小議生物人工腎小管的構建

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摘要：目的為構建一種既有濾過及抗凝功能、同時又有重吸收及內分泌功能的新型生物人工腎小管提供實驗基礎。醫學論文方法以層黏連蛋白0.74mg/ml包被的AV400濾器為載體，將轉染人Nanog基因的血管內皮細胞(ECV304)懸液與轉染人Nanog基因的腎小管上皮細胞(HKC)懸液等體積混勻，分次注入實驗組濾器內腔，構建生物人工腎小管。對照組只在層黏連蛋白包被的AV400濾器內腔注入不含細胞的培養基。采用PKH26、PKH67標記法分別觀察ECV304、HKC在聚砜膜中空纖維上的分布；應用掃描電鏡檢測混合細胞在聚砜膜中空纖維上的生長狀況及形態。結果混合細胞能在聚砜膜中空纖維上較好地黏附、生長。PKH26、PKH67標記檢測發現細胞呈致密點片狀分布；掃描電鏡觀察可見細胞形成單層片狀。結論兩種轉染細胞在層黏連蛋白包被的聚砜膜中空纖維上生長良好，這為構建一種既有血管內皮細胞抗凝、同時又有小管上皮細胞重吸收功能的新型生物人工腎小管奠定了實驗基礎。

關鍵詞：轉染基因Nanog內皮細胞上皮細胞混合種植聚砜膜中空纖維腎小管

生物人工腎(bioartificialkidney，BAK)是腎臟組織工程研究的重點之一。BAK的研究包括兩個方面：生物人工腎小管和生物人工腎小球。當前，腎臟組織工程研究已取得了極大的進展，但仍存在關鍵的問題有待解決。如何在一定時間內快速獲得大量的組織工程種子細胞；如何讓構建的生物人工濾器既有生物人工腎小球的濾過與抗凝功能，同時又有生物人工腎小管的重吸收及內分泌功能。針對如何提高一定時間內種子細胞產量的問題，我們在先前的研究中應用促細胞增殖的人Nanog基因(hNanog)來促進種子細胞的增殖。而對生物人工濾器功能兼備的問題，在本研究中我們采用了種子細胞混合種植的方法。

一、材料與方法

1、材料伊格爾最低濃度必需介質(EMEM)培養基(美國Gibco)，胎牛血清(FCS，美國Hyclone)，胰酶(美國Sig-ma)，PKH26及PKH67(美國Sigma)，Hoechst33342(美國Sigma)。JSM—6000F掃描電鏡(日本JEOL公司)。腎小管上皮細胞(HKC)由南京醫科大學楊俊偉教授饋贈，血管內皮細胞(ECV304)由軍事醫學科學院三所細胞室贈送，轉染種子細胞的rAAV2-hNanog重組病毒由北京本元正陽生物技術公司包裝完成，轉染rAAV2-hNanog重組病毒的2種細胞ECV304、HKC由本實驗室制備并保存。

2、中空纖維上混合細胞的分布

2.1混合細胞的PKH26/PKH67標記：將轉染hNanog基因的兩種細胞ECV304及HKC細胞各接種在75cm塑料培養瓶中，置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中，用10%的FCSEMEM進行培養。當兩種細胞各生長至匯合時，用0.25%的胰酶消化、離心并沉淀細胞后，然后再用無血清的EMEM洗滌細胞，400g/min離心，共5min，然后棄去上清，使殘留上清不要超過25μl，然后在獲得的細胞沉淀中加入1ml稀釋劑C溶液，輕輕吹打形成細胞懸液；按照PKH26和PKH67試劑盒說明書分別配制4×10-6mol/L的PKH26溶液和4×10-6mol/L的PKH67溶液，然后把ECV304細胞懸液加入到PKH26染液、HKC細胞加入到PKH67染液中，各自吹打均勻，并于室溫下放置2～5min。之后加入2ml血清，室溫下放置1min，再用10%EMEM4ml稀釋上述細胞懸液，25℃條件下1200r/min離心，共10min，棄去上清，去除染色液。用10%EMEM沖洗ECV304、HKC細胞4次，然后將細胞移到另一新管中，加入10ml完全培養基，離心，重懸，使兩種細胞各自的密度調整在(1.0～2.0)×107/ml，然后把兩種轉染細胞ECV304與HKC細胞懸液等體積混合，輕輕吹打均勻，制成混合細胞懸液。

2.2標記細胞的種植：將實驗組及對照組的AV400濾器(Fresenius公司0.7m2)均用無血清的EMEM培養基沖洗，再把無血清EMEM配制的層黏連蛋白0.74mg/ml[1]注入濾器中，置于37℃孵箱中1h，之后將其抽去。然后把標記的種子細胞混合液平均分成4次注入濾器內腔，兩次注射時間間隔為1h，每次注射完畢后按方向標記放置濾器，待下次注射結束后依照固定方向將濾器轉動90°，總共進行4次，完成360°循環。對照組只在AV400濾器中注入不含細胞的培養基，注射方法及放置方法同實驗組。最后把兩組濾器的外腔注滿培養基，置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中培養，濾器中培養液pH<7.2時即予以更換。于培養第5天時從兩組濾器中取出中空纖維，用刀片將纖維絲縱向剖開，磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗2次，然后在熒光顯微鏡下觀察2種轉染細胞在中空纖維上的分布。

3、混合細胞在中空纖維上生長狀態的觀察把2種已轉染人Nanog基因的ECV304、HKC置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中，用10%FCSEMEM進行培養。當兩種細胞生長至匯合狀態時，用0.25%的胰酶消化，并對2種種子細胞進行細胞計數。實驗組及對照組所用AV400濾器仍用層黏連蛋白包被。把2種轉染細胞的密度調至(1.0～2.0)×107/ml，然后把兩者等體積混合，輕輕吹打均勻，制成混合細胞懸液，然后把細胞混懸液注入濾器內腔，注射方法與放置方法同2.2部分。對照組只在AV400濾器中注入不含細胞的培養基，注射方法及放置方法同實驗組。最后將兩組濾器外腔注滿培養液，置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中培養，濾器中培養液pH<7.2時即予以置換。第7天時從兩組濾器中取出中空纖維，用0.1mol/LPBS沖洗1次，然后再用2.5%戊二醛于4℃冰箱中固定2h，之后再用0.1mol/LPBS溶液沖洗，用刀片將中空纖維沿縱向剖開，再用0.1mol/LPBS溶液沖洗2次，最后把剖開的中空纖維置于1%鋨酸中，4℃冰箱中固定1h。標本制作完成后，進行掃描電鏡檢測。

二、結果

1、中空纖維上混合細胞PKH26及PKH67標記檢測：經PKH26染色的ECV304轉染細胞及經PKH67染色的HKC轉染細胞混合種植于聚砜膜中空纖維上后，可見兩種種子細胞呈點片狀分布在聚砜膜中空纖維上。熒光顯微鏡下，ECV304細胞呈現紅色，而HKC呈現黃綠色。而對照組則無紅色或黃綠色的點片狀細胞群分布。

2、中空纖維上混合細胞的生長形態：轉染的ECV304細胞與轉染的HKC細胞混合種植于聚砜膜中空纖維內腔7d后，掃描電鏡檢測：對照組未見細胞生長；混合細胞在中空纖維內腔上呈片狀生長，并可見細胞表面的微絨毛。

三、討論

早期的腎臟組織工程主要是模仿腎小球的濾過功能，人們利用具有類似腎小球濾過功能的生物膜(如聚砜膜)建立了血液透析的方法。然而，血濾器在血透過程中易出現血栓，最終導致濾過功能下降。為解決血濾器中出現血栓的問題，有人將轉染水蛭素基因的內皮細胞種植在生物膜材料上，制成生物人工腎小球[3，4]，但這種具有抗凝功能的生物人工腎小球只能對小分子溶質進行清除和濾過，缺乏物質重吸收及內分泌等重要功能。

生物人工腎小管是把腎小管上皮細胞種植在中空纖維腔內，上皮細胞在中空纖維內腔的表面黏附生長并形成單層，從而發揮小管上皮內分泌、重吸收作用[4-8]，但它缺乏抗凝的功能。在透析過程中，生物人工腎小管仍需要使用肝素抗凝。對血透患者來說，長期使用普通肝素(UFH)可引起脂質代謝異常，加重患者的脂質代謝紊亂[9，10]。盡管有研究認為，血透過程中使用低相對分子質量肝素(LMWH)在一定程度上可以緩解高脂血癥和改善脂質代謝，但John等[11]的研究證明，無論使用UFH還是LMWH，均有導致嚴重的肝素誘發性血小板減少癥的可能(heparin-in-ducedthrombocytopenia，HIT)。因此，把兩種種子細胞混合種植在聚砜膜中空纖維上，構建一種兼備血管內皮細胞抗凝功能、小管上皮細胞內分泌及重吸收功能的新型生物人工腎小管，是克服既往生物人工腎小球/腎小管不足的一個可行的方法。

我們的研究發現，兩種種子細胞混合后，能在聚砜膜材料上較好地生長，證明利用混合種子細胞構建新型生物人工腎小管是可行的。同時，兩種種子細胞混合種植，有可能使構建的新型生物人工小管更符合生理結構。Noishiki等把內皮細胞與平滑肌細胞混合種植在人工血管腔面，置于體內血流環境中，結果形成了與血管壁類似的結構。另外，混合種植的2種種子細胞之間還會發生相互作用，而這種相互作用可能是種子細胞持久、良好地黏附生長所必須的。有研究證明，與內皮細胞共培養的平滑肌細胞和單獨培養的平滑肌細胞相比較，共培養條件下的平滑肌細胞增殖速度明顯加快，蛋白合成量顯著增加。當然，內皮細胞與腎小管上皮細胞間是否確實存在這種相互作用，有待今后進一步研究。

近年來，隨著新材料與新技術的發展，生物人工腎出現了小型化、可移植化的趨勢。Fissell等利用微機電系統(MEMS)技術，把人皮質小管上皮細胞種植在縮微化的硅片及納米硅微孔膜上，為生物人工腎系統的縮微化提供了一條新途徑。此外，當前的生物器官打印技術更為生物人工腎的微型化、可移植化及功能的復合化展現了美麗的前景，但上述技術存在諸多難點，在實際應用中尚有極大困難。因此，利用混合工程種子細胞構建具有復合功能的新型生物人工腎小管具有潛在的應用價值。