害蟲抗藥性遺傳分析論文

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摘要根據生物進化理論深入理解害蟲抗藥性進化的遺傳起源，并根據解釋基因新功能進化的基因重復理論，推測認為基因重復為抗性基因變異提供了原材料。最后，根據現有抗性報道的例子將抗性突變的分子機制進行歸類，并發現在多樣化的抗性突變中存在一定的規律性，如靶標位點的點突變導致抗性的機制是靶標抗性機制的主要形式，基因擴增或基因過表達導致的代謝酶活性增加是代謝抗性的重要機制，這種規律性與變異的適合度密切相關。

關鍵詞害蟲，抗藥性，進化，起源，遺傳，機制

害蟲對化學農藥的抗性進化歷史不到100年，就已經有500多種害蟲對一種或多種殺蟲劑產生了抗性。害蟲抗藥性的進化導致化學防治的失效，給農業產量造成很大的經濟損失，例如據Palumbi估計，在美國每年由于害蟲產生抗性導致的損失至少有30多億美元，這其中包括由于抗性加大農藥使用的額外消費以及抗性害蟲對農產品的直接損失。

早在1951年Dobzhansky就認為，殺蟲劑抗性是一種進化現象。遺傳分析可以有助于研究抗性機制和制訂抗性治理策略，是研究抗性的一個主要工具。本文從遺傳角度對抗性進化的本質進行探討，并歸納分析抗性基因突變的主要類型，以期對害蟲抗藥性的進化的有更好的理解。

1、害蟲抗藥性進化的遺傳起源

1.1遺傳變異是害蟲抗藥性進化的基礎

由于害蟲對殺蟲劑的抗性是生物進化的一個特例，可以從生物進化角度對害蟲抗藥性進化進行分析。生物進化的基礎是生物遺傳結構的不穩定性即遺傳的相對保守性和變異的絕對性，這種變異的絕對性結合環境的復雜性造成了生物的多樣性，給生物進化帶來可能。誘導變異大致分2種情況，一種是生物在自身的遺傳體系中發生的變異，這種變異具有普遍性；另一種是由外在的多樣化的環境條件誘導的(包含輻射誘導、化學和物理誘導等)。

在藥劑選擇前，害蟲種群內存在著大量的變異，這其中就包括在歷史進化過程中由于自身的繁殖發育而產生的遺傳變異和由于外在的環境誘導的變異。這些變異是抗性進化選擇的原料，故藥劑首先作為抗性基因型的選擇劑存在，這符合“前適應假說”的解釋。最近一個研究報道很好地證明了這個假說，Hartley等研究表明在采自于殺蟲劑應用前的澳大利亞羊綠蠅Luciliacuprina品系中檢測到對馬拉硫磷的抗性。但這不是說藥劑不會誘導抗性發生，若藥劑長期作用，害蟲種群肯定會慢慢適應進化出對應的變異，但這類變異的進化過程很漫長，遠遠不及藥劑的選擇作用快，故藥劑普遍作為選擇劑。藥劑除了可能對遺傳變異有誘導作用的可能之外，還有可能存在對抗性變異的促進作用，如殺蟲劑可以促進基因擴增，從而促進抗性進化。

通常變異是不利性，因為其干擾了在歷史長河中進化而成的正常穩定的遺傳結構。若無外在的定向選擇作用，此變異會因隨機性而以極低頻率存在，甚至會被自然選擇所淘汰。也就是說，只有當外在的選擇對某種變異有定向的篩選作用時，此變異才呈定向性。所以說害蟲抗藥性的進化是定向選擇，而不是定向變異的結果。

遺傳變異是害蟲抗藥性進化的基礎，原始野生害蟲種群中存在大量頻率極低的變異等位基因，這些基因都是殺蟲劑選擇的原材料。殺蟲劑選擇是抗性進化的主要動力，即人類是進化的最大驅動力。因此被殺蟲劑選擇的變異基因的頻率上升就是害蟲抗藥性進化的本質。

1.2基因重復為遺傳變異提供了原材料。是抗性進化的主要根源

突變是所有遺傳變異最本質的起源，但是從短期來看，普遍認為基因重復是新基因功能的主要原材料。理論認為基因重復在初期階段導致功能過剩，基因重復后，早期存在對保留原始功能的基因拷貝具有正向選擇(positiveselection)作用，即其它重復基因有可能會簡單地通過退化突變(degenerativemutations)而成為沉默基因或無功能基因，因隨機漂變而生存下來。又因為大部分突變對適合度是有害的，故所有模型預測這種無功能化(non－functionalization)是最常見的情況。極少數情況下，在一個基因拷貝保留原有的功能的基礎上另一個拷貝可能接受了一個新的有益的功能，通過自然選擇而被保持下來也即是新功能化(neofunctionalization)過程。雖然基因重復被進化成新功能的幾率很罕見，但這些重復基因的隨機沉默對新物種的被動起源進化起了明顯作用。

由于抗性進化是一種進化現象，基于以上理論，抗性基因變異的主要原料是基因重復，其進化實質是由原來的基因進化成具有新功能(表現為抗性相關)的基因。進一步推論，與抗性相關的變異基因在藥劑選擇前有2種存在可能，一種是抗性變異基因以沉默基因形式存在于害蟲基因組中，即基因重復后這些無功能基因因隨機漂變而生存下來。現研究證明了抗性基因家族中存在沉默基因，如岡比亞按蚊Anophelesgambiae的P450家族下的5個成員是假基因，GST家族的一個基因(GSTd6)也可能是無功能基因。又如研究證明無效等位基因met調控met基因的轉錄水平引起保幼激素(JH)受體基因met的產物完全消失導致保幼激素類似物(JHAs)抗性產生。另一種可能是抗性變異基因以功能基因形式寄存在害蟲個體內隨機存在，因變異基因大部分伴隨著適合度的下降，其存在幾率極低，也就是抗性等位基因初始頻率很低。

因此，藥劑對抗性基因的選擇作用也可以分成2種，一是在基因組中對抗性基因的選擇作用，即有利于在藥劑選擇壓力下生存的變異的無功能等位基因漸漸取代基因組中原始基因拷貝的主導地位的過程。另一種是對抗性基因型的選擇作用，即對抗性基因的寄主——表現為抗性的害蟲個體的篩選。由于害蟲種群中隨機存在著抗性個體，而且沉默基因取代原始基因的過程很慢，故一般情況下藥劑直接對抗性基因型進行篩選。但是若從田間采集昆蟲在室內進行抗性篩選時采集的試蟲基數很小，很可能該昆蟲群體中沒有抗性變異的害蟲個體來配合藥劑的篩選，這種情況下對抗性基因的選擇作用就有可能出現，但抗性上升速度很慢。

2、害蟲抗藥性進化的分子機制

由于基因重復后導致的功能過剩，重復基因由于不受功能上的限制，很可能會出現豐富多樣的變異類型，所以說抗性基因變異機制很豐富。但在多樣化的基因變異中，又有一定的規律性，如靶標位點的點突變導致抗性的機制是靶標抗性機制的主要形式，基因擴增或基因過表達導致的代謝酶上調是代謝抗性的重要機制。這種規律性是由在自然選擇下對基因變異的隨機選擇作用和在藥劑選擇壓下對更適應此環境的變異的定向選擇作用共同導致的。這也說明抗性基因的變異機制的存在受到其本身所伴隨的適合度代價(fitnesscost)和對藥劑選擇壓的適應能力的影響。

從現有的害蟲抗藥性事例來歸納，抗性基因變異主要有以下3種機制。

2.1結構基因的變化(genestructurechange)

現有的害蟲抗藥性研究表明基因結構的變化機制主要是點突變(其中絕大部分是屬于單個點突變)。

2.1.1點突變點突變有2種機制，一種是無義突變(nonsensemutation)，即某個核苷酸的突變導致了終止密碼子(如ATT)的出現，使轉錄提前終止。例如昆蟲對生物農藥Bacillussphaericus(球形芽孢桿菌)的抗性機制就是無義突變。其抗性機制為編碼毒素結合蛋白Cpm1蛋白的Cpm1基因發生點突變，導致翻譯的提早終止，使Cpm1的疏水末端被切除，阻止了Cpm1蛋白與胞質膜的結合，使毒素的殺蟲作用消失，但對毒素與Cpm1蛋白的結合沒有影響。另外一個事例是Xu等報道由于一個提早終止密碼子的出現導致一個鈣粘素基因Ha-BtR的分裂與棉鈴蟲Helicorverpaarmigera對Bt抗性緊密聯系。

另一種突變機制是錯義突變(missensemutation)，即基因的編碼區中的一個核苷酸被另一個不同的核苷酸取代，導致產生不同的氨基酸，使基因產物的三維結構發生變化而產生抗性。由于三維結構的改變而導致與其作用部位結合能力的降低或增加(靶標抗性機制)，或降低基因產物對殺蟲劑的代謝能力(代謝抗性機制)。這種結構的改變并不改變產物的量，而是改變產物的質。大多數殺蟲劑都是以一個關鍵蛋白作為靶標，現研究表明Ace.Nla.Rdl.para.met基因的點突變就可相應地導致殺蟲劑靶標受體——昆蟲體內的乙酰膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿煙堿受體(nAChR)、γ－氨基丁酸(GABA)受體、鈉通道、保幼激素(JH)受體的結構的變化，從而導致昆蟲個體對相應的殺蟲劑的靶標抗性產生。另外，也有研究表明代謝酶如酯酶的基因結構的改變，可導致基因產物代謝酶的質的變化，從而導致昆蟲個體對相應的殺蟲劑的代謝抗性產生或變化。

靶標位點的點突變所造成的變異程度相對于其他變異機制而言是較弱的，這樣的基因相對保守性既保證了蟲體內在機能的正常運作足以使其存活下來，又使殺蟲劑結合能力下降，從而表現出對殺蟲劑的抗性。因此在以靶標機制作用的殺蟲劑的選擇壓下，靶標位點的點突變更具有生存的優勢。

2.1.2基因重組一個品種中可能同時存在幾個突變的組合，這樣可導致更高水平的抗性產生。如Mutero等將在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的不同抗性品系的Ace基因中發現的不同點突變的組織進行表達后發現，高水平的抗性可能是由不同點突變的組合所引起，這些點突變單獨存在時只表達很低的抗性；Kozaki等也證明了Ace內的多點突變和基因內重組能使害蟲的抗性明顯增加。

基因重組增加了異常等位基因的數量和頻率，因此對抗性基因進化有重要的影響。Mmem等認為自然種群中存在的抗性等位基因之間的重組是害蟲迅速適應新的選擇壓的一個機制。幾個點突變的重組可產生較高的抗性水平，但同時也造成了較大的適適合度代價。當有殺蟲劑選擇壓時，單個突變可以通過重組形成產生較高的抗性雜合子的種群而生存下來，當無選擇壓時，有多個點突變的個體可以和敏感個體雜交而保存抗性突變，具有這種雜合子的種群也具有一定水平的抗性，最初表現出一定的雜種優勢。但隨著殺蟲劑選擇壓消退，這種雜種優勢也漸漸退化。

2.1.3移碼突變——基因缺失與插入染色體的缺失具有很大的致死性，這對生物個體的生存非常不利。目前在抗藥性基因的研究中也發現抗性基因或基因片段的缺失機制。如Morin等報道抗Bt棉紅鈴蟲Pectinophoragossypiella品系的3個鈣粘素突變等位基因都發生了氨基酸的片段缺失；蘇建亞報道棉鈴蟲抗性品系對Bt棉高水平抗性是由于鈣粘素基因發生了大片段缺失突變所至。Gahan等報道的因反轉座子介導的序列插入導致鈣粘素基因家族的一個基因的突變是一種基因序列的插入機制。

由于移碼突變相對于錯義突變而言，其變異程度較大，并伴隨較大的適合度代價，故在藥劑選擇前這些突變的存在幾率就相對較低，而且藥劑選擇后對生物個體的生存也不利，因此發現移碼突變的抗性機制的事例不是很多。

2.2基因擴增

基因擴增是生物對環境有害化學物質產生抗性的一種基本而普遍的機制。一個基因擴增的結果是在DNA中呈現該基因的許多拷貝。基因擴增和基因表達的改變導致基因產物的過表達是代謝抗性的主要機制。

對于酯酶介導的抗性，基因擴增是酯酶過表達引起抗性的主要機制。例如這些酶的產物過量在桃蚜Myzuspersieae，庫蚊Culicinemosquitoes以及褐飛虱等昆蟲體內被證實。

然而，大部分抗性品系P450s過表達的事例不是由基因擴增引起，但Nikou等報道通過southern印跡分析法，發現基因擴增是菊酯抗性按蚊A.gambiae品系的CYP621基因過表達的一個原因。

另外，目前尚未發現GST酶系的基因擴增與殺蟲劑抗性有關。這表明在GSTs引起的抗性中，若不是全部但至少是大部分事例似乎與基因擴增無關。

基因擴增的機制可能有轉座子(transposableelement)或可移動因子(mobileelement)的作用、跳遠式重復(saltatoryreplication)、無插入序列的頭尾連接式(hcad-to-tailtandemfashion)排列方式、姐妹染色體間的隨機不平等交換(randomunequalcross-over)以及基因重復后誤排導致串聯重復(tandemrepeat)等機制。

在代謝抗性中，解毒酶的量變更有利于害蟲在維持蟲體的生存的基礎上對毒物的不利作用的抵抗。由于中等水平的基因擴增的變異速率較高且其多效性適合度下降(Dleiotropiefitnesscost)較弱，基因擴增機制在代謝酶的上調節中很普遍。

2.3基因表達的改變

這類機制在與抗性相關的GSTs和P450單加氧酶系中已被證實，但是雖然基因調節可以解釋酯酶A1的產物過量，可尚未在酯酶介導的代謝抗性中發現。

基于GSTs的抗性的分子基礎已在家蠅Muscadomestica及蚊類昆蟲A.gambiae和Aedesaegypti中很好地被研究。在所有的事例中，抗性昆蟲的GS％上調節是由于反式上調作用引起；而在P450s的轉錄調節中，順式或反式作用都有可能。

目前，許多事例研究發現了抗性品系的P450s過量表達，例如，抗DDT果蠅D.melanogaster品系的CYP6A2和CYP6G1基因的過表達、抗二嗪磷家蠅肘，domestica品系的CYP6A1基因過表達、抗菊酯棉鈴蟲(H.armigera)的CYP687基因過表達、抗菊酯庫蚊品系的CYP6E1基因過表達、抗菊酯按蚊A.gambiae品系的CYP621基因過表達，以及抗溴氰菊酯庫蚊C.PiPienspallens品系的CYP6F1基因過表達等。

當藥劑直接以毒物形式作用于蟲體時，解毒酶的上調節導致抗性增加；而當藥劑作為前體殺蟲劑應用即須先被代謝成毒物，代謝酶的下調節將增加抗性。這種機制有許多事例，但分子機制尚不祥。例如，在Bt抗性中，就可以通過蛋白酶下調引起Cry毒素的活性下降從而導致抗性。

在靶標抗性中也有關于基因表達的改變導致的抗性機制的報道，如鈉離子通道的para基因的反式下調作用(trans-down-regulation)機制。

另外，Wilson和Ashok試驗證明JH受體基因met的產物完全消失(也就是基因沉默現象)導致抗性產生，并證明了是由無效等位基因met調控met基因的轉錄水平引起的。JH受體蛋白不是個體生存所必需的，也就是說編碼JH受體蛋白的基因是無效基因(nullgene)，分子分析已證明JH抗性基因met是無效基因。因這些無效基因的缺失或沉默導致受體蛋白的消失或其功能消失從而能使抗性產生，而且適合度下降的程度也不會很大。假如這種推測被驗證是正確的，那么無效基因的變異就拓寬了抗性基因變異范圍，使害蟲對殺蟲劑選擇壓的適應范圍加大。

另外，小幅度的缺失、插入和調控元件的轉座可能會擾亂基因表達的空間和時間形態，從而導致抗性。

雖然基因表達的調控方式多樣，但是代謝酶的上調機制在代謝抗性中很普遍。

本文在生物進化理論的基礎上分析了害蟲抗藥性進化的遺傳本質，在現有的研究結果的基礎上總結了害蟲抗藥性的分子基礎，這將有助于理解抗性進化的基礎，而且對抗性研究以及抗性治理與預防工作有很好的理論指導意義。

隨著一些昆蟲(例如家蠅Drosophila和按蚊Anopheles)的基因組全序列被克隆及分析，殺蟲劑抗性的研究進入基因組時代，抗性的分子基礎將會被更好的理解。特別是在酯酶，細胞色素P450酶系和谷胱甘肽轉移酶等多基因家族的基因成員控制的抗性研究中，基因組途徑將是一個很有前景的研究方法。