熒光免疫試劑研究管理論文

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［摘要］目的：合成(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，并用于構(gòu)建妊娠相關(guān)血漿蛋白A固相時(shí)間分辨免疫熒光試劑。方法：用PVA作為載體結(jié)合BCPDAEu3+和生物素親和素，以雙抗體夾心法原理，結(jié)合生物素標(biāo)記抗體和包被抗體建立PAPPA時(shí)間分辨免疫熒光試劑，并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果：成功的合成了活性的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，構(gòu)建PAPPA試劑檢測(cè)靈敏度為0.7mIU/L；批內(nèi)變異系數(shù)在3.89%～4.96%之間,批間變異系數(shù)在7.35%～9.27%之間。結(jié)論：合成的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物較高的反應(yīng)活性，可以用于多種試劑的構(gòu)建。構(gòu)建的PAPPA試劑靈敏度高，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［關(guān)鍵詞］妊娠相關(guān)血漿蛋白A；固相時(shí)間分辨熒光免疫；親和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基1，10啡羅啉2，9二羧酸—銪復(fù)合物；唐氏綜合征

DevelopADirectSolidPhaseLanthaneTimeresolvedFluoroimmunoassayReagentofPAPPAutilizingPVA

Abstract:ObjectiveTodevelopadirectsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassayreagentofPAPPAbysynthesizingacomplexof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+.MethodsPolyvinylamine(PVA)waslabeledwithbiotinstreptavidinandeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA).UsinglabeledPVAcomplex,WedesignedtwositesandwichtimeresolvedfluoroimmunoassayofPAPPAandevaluatedassaycharacteristicsofPAPPAkit.ResultsWesuccessedsynthesizingaconjuageteof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+andareagentofPAPPA.Detectionlimitsachievedwere0.7mIU/L.Thecalibrationcurvewaslinear010000mIU/L.Intraandinterassayimprecision(CV)was3.89%4.96%and7.35%9.27%.Recoverywas95.8%104.2%.ConclusionsTheconjugateof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+synthesiziedwasreactive,highlyfouorescent.Asortsofkitcouldbesynthesized,takingadvantageofit.ThereagentofPAPPAwaspotentiallysuitedforuseinclinicalwithhighlyanalyticalsensitivity.

Keywords:PregnancyassociatedplasmaproteinA;Directsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay;StreptavidinbiotinPolyvinylamineeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid;Down''''sSyndrome

妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PregnancyassociatedplasmaproteinA，PAPPA)是一種高分子α2糖蛋白，20世紀(jì)70年代在孕婦血清中被發(fā)現(xiàn)［1］。在孕婦血中主要PAPPA是胎盤滋養(yǎng)層組織分泌，它是一種異源四聚體，由兩個(gè)分子量為200000~250000亞基構(gòu)成。PAPPA亞基和兩個(gè)嗜紅細(xì)胞主要基礎(chǔ)蛋白(Proformofeosinophilmajorbasicprotein)以二硫鍵結(jié)合而成［2］，在孕婦血中只存在微量游離單體PAPPA。PAPPA亞基由1547個(gè)多聚核苷酸構(gòu)成，包括1個(gè)拉長(zhǎng)的鋅指結(jié)構(gòu)，3個(gè)Lin—notch重復(fù)序列，以及5個(gè)短一致重復(fù)序列［3］。在體內(nèi)PAPPA是一種蛋白酶，主要針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4(IGFBP4)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5)起作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGFI)在促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖起重要作用，它主要通過(guò)IGF1受體起作用，IGFI、II的生物活性受6個(gè)高親和性IDFBP調(diào)節(jié)［4，5］。PAPPA主要用于產(chǎn)前篩查唐氏綜合征(Down''''sSyndrome，DS)，迄今醫(yī)學(xué)上對(duì)此病尚無(wú)有效的治療和預(yù)防措施，只能通過(guò)產(chǎn)前篩查防止DS兒的出生，但目前開(kāi)展的絨毛活檢,羊水穿刺及臍帶血穿刺均為侵入性檢查,有1%～3%的流產(chǎn)率,且方法繁瑣,出報(bào)告時(shí)間長(zhǎng),不適宜大范圍孕婦的普查,僅限于高危人群的診斷。大量報(bào)道認(rèn)為PAPPA可作為DS胎兒產(chǎn)前篩查的的標(biāo)志物。在15周～20周通過(guò)結(jié)合孕婦孕周、超聲診斷和FreeβHCG可以鑒別65%～75%，但要在3個(gè)月～6個(gè)月結(jié)合AFP、游離E3以及抑制素上述成分可鑒別85%～90%［6］。有文獻(xiàn)［7］報(bào)道PAPPA在急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的早期診斷有一定的意義，PAPPA在ACS患者血清含量＜30mIU/L，同時(shí)結(jié)構(gòu)不同于孕婦體內(nèi)的PAPPA且存在動(dòng)態(tài)變化，必須利用超靈敏的方法進(jìn)行檢測(cè)。國(guó)內(nèi)PAPPA的診斷試劑大多為ELISA和PerkinElmer公司生產(chǎn)的解離增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫分析(dissociatedenhancelanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay,DELFIA)試劑，無(wú)國(guó)產(chǎn)PAPPA時(shí)間分辨熒光試劑。我們利用PVA(聚乙烯胺)作為載體結(jié)合BCPDA鑭系螯合物合成一種高靈敏的固相時(shí)間分辨熒光免疫分析(directsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay,DSLFIA)試劑。為提高檢測(cè)靈敏度和克服BCPDA標(biāo)記抗體使抗體失活的問(wèn)題，我們引入了生物素親和素(biotinstreptavidinsystem)系統(tǒng)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑4,7二氯磺苯基1，10啡羅啉2，9二羧酸［4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid,BCPDA自制］；純化親和素(Streptavidin，SA，Sigma公司)；硫代琥珀酰亞氨6生物素氨基己酯類［Sulfosuccinimidyl6''''(biotinamido)6hexanamidohexanoate，SulfoNHSLCLCBiotin，pierceChemicalCompany］；聚乙烯胺氫氯化物(Polyvinylaminehydrochloride，PVA,ChemicalDynamicsCorp)；硼酸鈉、二甲亞砜(天津化學(xué)試劑有限公司)；單克隆抗體根據(jù)文獻(xiàn)［5］選擇Hyb234—5(StatensserumInstitut)作為檢測(cè)抗體，mAb10E1(HyTestOy，F(xiàn)inland)作為捕獲抗體；PAPPA標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品購(gòu)于PE公司(質(zhì)控血清：Control1508mIU/L，Control22325mIU/L，Control3為4952mIU/L)；鼠IgG(晶美公司)。

1.1.2儀器Wallac1420多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀(WallacOY，F(xiàn)inland)；HPLC硅柱TSK250尺寸排阻柱(BIORAD公司)；96白色微孔板(NUNC公司)、親和素包被板(InnotracDiagnosticsOy公司)；Amicon可濃縮離心管(Amiconmicroconcentrationunits，MW30000Cutoff)

1.2方法

1.2.1BCPDA的制備參見(jiàn)文獻(xiàn)詳細(xì)步驟［8～10］。

1.2.2生物素聚乙烯胺BCPDA［(Bio)xPVA(BCPDA)y］復(fù)合物的構(gòu)建［11］用0.5M的碳酸鹽(pH9.1)緩沖液配制濃度為10mg/ml聚乙烯胺(PVA)溶液，將200μgNHSLCLCBiotin溶于20μl碳酸鹽緩沖液中，取200μl上述PVA溶液加入20μl上述NHSLC—LCBiotin溶液中，振蕩混勻，室溫反應(yīng)1.5h(PVA∶Bio=1∶15)，用0.5M碳酸鹽緩沖液將混合液稀釋到1ml，將固體BCPDA研磨成粉末狀，先在上述1ml混合液中加入5mgBCPDA，用力攪拌，直到溶解，重復(fù)加3次BCPDA，5mg/次，共計(jì)20mgBCPDA，在室溫放置5h～6h，直到溶液澄清，轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.1MNaHCO35L透析、過(guò)夜、重復(fù)透析2次，盡可能除去沒(méi)反應(yīng)的BCPDA和生物素。

1.2.3HPLC純化(Bio)xPVA(BCPDA)y復(fù)合物離心濃縮上述(Bio)xPVA(BCPDA)y復(fù)合物到0.3ml～0.5ml(用Amiconmicroconcentrationunits，MW30000Cutoff)。流動(dòng)相0.05MTris緩沖液(pH7.70)，控制HPLC流速0.8ml/min，在325nm處監(jiān)測(cè)層析液(325nm為BCPDA最大吸收峰)，上樣后，馬上收集，(Bio)xPVA(BCPDA)y在10管～16管約5ml左右，取10μl(Bio)xPVA(BCPDA)y層析液加入90μl水滴入親和素包被板微孔中，溫育30min，洗板，加入用Tris緩沖液配制的10M～5MEuCl3100μl，反應(yīng)10min，洗板、干燥，用Wallac1420檢測(cè)Eu3+的熒光強(qiáng)度，沒(méi)結(jié)合復(fù)合物的被洗去了，沒(méi)結(jié)合BCPDA的復(fù)合物因無(wú)法結(jié)合Eu3+而沒(méi)有熒光，計(jì)算標(biāo)記的PVA，大約每分子結(jié)合50個(gè)～100個(gè)BCPDA分子。

1.2.4構(gòu)建親和素生物素PVABCPDA［(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+］復(fù)合物［11］用0.1MTris緩沖液(pH7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA溶液)60g/L，同時(shí)加入EuCl3，使Eu3+濃度為10-6mol/ml，用雙蒸水配制親和素溶液濃度為1mg/ml，取上述BSA溶液1ml，加入10μl親和素溶液，再加入50μl的(Bio)xPVA(BCPDA)y復(fù)合物(通過(guò)固相免疫分析，棋盤滴定法確定最佳用量比，步驟略，結(jié)果見(jiàn)后)，混勻，55℃溫育1.5h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物反應(yīng)活性用生物素化的各種濃度(0ng/50μl，0.5ng/50μl，5ng/50μl，50ng/50μl，100ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板(同第7步)，用60g/LBSA和0.1mol/LTris緩沖液(pH7.8)10倍稀釋(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，在板的微孔中加入100μl稀釋后的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，室溫反應(yīng)30min，洗板、干燥，測(cè)量熒光強(qiáng)度(cpm)。本實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證復(fù)合物的反應(yīng)活性。

1.2.6生物素標(biāo)記10E1抗體［12］用二甲亞砜制備硫代琥珀酰亞氨6生物素氨基乙酯溶液(10mg/ml)，將抗體10E1溶于0.1mol/L硼酸鈉溶液(pH8.8)，每1mg抗體中加硫代琥珀酰亞氨6生物素氨基己酯類溶液210μg混合，室溫放置4h，在上述溶液中加入20ml1mol/LNH4Cl，室溫反應(yīng)10min，將反應(yīng)液進(jìn)行透析，除去未結(jié)合的生物素，將抗體濃度用分析緩沖液配置成8ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7單克隆Hyb234—5抗體包被96孔微滴定板將抗體溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH4.9)，配置成5μg/ml抗體溶液，在每一孔中加入80μl抗體溶液，室溫反應(yīng)20h，然后用生理鹽水洗3次，然后每孔加120μl0.05MTrisHcl緩沖液(pH7.4含0.9%生理鹽水、0.05%NaN3、0.5%小牛血清白蛋白BSA)浸泡2h。吸干緩沖液，干燥，密封4℃保存。

1.2.8樣本收集、定標(biāo)、靈敏度、精密度和回收實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程選取懷孕8周、9周、11周婦女血清各一份，經(jīng)PE公司的DELFIA試劑和D&G公司的ELISA試劑多次精確測(cè)定，值分別為：P1863.27mIU/L；P21273.63mIU/L；P32727.23mIU/L。用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(6%BSATSA緩沖液：150mmol/LNaCl、60g/LBSA、50mmol/LTrisHCl，pH7.8)將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度為：S00mIU/L(稀釋液)、S120mIU/L、S2200mIU/L、S31000mIU/L、S45000mIU/L、S510000mIU/L。標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)根據(jù)WHOIRP78/610(WHOInternationalLaboratoryforBiologicalstandards，StatensSeruminstitut，Denmark)，單位換算：1000mIU/L=4.5μg/ml。在單克隆Hyb234—5抗體包被96孔微滴定板，每孔加入定標(biāo)液10μl，作8次平行測(cè)量，加入50μl生物素標(biāo)記10E1抗體50μl，混勻，36℃，室溫反應(yīng)20min，洗板6次，加入100μl10倍稀釋的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，室溫反應(yīng)25min，洗板6次，吹干，Wallac1420測(cè)量熒光強(qiáng)度(cpm)，取均值，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將S00mIU/L做20次重復(fù)測(cè)試，計(jì)算均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，以X+2s為試劑的最小檢測(cè)限。將Control1，Control2，Control3依據(jù)定標(biāo)分析過(guò)程，同批測(cè)量20次，批間測(cè)量12次，用于評(píng)價(jià)精密度。對(duì)收集樣本(P1、P2、P3)依據(jù)定標(biāo)分析過(guò)程進(jìn)行測(cè)量，然后將Control1、Control2、Control3分別等體積加入P1、P2、P3中進(jìn)行測(cè)量，用于評(píng)價(jià)回收實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1用HPLC純化(Bio)xPVA(BCPDA)y復(fù)合物在10min～16min出現(xiàn)(Bio)xPVA(BCPDA)y的吸收峰，沒(méi)有結(jié)合BCPDA的吸收峰在17min～24min出現(xiàn),見(jiàn)圖1。

圖1凈化（Bio）x－聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色譜（TSK－250過(guò)濾柱）上的變化圖。（略）

流速控制在0.8ml/min，吸光率325nm

2.2用滴定法確定親和素和(Bio)xPVA(BCPDA)y最佳配比SA量恒定0.01mg/ml，生物素標(biāo)記的抗體包被分別濃度為0ng/孔、0.5ng/孔、5ng/孔、50ng/孔，緩沖液為pH7.8TrisHcl0.1M，Eu3+10-5M，(Bio)xPVA(BCPDA)y用量從40μl～55μl選擇最佳值，50μl復(fù)合物熒光強(qiáng)度值(cpm)最佳，如圖2。

圖2滴定鏈球菌，（Bio)x－聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3MEu3+,0.1MTris-Hclbuffer(pH7.8)緩沖液中的變化，0.01mg/ml鏈球菌，容積變動(dòng)范圍40μl~55μl，觀察到最佳容積為50μl（略）

2.3驗(yàn)證活性用生物素化的各種濃度(0ng/50μl，0.5ng/50μl，5ng/50μl，50ng/50μl，100ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板驗(yàn)證(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物的反應(yīng)活性，在測(cè)定范圍內(nèi)成線性分布，見(jiàn)圖3。

圖3IgG維生素定量法標(biāo)定曲線（略）

2.4PAPPA定標(biāo)曲線及靈敏度在0mIU/L～10000mIU/L范圍內(nèi)定標(biāo)曲線為線性分布，見(jiàn)圖4。S0標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)20次檢測(cè)均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出檢測(cè)限為0.7mIU/L(數(shù)據(jù)沒(méi)顯示)。

圖4PAPP-A標(biāo)定曲線（略）

2.5批內(nèi)、批間精密度對(duì)質(zhì)控血清批內(nèi)進(jìn)行20次分析，批間進(jìn)行12次分析，得到批內(nèi)變異系數(shù)3.89%～4.96%,批間變異系數(shù)在7.35%～9.27%之間,見(jiàn)表1。

表1批內(nèi)、批間變異系數(shù)比較（略）

2.6回收實(shí)驗(yàn)對(duì)收集樣本(P1、P2、P3)依據(jù)定標(biāo)分析過(guò)程進(jìn)行測(cè)量，然后將Control1、Control2、Control3分別等體積加入P1、P2、P3中進(jìn)行多次測(cè)量，分別計(jì)算回收率95.8%～104.2%,見(jiàn)表2。

表2回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（略）

3討論

臨床化學(xué)家最關(guān)心的問(wèn)題是分析技術(shù)靈敏度，這也是臨床診斷試劑的核心。近來(lái)，在臨床化學(xué)檢測(cè)物質(zhì)的濃度的范圍10-3mol/L～10-16mol/L。PCR以及其他的體外擴(kuò)增技術(shù)使DNA、RNA檢測(cè)方便、高效、特異。不幸的是蛋白不能復(fù)制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之間的特異性結(jié)合如抗原抗體反應(yīng)。一個(gè)提高蛋白檢測(cè)靈敏度的方法就是信號(hào)放大，即在蛋白上標(biāo)記可以檢測(cè)的標(biāo)記物，通過(guò)標(biāo)記物的信號(hào)放大而達(dá)到更容易檢測(cè)的目的。時(shí)間分辨免疫學(xué)技術(shù)是80年代迅速發(fā)展起來(lái)的的一種公認(rèn)的最有發(fā)展前途的非放射免疫標(biāo)記技術(shù)，其中熒光鑭系螯合物具有較大的Stokes位移(275nm)，較窄的發(fā)射光譜(10nm)，較長(zhǎng)的熒光壽命(10us～1000us)，而被廣泛構(gòu)建時(shí)間分辨熒光免疫試劑。臨床運(yùn)用最廣泛的是PE公司生產(chǎn)的解離增強(qiáng)鑭系時(shí)間分辨熒光免疫分析(dissociationenhancedlanthanidefluoroimmunoassay，DELFIA)試劑，它必須使Eu3+與螯合物分離，由于其信號(hào)較弱，必須加入增強(qiáng)液來(lái)發(fā)大信號(hào)，操作煩瑣且在加樣的過(guò)程中可能引起外源性的污染，這些弊端影響了它的應(yīng)用。在1987年，Evangelista和Diamandis合成一種新的螯合物BCPDA，開(kāi)創(chuàng)了固相時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)，解決了DELFIA上述問(wèn)題［8，9］，但是BCPDA的較大分子量、表面特性和直接標(biāo)記蛋白容易引起蛋白的失活對(duì)它應(yīng)用帶來(lái)一些問(wèn)題，解決的辦法就是連接一個(gè)載體。我們實(shí)驗(yàn)中引入了PVA作為載體，連接BCPDA和生物素親和素。PVA直接連接蛋白技術(shù)難度較大，而生物素標(biāo)記蛋白技術(shù)比較成熟，同時(shí)親和素有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，可以起到信號(hào)放大作用，而提高檢測(cè)靈敏度。我們實(shí)驗(yàn)中成功的合成了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，用它去識(shí)別生物素標(biāo)記的抗體(見(jiàn)圖3)，結(jié)果顯示親和力非常高。實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵問(wèn)題是選擇SA和(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物最佳比，我們實(shí)驗(yàn)中做了7個(gè)濃度梯度，選取結(jié)合后熒光強(qiáng)度最大的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物濃度。利用HPLC層析純后的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物回收率是68%。通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇最佳檢測(cè)抗體濃度、生物素化抗體濃度和標(biāo)本用量。Jackson［13］分析了提高靈敏度的因素即兩個(gè)關(guān)鍵的因素與最終的結(jié)合分析靈敏度相關(guān)：我們監(jiān)測(cè)標(biāo)記分子(放射性同位素、化學(xué)發(fā)光劑、熒光團(tuán))的能力；結(jié)合試劑的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)條件，在臨床化學(xué)存在一種誤導(dǎo)是特別敏感的監(jiān)測(cè)方法(化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光)能獲得好的結(jié)果。其實(shí)這是錯(cuò)誤的，如果實(shí)驗(yàn)試劑和條件(抗體的親和性和特異性，固相結(jié)合物的自然特性以及清洗效率)不被選擇，很難達(dá)到理想的檢測(cè)效果。為達(dá)到較高的靈敏度，需要選擇高靈敏度的標(biāo)記技術(shù)、高親和力的試劑和最好的分析條件(可將試劑的非特異性結(jié)合降到最小)。利用鑭系螯合物的時(shí)間分辨熒光免疫分析是一種高靈敏的標(biāo)記技術(shù)，關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)條件的選擇，我們驗(yàn)證不同孵育時(shí)間下，(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物產(chǎn)出率，以及和生物素化抗體的結(jié)合能力(數(shù)據(jù)不能顯示)。經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)選擇了Eu3+的濃度，使其能和BCPDA形成最佳比例(數(shù)據(jù)不能顯示)。反應(yīng)條件的建立中，我們篩選實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度(18℃～56℃，每5℃選擇一次)和反應(yīng)時(shí)間(10min～24h)，考慮到臨床結(jié)果的報(bào)告時(shí)間，選擇了20min(數(shù)據(jù)不能顯示)。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)條件選擇，形成了PAPPA的定標(biāo)曲線，通過(guò)定標(biāo)曲線確定最低檢測(cè)限(見(jiàn)圖3)。我們構(gòu)建的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物可以用于多種像PAPPA這樣利用雙抗體夾心法檢測(cè)的試劑，如AFP等。我們選擇構(gòu)建PAPPA主要考慮到我國(guó)產(chǎn)前篩查項(xiàng)目的自產(chǎn)試劑較少，而且DS篩查尤為重要，由于科研經(jīng)費(fèi)的問(wèn)題，沒(méi)有進(jìn)行最佳單抗配對(duì)實(shí)驗(yàn)，只是參考了國(guó)外的相關(guān)文獻(xiàn)。不過(guò)我們實(shí)驗(yàn)的核心是構(gòu)建(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，為以后構(gòu)建其他試劑做一定的前期工作。我們構(gòu)建的PAPPA試劑,回收實(shí)驗(yàn)和精密度試驗(yàn)顯示，完全滿足試劑盒要求。在今后的工作中，我們主要驗(yàn)證(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物和成品試劑盒的穩(wěn)定性，以及進(jìn)一步和PE公司的PAPPA的DELFIA試劑做大量的臨床對(duì)比實(shí)驗(yàn)。總之，我們成功構(gòu)建了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物和PAPPA的成品試劑，它有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，又克服了DELFIA試劑的缺點(diǎn)。

參考文獻(xiàn):

［1］lLnTM,GalbertSP,KieferD,etal.Characterizationoffourhumanpregnancyassociateidplasmaproteins［J］.AmJObstetGynecol,1974,118:22336.

［2］OxcigC,SandO,KristensenT,etal.CirculatinghumanpregnancyassociatedplasmaproteinAisdisulfidebridgedtotheproformofeosinophilmajoebasicprotein［J］.JBiolChem,1993,268:122436.

［3］KristensenT,OxvigC,SandO,etal.AminoacidesequenceofhumanpregnancyassociatedplasmaproteinAderivedfromclonedcDNA［J］.Biochemistry,1994,33:15921598.

［4］HwaV,OhY,RosenfeldRG.Theinsulinlikegrowthfactorbindingprotein(IGFBP)superfamily［J］.EndocrRev,1999,20:761787.

［5］QinQP,ChristransenM,PetterssonK.PointofcaretimeresolvedimmunofluorometricassayforhumanpregnancyassociatedplasmaproteinA:useinfirsttrimesterscreeningforDownsyndrome.ClinChem,2002,48(3):47383

［6］WaldNJ,DensemJM,SmithD,etal.FourmarkerserumscreeningforDown''''ssyndrome［J］.PrenatDiagn,1994,14:707716.

［7］QiuPingQin,SaaraKokkala,JuhaLund,etal.MoeculardistinctionofcirculatingpregnancyassociatedplasmaproteinAinMyocardialInfarctionandpregnancy［J］.ClinicalChemistey,2005,51(1):7583.

［8］EvanglistaRA,PollakA,AlloreB,etal.Aneweuropiumchelateforproteinlabelingandtimeresolvedfluorometricapplications［J］.ClinBiochem1988,21:173178.

［9］DiamandisEP,MortonRC.Timeresolvedfluorescenceusingaeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA).Labelingproceduresandapplicationsinimmunoassays［J］.JImmunolMethods,1988,112(1):4352.

［10］PanL,GuoS,DuanT,AnJ,XieW,LinM.Methodoflabelingantibodieswitheuropium(III)4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacidchelate［J］.AnalSci,2005,21(6):7136.

［11］AndreasScorilas,EleftheriosPDiamandis.Polyvinylaminestreptavidincomplexslabeledwithaeuropiumchelator:auniversaldetectionreagentforsolidphasetimeresolvedfluorometricapplications［J］.ClinicalBiochemistry,2000,33(5):345350.

［12］黃志偉，王琰.抗體工程［M］.第2版.北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2002，286287.

［13］JacksonTM,EkinsRP.Theoreticallimitationsonimmunoassaysensitivity.CurrentpracticeandpotentialadvantagesoffluorescentEu3chelatesasnonradioisotopictracers［J］.ImmunolMethods,1986,87:13–20.