淺談3R原則及實驗設(shè)計

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摘要：3r原則（即替代，減少，優(yōu)化）廣泛適用于實驗教學(xué)和任何科研領(lǐng)域的動物實驗中。成功應(yīng)用3R的關(guān)鍵是在收集數(shù)據(jù)之前，需要提前考慮好合理的實驗設(shè)計和分析方法。很多實驗設(shè)計原則，比如實驗設(shè)計要有效、可靠和高效；實驗結(jié)果的統(tǒng)計方法要清晰透明；在實驗室確保對動物福利的尊重和理解，都是有助于實現(xiàn)3R原則目標(biāo)的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞：3R原則；實驗設(shè)計；應(yīng)用

3R原則適用范圍很廣，比如基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的實驗教學(xué)，科學(xué)研究，或是獸醫(yī)學(xué)，最直接的就是實驗室的動物實驗。然而目前，3R原則是否可以成功應(yīng)用于實驗室，仍然是一個不容樂觀的問題。十年前歐盟每年用于研究和藥物檢測的實驗動物大約1200萬只，美國每年至少1700～2200萬只[1]。而最近幾年每年全球?qū)嶒瀯游锸褂昧款A(yù)計至少在一億以上。然而，這還僅僅是保守估計，因為很難準(zhǔn)確統(tǒng)計出所有用于實驗的動物數(shù)量，大部分國家不會將相關(guān)數(shù)據(jù)公布出來。從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)可以清楚地看到，在過去幾十年里，用于科學(xué)研究的實驗動物數(shù)量有增無減。合理應(yīng)用3R原則可以有效解決這個問題，因此，3R原則及其在實驗中的應(yīng)用和推廣至關(guān)重要。

13R原則

3R原則是1959年英國動物學(xué)家WilliamRussell和微生物學(xué)家RexBurch在經(jīng)典著作《仁慈試驗技術(shù)原理》提出的[2]。3R原則中的“R”分別是replacement（替代），reduction（減少），refinement（優(yōu)化）。作為實驗動物倫理法則，應(yīng)用于任何與動物實驗相關(guān)的科學(xué)研究、實驗教學(xué)及其他領(lǐng)域中。旨在倡導(dǎo)研究者在工作中用其他實驗方法或?qū)嶒灢牧先〈鷮嶒瀯游铮ㄟ^合理的實驗設(shè)計把實驗動物的使用量降到最低，改善或者降低實驗動物承受的痛苦。第一個“R”，replacement（替代），分為絕對替代和相對替代。絕對替代是最理想的結(jié)果，比如通過計算機建立虛擬模型來替代活體動物和動物來源的細胞、組織、器官，完全取代實驗動物。而相對替代，則是指使用動物來源的，已經(jīng)建立好的細胞系，或者用低疼痛感的模式動物（單細胞動物）替代哺乳動物。第二個“R”，reduction（減少），指在不影響實驗數(shù)據(jù)的“質(zhì)”和“量”的前提下，盡可能減少實驗動物的使用量，提高實驗動物的利用率和實驗的精確度。“減少”不單是指在原有的實驗上減少使用實驗動物的數(shù)量，除此之外，還有一層“相反”的含義，就是增加單個小實驗的動物使用量，所獲得的實驗結(jié)果可以有效減少整個實驗設(shè)計所需的動物數(shù)總量。最后，第三個“R”，refinement（優(yōu)化），指通過任何途徑來避免或減少實驗動物現(xiàn)有的或潛在的精神緊張、痛苦和不良反應(yīng)，提高實驗動物福利。Russell和Burch把對動物的傷害分為必然傷害和偶然傷害。必然傷害是指實驗設(shè)計帶給實驗動物的傷害，偶然傷害則是由于操作不當(dāng)對實驗動物造成的意外傷害。

23R在實驗設(shè)計中的應(yīng)用

無論是教學(xué)還是科研，3R原則在實驗設(shè)計部分的應(yīng)用至關(guān)重要，因為實驗設(shè)計與分析方法從根本上決定了實驗動物的“最少”使用量和實驗動物承受的“最低”痛苦。“最少”和“最低”是指在理想狀態(tài)下，沒有因?qū)嶒灢僮鞑划?dāng)造成實驗動物意外的死亡和不必要的傷害。實驗設(shè)計的目的，通常是驗證假設(shè)，一般我們可以通過檢測某個特異性指標(biāo)來驗證假設(shè)。無論是通過何種方法驗證假設(shè)，3R原則都應(yīng)該始終貫穿其中，即與實驗設(shè)計和分析緊密相連，盡量用模式動物替代哺乳動物，或者在實驗教學(xué)中，用模擬實驗替代動物實驗；減少對實驗結(jié)果價值很少甚至沒有價值的實驗動物的使用，避免不必要的浪費；優(yōu)化實驗方法，以避免或減少實驗動物的痛苦，精神緊張和傷害的時間，以改善實驗動物福利[3]。如何在保證實驗結(jié)果的前提下，遵循3R原則，在實驗設(shè)計階段，把實驗動物使用量降到最低，把實驗動物承受的痛苦降到最低，是每一個研究者在設(shè)計研究方案期間必須思考的問題。2.1減少實驗中所需要的動物數(shù)量。2.1.1判斷適當(dāng)?shù)臉颖敬笮　＠硐肭闆r下，如果不考慮倫理，資金，時間，人力物力或其他方面的成本，研究人員希望通過檢測全部目標(biāo)人群來揭示事物的本質(zhì)或者真理。顯然，在絕大多數(shù)情況下，這既不可能也不可取，因此，研究人員必須在保證研究結(jié)論具有一定可靠性的前提下，估算最少的樣本量。不能少于“必要的數(shù)量”，也不能過多。這個數(shù)字無論過多還是過少，對實驗結(jié)論和實驗動物都是不負(fù)責(zé)的表現(xiàn)。理論上，“必要的數(shù)量”（樣本量）取決于實驗設(shè)計，統(tǒng)計的變量類型（連續(xù)型變量，分類型變量等）。檢驗水準(zhǔn)、檢驗功效、總體標(biāo)準(zhǔn)差、容許誤差都是決定樣本含量的要素。實驗設(shè)計和分析方法越復(fù)雜，精密度準(zhǔn)確度要求越高，需要估計的未知變量越多，樣本就越大，計算也越復(fù)雜。2.1.2采用高效的設(shè)計方案。為了增加實驗的檢驗功效，研究者可以增加樣本量，減少現(xiàn)有實驗的變異，采用替代措施，在解答相同研究假設(shè)的基礎(chǔ)上，獲得更大的（標(biāo)準(zhǔn)化）效應(yīng)量。比如應(yīng)用區(qū)組化設(shè)計消除個體變異對實驗結(jié)果的影響，或者在嵌套設(shè)計中，采用因素組合而不是一次測試一個因素，這樣可以從相同數(shù)量的動物中收集更多信息，并且每個因素組合可以設(shè)計有相對較少數(shù)量的動物。2.2使用其他手段替代動物實驗。在實驗設(shè)計中應(yīng)用絕對替代，必須保證獲得的數(shù)據(jù)與其所替代的基于動物實驗所獲得的一樣可靠、有效。如果失去這個前提，特別是在醫(yī)學(xué)模型設(shè)計或者毒理學(xué)試驗中，就變得沒有意義了。關(guān)于相對替代，英國1986年制定的《動物（科學(xué)方案）法令》（《實驗動物法》）對動物物種以及物種的發(fā)育階段進行分級，作為實驗設(shè)計中相對替代的選擇原則。替代方案合理性的評估指標(biāo)是相關(guān)性和可靠性。相關(guān)性相當(dāng)于預(yù)測效度，而可靠性是指實驗的重現(xiàn)性。2.3優(yōu)化現(xiàn)有實驗，減少動物受到的痛苦和傷害。Russell和Burch把“優(yōu)化”分為兩種，一種是針對由實驗設(shè)計本身給實驗動物帶來的痛苦，一種是針對由于疏忽大意給實驗動物帶來的意外傷害。第一種一般是建立模擬人類某種疾病的動物模型，這種情況，我們應(yīng)該盡可能在設(shè)計實驗時，降低由疾病造成的實驗動物痛苦的時間，減輕傷害的程度。比如，美國動物倫理委員會規(guī)定，荷瘤小鼠的腫瘤最大直徑不能超過2cm，違反動物倫理要求，再有貢獻的研究數(shù)據(jù)也會被撤銷，甚至研究結(jié)論也會遭到質(zhì)疑。2015年，一篇4年前發(fā)表于《Nature》的文章引起了爭議，原因就是研究人員使小鼠腫瘤體積超過了規(guī)定大小。最后文章雖然沒有被撤稿，但有關(guān)小鼠的實驗數(shù)據(jù)被撤銷。除此之外，實驗動物在過程中的恐懼和痛苦，會對實驗結(jié)果進行干擾，增加實驗的變異性/偏差[4]。優(yōu)化實驗設(shè)計，注重實驗動物福利，不僅是倫理要求，也是對實驗結(jié)果的一種負(fù)責(zé)。

3結(jié)語

動物實驗廣泛存在于基礎(chǔ)研究（教學(xué)），臨床藥物研究以及獸醫(yī)研究中。每年為此貢獻出生命的實驗動物數(shù)量相當(dāng)龐大。一項科學(xué)研究，想要得出客觀理性的結(jié)論，必須有扎實的統(tǒng)計數(shù)據(jù)做保證，設(shè)計不佳的實驗和不充分的統(tǒng)計分析，會造成實驗動物不必要的損失，違背實驗動物倫理學(xué)的3R原則。想要在實驗中成功應(yīng)用3R原則，關(guān)鍵在于收集數(shù)據(jù)前反復(fù)思考的實驗設(shè)計和統(tǒng)計方法。而3R原則的應(yīng)用也可以起到改進實驗研究的目的。比如，合理、可靠、高效的實驗方案；清晰、明確的觀察指標(biāo)；實驗中對實驗動物福利的重視。將實驗動物的使用減到最少，對實驗動物的傷害降到最低，是我們一直需要努力的方向。

參考文獻

[1]PeterSinger.動物研究中的倫理學(xué)問題[J].中國醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，2004，17（2）：31-34，36．

[2]RussellWMS，BurchRL．ThePrinciplesofHumaneExperimentalTechnique[M].London：Methuen，1959．

[3]白晶.動物實驗3R原則的倫理論證[J].中國醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，2007，20（5）：48-50．

[4]楊青.國內(nèi)外醫(yī)學(xué)實驗動物福利現(xiàn)狀與思考[J].天津醫(yī)學(xué)，2011，23（4）：74-76．

作者:苑博 單位:天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院