預處理劑影響豌豆根尖細胞分裂論文

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【摘要】：本實驗以豌豆為材料，用不同質量濃度的秋水仙素(0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0g/L)和8-羥基喹啉(0，0.002，0.004，0.006，0.008，0.010mol/L)作為預處理劑，設計處理時間為3.0h，分析了不同預處理劑對豌豆根尖細胞有絲分裂的影響。結果表明，(1)用1.0g/L的秋水仙素處理，(2)用0.004mol/L的8-羥基喹啉處理，處于有絲分裂中期的細胞數目百分率最高。

【關鍵詞】：豌豆；預處理劑；8-羥基喹啉；秋水仙素

Abstract:Theeffectsofdifferentpretreatmentagentstomitosisofpease’sroottipcellswereanalyzedwithpeaseastherawmaterial,anddifferentcolchicinesdensities(0,0.1,0.5,1.0,1.5,2.0g/L)anddifferent8-HQdensities(0,0.002,0.004,0.006,0.008,0.010mol/L)aspretreatmentagentswithinthetreatmentperiodsof3.0h.Theresultsshowedthatthehighestpercentageofmetaphasemitoticisinthedensityof1.0g/Lcolchicinesandinthedensityof0.004mol/L8-HQ.

Keywords:pease;pretreatmentagent;8-HQ;colchicine

前言：

染色體是遺傳物質最主要的載體，在有絲分裂過程中，染色體的形態和結構表現出一系列規律性的變化，尤其是分裂中期的染色體收縮程度良好，適于進行染色體形態的識別和研究。但是在整個細胞分裂周期中，中期細胞數較少，且染色體因紡錘絲的牽引而緊密排列在赤道板上，造成計數及識別染色體形態、結構的困難。為了獲得較多的染色體分散好的中期細胞，常使用某些化學試劑，對材料進行預處理，使細胞同步分裂，提高細胞的分裂指數。

目前，國內已有不少用預處理劑處理各種材料的細胞分裂的報告，梁鎮林等以大豆為材料，用0.002mol/L的8－羥基喹啉為預處理劑；張杏輝等以蠶豆為材料，用10.0g/L/的秋水仙素為預處理劑；秦素平等以大蒜為材料，用8-羥基喹啉和秋水仙素為預處理劑，都獲得了同步化較好的分裂細胞。這些研究表明，要想得到較多、較好的有絲分裂細胞，選擇合適濃度的預處理劑及處理時間是很關鍵的。但不同植物對不同的預處理劑的反應是不同的。

本實驗以豌豆根尖為材料，用秋水仙素和8－羥基喹啉作為預處理劑，在不同濃度下處理豌豆根尖，目的在于尋找合適的秋水仙素濃度和8－羥基喹啉濃度。

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料：豌豆：市售。

試劑：8－羥基喹啉，秋水仙素。

1.2方法

1.2.1根尖培養方法選擇大小均勻無損傷的豌豆置于培養皿中,在室溫條件下用蒸餾水培養。每天換水1次。待根尖長至1.5～2.0cm時于上午9:00～10:00取材。

1.2.2材料處理方法分別用質量濃度為0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0g/L的秋水仙素和0，0.002，0.004，0.006，0.008，0.010mol/L的8－羥基喹啉溶液處理豌豆根尖3.0/h，之后分別用卡諾氏固定液于4℃冰箱中固定10h，固定后的材料用1mol/LHCl在60℃恒溫下酸解15min，用改良品紅染色；采用常規壓片法制片,選擇有代表性的制片，每張制片統計4-5個視野，從中統計分裂細胞數及分裂中期細胞數。

有絲分裂指數=Σd/N×100

Σd：為各觀察視野內分裂細胞數總和；

N：為各觀察視野內細胞總數。

2.實驗結果與分析

不同濃度的秋水仙素處理豌豆根尖細胞，具有一定的影響。結果表明，用1.0g/L的秋水仙素處理的豌豆，其分裂細胞處于分裂中期的數目最多。但是此后隨著濃度的增加，處于分裂中期的細胞數目反而下降(表1)，這說明并不是濃度越高越好，只有適當的濃度才能達到使紡錘絲形成受阻率最高的目的。

不同濃度的8-羥基喹啉處理豌豆，其根尖細胞處于分裂中期的數目各不相同，結果表明，0.004mol/L8-羥基喹啉處理的豌豆中期細胞所占的比率最高，為58.97%。與其它處理濃度有比較明顯的差異。8-羥基喹啉的作用機制是引起細胞質黏度的改變，結果導致紡錘絲的活動受阻。從表2可以看出，8-羥基喹啉對豌豆根尖有絲分裂有一定的影響，但當濃度超過0.004mol/L時處于細胞分裂中期的細胞百分率反而降低，因此只有適當的濃度才有利于抑制紡錘絲的形成，使分裂細胞更多地處于細胞分裂中期。

本次實驗取材的方法會影響到實驗結果，因為只有根尖才會有細胞處于分裂期，如果取材時切得稍微高一點，就會使得有絲分裂指數降低。數細胞時因為是取不同的視野進行數數，由于人為的原因會挑選一些比較理想化的視野，這也有可能導致了實驗結果的不真實性，還有由于細胞數目太多，數數時也存在人為的誤差。

表1.不同濃度的秋水仙素對豌豆根尖細胞有絲分裂的影響

處理劑濃度/（g/L）細胞總數分裂相中期細胞

數目指數%數目比率%

0546366.5938.30

0.1538417.62717.07

0.5567346.001235.29

1.0598437.192967.44

1.5572305.251136.67

2.0541397.21615.38

處理劑濃度/（mol/L）細胞總數分裂細胞數中期細胞

數目指數%數目百分率%

0528356.63514.29

0.002547315.671135.48

0.004589396.622358.97

0.006571366.311644.44

0.008562376.581232.43

0.010538295.39724.14

表2.不同濃度的8-羥基喹啉對豌豆根尖細胞有絲分裂的影響

3.討論

一般來說，凡是進行分裂的分生組織、器官甚至單個細胞，都可用于染色體觀察。但也不是隨意取來上述材料都可以獲得期望的結果。因此，適當取材是非常關鍵的。如果要研究染色體計數及核型分析，染色體最好應滿足以下三個條件，(1)染色體所處的分裂時期應準確可辨；(2)染色體縱向濃縮均勻一致；(3)縊痕顯示清晰。本研究就是以豌豆根尖為材料,經不同濃度的秋水仙素和8-羥基喹啉預處理,結果表明,經預處理的材料能較多地積累中期細胞,且染色體分散性好,易于進行更深入的分析研究。

另外,取材時間也是非常關鍵的。在一晝夜的時間里,以上午8:00～10:00時取材最好,此時豌豆根尖正處于分裂高峰期。

實際上,細胞分裂是不同步的。使用某些理化因素,對材料進行預處理可使細胞同步分裂,提高細胞分裂指數。良好的預處理方法能夠積累較多的中期細胞,并能使中期染色體適當凝縮、分散。秋水仙素（colchicine）是一種生物堿，因最初從百合科植物秋水仙（Colchicumautumnale）中提取出來，故名。分子式C22H25O6N。純秋水仙素呈黃色針狀結晶，熔點157℃。易溶于水、乙醇和氯仿。味苦，有劇毒。秋水仙素作為預處理劑,其主要作用有兩方面,其一是抑制微管蛋白組裝成紡錘絲,但并不抑制前期的細胞分裂,因此凡進入中期的染色體均被阻而不能進入分裂后期,這樣便可以積累大量處于分裂中期的染色體。其二是它可以使染色體縮短變直,便于染色體分散和計數。8-羥基喹啉分子式C9H7NO，為白色或淡黃色結晶（或結晶粉末），幾乎不溶于水和乙醚，而溶于乙醇或稀酸。所以配制8-羥基喹啉溶液時可以先將粉末溶于少量乙醇。8-羥基喹啉作為預處理劑的最大優點是顯示縊痕清晰,染色體分散,適于染色體計數及核型分析或顯帶技術等。

4.參考文獻

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