復(fù)方生物黃酮實(shí)驗(yàn)研究論文

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【摘要】目的為了研究復(fù)方生物黃酮（圣安泰牌百力康片）的潛在致突變性。方法我們對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行了Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)。結(jié)果Ames實(shí)驗(yàn)，小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)，小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)等結(jié)果均為陰性，均未見毒性改變。結(jié)論復(fù)方生物黃酮在服用劑量內(nèi)未見致突變性。

【關(guān)鍵詞】復(fù)方生物黃酮；Ames實(shí)驗(yàn)；小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)；小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)

【Abstract】Inordertostudythepotentialmutationgenesisofcompoundflavine，wehaveperformedAmestests，ratmarrowosteocytemicronucleartestsandratspermdeformationtests.Theresultsareallnegative，notoxicchangeshavebeenobserved.Itisconcludedthatnomutationgenesiseffectsofcompoundbio-flavinehavebeendiscoveredinfeedingdosage.

【Keywords】compoundbio-flavine；Amestests；ratmarrowosteocytemicronucleartests；ratspermdeformationtests

隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)生物黃酮有了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有良好的抗氧化性能［1］和清除自由基的能力［2］；具有抗腫瘤作用［3］；植物雌激素樣作用；減少體內(nèi)膽固醇的合成，降糖作用［4］和降低血清膽固醇濃度和對(duì)心腦血管的保護(hù)作用［5］；對(duì)細(xì)胞免疫功能和非特異性免疫功能均有提高作用。生物黃酮的種類眾多，其來源不同，所發(fā)揮的生物活性也不同。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論以枸杞、黃芪、銀杏葉為主要原料，輔以其他輔料制成的復(fù)方生物黃酮，可以更好的發(fā)揮黃酮的提高免疫作用，盡管這些主要原料均來源于“既食又藥”的物質(zhì)，但是關(guān)于復(fù)方成分的致突變性研究較少。為了研究復(fù)方生物黃酮（圣安泰牌百力康片）可能對(duì)人體造成的潛在致突變性，我們對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行了Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)，以期為今后開發(fā)利用我國“既食又藥”的醫(yī)藥寶庫提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品復(fù)方生物黃酮的商品名稱為圣安泰牌百力康片，由哈爾濱圣安泰生物科技有限公司提供。樣品以枸杞、黃芪、銀杏葉為主要原料，輔以其他輔料制成，功效成分為總黃酮。

1.2材料昆明種小白鼠（批準(zhǔn)證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第09-2-7號(hào)），購自黑龍江省腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。TA97a、TA98、TA100和TA102四種菌株引自美國加州大學(xué)Ames實(shí)驗(yàn)室。

1.3方法

1.3.1鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶實(shí)驗(yàn)（Ames實(shí)驗(yàn)）TA97a、TA98、TA100和TA102四種菌株引自美國加州大學(xué)Ames實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)菌株特性鑒定均符合實(shí)驗(yàn)要求。活化系統(tǒng)為PCB-五氯誘導(dǎo)的雄性Wistar大鼠肝s-9液。按1：9加入輔助因子（Ames1983年配方）配成10％s-9混合液，經(jīng)陽性誘變劑活性鑒定符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)XAD-11樹脂柱過濾及洗脫預(yù)處理，最后以DMSO為溶劑，劑量設(shè)計(jì)分別為5mg/皿、1mg/皿、0.2mg/皿、0.04mg/皿和0.008mg/皿受試物。除上述5個(gè)劑量組外，又設(shè)未處理對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（DMSO）和陽性對(duì)照組［加s-9用2-AF（TA102用1，8-二羥蒽醌），不加s-9用DEXON（TA100用疊氮鈉）］。采用平板滲入法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測(cè)試菌株新鮮增菌液0.1ml，混勻；加受試物或?qū)φ瘴?.1ml［需活化時(shí)加入10％s-9混合液0.5ml（含s-95μl）］，再混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。每個(gè)劑量平行做了3皿，并重復(fù)一次，最后以3皿平均值報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.2小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)昆明種小白鼠，體重25～30g，共50只，在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境7天后，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半。高劑量組劑量為10g/kgbw；中劑量組為5g/kgBw；低劑量組為2.5g/kgbw；陰性對(duì)照組經(jīng)口灌胃蒸餾水；陽性對(duì)照組灌胃給予環(huán)磷酰胺，劑量為40.0mg/kgbw。按20ml/kgbw灌胃容積進(jìn)行灌胃。采用30h給受試物法，即二次給受試物間隔24h，第二次給受試物后6h頸椎脫臼處死小鼠，取股骨，常規(guī)制片。顯微鏡雙盲法閱片，每只小鼠觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），記錄有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出微核率。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值。

1.3.3小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)昆明種小白鼠25只，體重25～30g；隨機(jī)分成5組，每組5只。設(shè)3個(gè)劑量組，劑量設(shè)計(jì)同小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)，即高劑量組為10g/kgbw，中劑量組為5g/kgbw，低劑量組為2.5g/kgbw。陰性對(duì)照組給予蒸餾水，陽性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺，劑量為40mg/kgbw。所有各組均按20ml/kgbw容積灌胃，每日1次，連續(xù)5天。各組動(dòng)物均于首次投入檢樣后35天處死。按常規(guī)方法制片，固定，2％伊紅溶液染色，每只小鼠鏡檢1000個(gè)完整精子，計(jì)算畸形率。

2結(jié)果

2.1鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶實(shí)驗(yàn)（Ames實(shí)驗(yàn)）圣安泰牌百力康片二次Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

表1圣安泰牌百力康片第一次Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x±s)

注：以上結(jié)果為3皿回變菌落數(shù)的平均值

表2圣安泰牌百力康片第二次Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）

注：以上結(jié)果為3皿回變菌落數(shù)的平均值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受檢樣品對(duì)Ames各實(shí)驗(yàn)菌株在加與不加活化系統(tǒng)條件下均呈陰性結(jié)果，即鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶實(shí)驗(yàn)為突變陰性結(jié)果。

2.2小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)圣安泰牌百力康片的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3圣安泰牌百力康片小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：與陰性對(duì)照組相比**P<0.01

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行泊松分布檢驗(yàn)，結(jié)果兩個(gè)性別小鼠除陽性對(duì)照組外，各劑量組微核率與陰性對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），亦無劑量效應(yīng)關(guān)系，說明受試物小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果。此外，各組動(dòng)物PCE/RBC值經(jīng)方差分析差異無顯著性，說明各組動(dòng)物均未見到細(xì)胞毒性作用。

2.3小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)圣安泰牌百力康片的小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4圣安泰牌百力康片對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

注：與陰性對(duì)照組相比**P<0.01

從表4可見，各組小鼠均可見到一定數(shù)量的畸形精子，除陽性對(duì)照組外各實(shí)驗(yàn)組小鼠的精子畸形與陰性對(duì)照組相比，均沒有超過2倍，且無劑量效應(yīng)關(guān)系，亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明受試物對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率無影響。

3討論

復(fù)方生物黃酮的主要來源為枸杞、銀杏葉和黃芪。研究證實(shí)這幾種成分未見致突變毒性結(jié)果。枸杞的Ames實(shí)驗(yàn)（TA97、TA98、TA100、TA1024個(gè)菌株）結(jié)果為無論加S9與不加S9回變菌落數(shù)均未超過空白對(duì)照的兩倍。雌性和雄性動(dòng)物的微核率分別為1.6‰與1.2‰，與陰性對(duì)照組微核率相比，差異不顯著。小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)精子畸形率均在正常范圍內(nèi)，與陰性對(duì)照組精子畸形率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［6］。對(duì)銀杏葉的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究也未見致突變作用［7］，目前尚未見黃芪的突變性研究。本文在急性毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了復(fù)方生物黃酮的Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明復(fù)方生物黃酮對(duì)Ames各實(shí)驗(yàn)菌株在加與不加活化系統(tǒng)條件下均呈陰性結(jié)果。各劑量組微核率與陰性對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），亦無劑量效應(yīng)關(guān)系，說明受試物小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果。各組小鼠均可見到一定數(shù)量的畸形精子，除陽性對(duì)照組外，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的精子畸形與陰性對(duì)照組相比，均沒有超過2倍，且無劑量效應(yīng)關(guān)系，亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明受試物對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率無影響。總之，本研究結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)劑量的復(fù)方生物黃酮沒有致突變性。

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