結(jié)如下。盡管恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，且擴(kuò)增方式各不行同，所需要本量、樣本處理方式等也存在很大差異，但這些特點(diǎn)注定恒溫技術(shù)將優(yōu)于非恒溫技術(shù)（PCR），在分子生物學(xué)發(fā)展中占有一席之地。而操作簡(jiǎn)便、過(guò)程恒溫的本質(zhì)，使得這些技術(shù)在開(kāi)發(fā)便攜式基因診斷工具方面具有很大潛力，這將極大促進(jìn)和改善很多疾病的快速診斷技術(shù)和現(xiàn)場(chǎng)篩查現(xiàn)狀，從而為人類(lèi)的健康做出巨大貢獻(xiàn)。

本文作者：賈利芳韓建平胡薇工作單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所