細菌快速裂解方法探究論文

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16S-23SrRNA基因是位于16SrRNA基因和23SrRNA基因之間的區(qū)間序列，具有較好的保守性和相對的可變性，被認為是細菌鑒定的合適部位［1，2］。我們認為能否快速有效地擴增該區(qū)間，聚合酶鏈反應(PCR)擴增前的標本處理是關鍵。故比較了3種裂解細菌的方法。

一、材料和方法

1.菌株、人類基因組DNA及病毒株來源摘要：革蘭陽性6個菌種，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等共19株；革蘭陰性21個菌種，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、綠膿假單胞菌等共40株。以上菌株由浙江省臨床檢驗中心及結(jié)核病防治中心提供，保存于我院細菌室。人類基因組DNA、新型隱球菌、巨細胞病毒由本院中心實驗室提供。

2.臨床標本摘要：1999年6月～2000年3月本院新生兒住院患兒，部分為普通病房住院患兒。敗血癥血標本42份，腦脊液標本6份。對照組15份，為本院新生兒病房非感染患兒康復期待出院者的血標本。

3.16S-23SrRNA基因區(qū)間序列引物設計摘要：在細菌的16SrRNA基因的3′端及23SrRNA基因的5′端的保守序列內(nèi)，經(jīng)計算機軟件查閱自行設計引物。

4.臨床標本處理摘要：血標本摘要：0.5ml的肝素抗凝血置室溫約10min以沉淀血細胞，在血清和血細胞的交界面（即白細胞層）吸取200μl，注入1.5ml滅菌的Eppendorf管中。加入0.87%的NH4Cl1ml，搖勻，放入37℃水浴箱中。15min后，取出，1000r/min離心5min，去上清液，在沉淀物中加NH4Cl1ml，重復上述步驟2次。最后在沉淀物中加5%Chelex100緩沖液（含0.03%SDS，1%吐溫20，1%NP40）200μl和蛋白酶K2μl（20mg/ml），56℃孵育60min后煮沸15min，稍加離心后，取上清液做PCR擴增。

腦脊液標本摘要：0.5ml～1ml腦脊液1000r/min離心1min，去上清液，在沉淀物中加5%Chelex100緩沖液200μl和蛋白酶K2μl，56℃孵育60min后再煮沸15min，稍加離心后，取上清液做PCR擴增。

二、結(jié)果

1.Chelex100改良裂解法能裂解所探究的所有菌種，且擴增產(chǎn)物條帶清楚，效果滿足。用經(jīng)典的酚氯仿抽提法擴增細菌，效果同Chelex100改良法，但步驟繁瑣［3］。

2.臨床標本的裂解摘要：42例新生兒敗血癥血培養(yǎng)15例陽性，血標本經(jīng)改良Chelex100裂解，PCR擴增后27例陽性，其陽性率明顯高于血培養(yǎng)，差異有顯著性意義（P＜0.01）。血培養(yǎng)陽性的15例PCR檢測均陽性，且檢測結(jié)果和血培養(yǎng)一致。另1組單純用水煮裂解，只有5份陽性。6份腦脊液培養(yǎng)2例陽性，腦脊液PCR檢測4例陽性，培養(yǎng)陽性的2例和PCR結(jié)果相符。15份對照組血標本血培養(yǎng)及PCR檢測均陰性。

3.敏感性及引物特異性試驗摘要：取潘尼變形桿菌標準菌株放入1ml的ddH2O中，用麥氏比濁法確定起始濃度為108CFU，用ddH2O1∶10定量稀釋，濃度范圍為2.5×104～2.5×10-3CFU，取2μl模板在50μl的PCR體系中擴增，檢測擴增下限。Chelex100緩沖液裂解法得PCR的最小檢出量為2.5CFU/ml。本對引物只能擴增細菌，和人基因組DNA、新型隱球菌、巨細胞病毒無交叉反應，說明本對引物擴增細菌16s-23srRNA基因有較好的特異性。

三、討論

本探究首次在Chelex100的基礎上進行改良，加上其他一些試劑配成一種適合不同菌種（包括葡萄球菌在內(nèi)）PCR擴增的裂解液。并發(fā)現(xiàn)用Chelex100改良法裂解細菌后所擴增的條帶較明亮清楚，效果滿足，可檢測2.5CFU/ml的細菌，敏感性比水煮法提高了100倍。用經(jīng)典的酚/氯仿抽提細菌DNA再行PCR擴增，效果和Chelex100改良法相同。但經(jīng)典的方法步驟較繁瑣，DNA經(jīng)常從1管轉(zhuǎn)移到另1管，且還要使用多種試劑，這都增加了PCR污染的可能性。故Chelex100改良裂解法是一簡便有效的方法，適合于不同菌株的擴增。

總之，經(jīng)標準菌株和臨床標本的初步應用，證實本探究建立的用Chelex100改良法一步擴增細菌的16S-23SrRNA基因區(qū)間具有準確、敏感、簡便、快速的特征，若經(jīng)大量臨床標本的進一步證實，可成為一理想的診斷技術。

參考文獻

1，RothA,FischerM,HamidME,etal.Differentiationofphylogeneticallyrelatedslowlygrowingmycobacteriabasedon16S-23SrRNAgeneinternaltranscribedspacersequences.JClinMicrobiol,1998,36摘要:139-147.

2，傅君芬，洪文瀾.16S-23SrRNA區(qū)間序列——一種分型及鑒別細菌的新方法《國外醫(yī)學》流行病.傳染病分冊,1998,25摘要：245-249.

3，尚世強，洪文瀾，俞惠民，等.細菌DNA的聚合酶鏈反應擴增及反相雜交初步分型.中華醫(yī)學檢驗雜志,1998,21摘要：281-284.