糖尿病血管細胞核增殖分析論文

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論文關鍵詞糖尿病足中醫證型脛后動脈血管細胞核增殖相關抗原臨床研究

論文摘要目的：探討糖尿病足中醫辨證分型與血管細胞核增殖相關抗原的表達差異。方法：對32例截肢的糖尿病足患者按中醫辨證分為氣血兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、脈絡熱毒證和氣陰兩虛瘀阻證，分別對其截肢肢體的脛后動脈應用免疫組化法對細胞核增殖相關抗原（Ki67）的表達進行觀察、分析。結果：Ki67的陽性表達與糖尿病足動脈硬化閉塞程度呈負相關，與血管炎癥病變程度呈正相關。結論：炎癥在糖尿癥的大血管病變的過程中起到了重要的作用。

糠尿病足是糖尿病的嚴重并發癥，據統計1996年全球糖尿病患者1．2億，預計到2025年，將達到2．5億以上，而大約15％的糖尿病患者將在其生活的某一時間發生足潰瘍或壞疽[1]。目前對于糖尿病足病因及發病機制雖然還不是完全清楚，但大家公認糖尿病合并大血管病變導致動脈粥樣硬化是糖尿病足發病的最主要因素。現將2004年10月～2005年5月間我們收治的32例糖尿病足患者的截肢動脈標本的血管細胞核增殖相關抗原(Ki67)與其中醫辨證分型的相關性研究情況報告如下。

1臨床資料

1．1一般資料：32例均為天津醫科大學代謝病醫院和天津中醫學院第一附屬醫院2004年10月～2005年5月間的住院患者，其中男性24例，女性8例；年齡50～86歲，平均年齡69．2歲；糖尿病病程最長30年，最短6年，平均18±2．4年。

1．2診斷標準：糖尿病足的診斷標準采用2000年中華醫學會糖尿病學會第二屆糖尿病足會議所制訂的“糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標準”。

1．3截肢標準：參照國際糖尿病足工作組編寫的《糖尿病足國際共識》中關于“大截肢的定義、標準和指標”[2]執行。

1．4中醫辨證分型標準：參照《中醫外科學(第七版)》及《中藥新藥臨床研究指導原則·脫疽》之中醫辨證分型方案分為氣陰兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證四型。

2觀察方法

2．1標本取材：壞疽截肢標本32例，其中按中醫辨證分型氣血兩虛瘀阻組10例，脈絡瘀熱組10例，氣陰兩虛瘀阻組4例，脈絡熱毒組8例，取各例標本下肢脛后動脈。標本經過10％福爾馬林固定，常規石蠟包埋，備用。

2．2設備、試劑：美國PENGUIN-600CL自動圖像分析系統，細胞核增殖相關抗原(Ki67)抗體PV9000試劑盒DAB購于北京中山生物技術有限公司。

2．3免疫組織化學法：標本常規石蠟包埋，4μm連續切片，采用PV法進行免疫組化染色，染色過程嚴格按試劑盒染色程序進行，選取已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。觀察細胞核增殖相關抗原(Ki67)，陽性物質呈棕黃色細顆粒狀于細胞核表達，采用美國PENGUIN-600CL圖像分析系統進行圖像分析，選取病變處每500個細胞Ki67的陽性表達率作為其陽性表達指數。統計學處理應用SPSS10．0軟件包進行方差分析。

3結果

3．1中醫各證型所占比例以及年齡、性別分布：各證型比例，氣血兩虛瘀阻組10例（31．25%），脈絡瘀熱組10

例（31．25%），氣陰兩虛瘀阻組4例（12．5%），脈絡熱毒組8例（25．0%）。年齡、性別分布情況，見表1。

表132例患者年齡、性別分布n（%）

性別n50~60歲61~70歲71~80歲80歲以上男24（75．0）4（12．5）8（25．0）11（34．4）1（3．1）女8（25．0）1（3．1）3（9．3）4（12．5）0總計32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2免疫組織化學法觀察各證型Ki67表達差異：具體情況見表2。

表2各證型Ki67陽性表達指數比較（%）

證型Ki67陽性表達指數脈絡熱毒4．87±1．01*氣陰兩虛瘀阻1．86±0．47脈絡瘀熱1．49±0．13氣血兩虛瘀阻0．30±0．18注：與氣血兩虛瘀阻型比較，*P<0．05。

氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證、脈絡瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中均可見部分細胞Ki67呈陽性表達，在脈絡熱毒證中表達指數最高，氣血兩虛瘀阻證中表達指數最低，二者比較具有顯著性差異(P<0．05)。

4討論

Ki67抗原為細胞核內與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，分子量為345kd和395kd，其編碼基因位于第10號染色體上。Ki67的表達出現于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇，到G0期則不表達，半衰期為lh或更短[3]。有人認為它可能是具有蛋白結合特性的重要結構，在有絲分裂中起著維持DNA規則結構的重要作用[4]，是一個反映細胞增殖的敏感指標。

在糖尿病足的不同辨證分型中氣血兩虛瘀阻證、脈絡熱毒證、脈絡瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中Ki67表達均呈陽性，在脈絡熱毒證中表達最強、氣血兩虛瘀阻證中表達最弱，二者相比具有顯著性差異(P＜0．05)。根據Ki67陽性指數可以判斷細胞增殖的活性，指明細胞增殖與糖尿病足動脈病變的關系。在糖尿病足的不同辨證分型中動脈的硬化閉塞程度由輕到重依次是脈絡熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證、脈絡瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證。Ki67的陽性表達與糖尿病足動脈硬化閉塞程度呈負相關。而在通過對32例糖尿病足截肢的動脈進行病理學觀察的過程中發現糖尿病足血管病變主要體現在中動脈的病理學變化，其中脈絡熱毒、氣陰兩虛瘀阻兩證型以動脈周圍及全層的炎癥性改變為主；脈絡瘀熱、氣血兩虛瘀阻證以中膜鈣化、平滑肌細胞萎縮、變性、壞死及膠原纖維增多及內膜粥樣斑塊形成為主，炎癥表現不明顯；而Ki67的陽性指數與血管炎癥病變程度呈正相關。這說明炎癥在糖尿病的大血管病變的過程中起了重要的作用，特別是在脈絡熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證兩型，這對臨床具有重要的指導意義。

5參考文獻

1BoultonAJ.Thediabeticfoot：aglobalview.DiabetelMetabResRev，2000，16(1)：2．

2許樟榮，敬華．糖尿病足國際共識．中華糖尿病學會第二屆足病第一次足病研討會．2002，435．

3SchulterC，DuchrowM,WohlenbergC,etal．MolecularcloingofthecellproliferationassociatednuclearantigendefinedbyantibodyKi67：anuniquegeneencodingforanew，PESTprotein.CellBiol，1993，123(3)：513.

4NamitaS，PeterA．Ki67structurefunctionandnewantibodies.Pathol，1992，168：161．