乙型肝炎病毒C基因論文

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【摘要目的摘要:構(gòu)建乙型肝炎病毒(HBV)截短C基因和前S1基因重組原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得融合蛋白的表達(dá)并進(jìn)行抗原性分析.方法摘要:PCR擴(kuò)增獲得截短C基因片段和前S1基因，雙酶切后克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，酶切鑒定得陽性重組質(zhì)粒pET28a并測序；然后轉(zhuǎn)化E.coliBL21，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),薄層掃描分析表達(dá)蛋白組成；可溶性分析后用Ni2+NTA凝膠親和層析柱純化、透析并濃縮融合蛋白，WesternBlot分析特異性和抗原性.結(jié)果摘要:成功構(gòu)建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28aCtpreS1，目的基因可高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，Ni2+NTA純化可獲得目的蛋白，純化蛋白具有良好的抗原性和特異性.結(jié)論摘要:HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表達(dá)并得到純化，為探究新型乙肝疫苗奠定了基礎(chǔ).

【乙型肝炎病毒；融合蛋白；原核表達(dá)；疫苗

0引言

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)導(dǎo)致的病毒性肝炎目前尚無十分有效的治療辦法，疫苗接種是控制和預(yù)防乙型肝炎的重要手段，但部分人群對現(xiàn)有的疫苗不應(yīng)答或低應(yīng)答而導(dǎo)致接種失敗，因此需要研發(fā)新型HBV疫苗.我們利用基因重組技術(shù)構(gòu)建含截短C基因和preS1基因聯(lián)合的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白并進(jìn)行純化，初步分析其免疫性和特異性，為比較不同來源的HBV候選疫苗分子和深入探究HBV新型疫苗奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料

E.coliDH5α和BL21菌株由本實驗室保存;pET28a質(zhì)粒由范雄林博士惠贈;帶HBV截短C基因和preS1基因的質(zhì)粒pDE22CtpreS1w由本實驗室構(gòu)建;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司);膠回收試劑盒(上海華舜公司);T4DNA連接酶(上海生物工程公司);Ni2+NTA凝膠親和層析柱(Qiagen公司);HRP標(biāo)記羊人IgG，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)和低分子蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(華美生物工程公司).

1.2方法

1.2.1PCR引物設(shè)計和合成根據(jù)GenBank中的HBVC基因和前S1基因序列，利用生物學(xué)信息軟件設(shè)計其擴(kuò)增引物,以擴(kuò)增C基因編碼蛋白N端155個氨基酸的基因片段和前S1全基因.上游引物P1摘要：5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,含EcoRⅠ酶切位點；下游引物P2摘要：5′GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′，含HindⅢ酶切位點和終止碼TTA.交上海生物工程公司合成.

1.2.2目的基因的擴(kuò)增以pDE22CtpreS1w質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為摘要：質(zhì)粒（1∶100稀釋）5μL，10×Buffer5μL，10mmol/LdNTPs4μL，P1（100pmol/L）2μL，P2（100pmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶2μL，用超純水補(bǔ)至終體積50μL.反應(yīng)條件摘要：預(yù)變性94℃5min；94℃1min，56℃50s，72℃1min,共進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min.取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析.

1.2.3pET28aCtpreS1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒鑒定均參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒交由北京三博遠(yuǎn)志公司測序.

1.2.4蛋白表達(dá)和可溶性分析自DH5α中提取陽性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落（同時設(shè)空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21為對照），置5mLLB培養(yǎng)液中（含卡那霉素50g／L），37℃振搖過夜，次日1∶100的稀釋度加入5mLLB培養(yǎng)液中37℃振搖3h后，測定A600nm約0.4～0.6時加入IPTG至終濃度1mmol/L，37℃繼續(xù)振搖4～5h，離心收菌.用PBS(pH8.0)懸浮離心收集的細(xì)菌，加入溶菌酶至終濃度0.1g/L，4℃放置20min，超聲破碎，4℃下10000g離心10min，收集上清和沉淀.將菌體沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌分別加入等體積的2×樣品緩沖液，沸水中加熱5min，12000g離心5min，取上清，每孔15μL進(jìn)行SDSPAGE電泳，電泳在恒壓下進(jìn)行（濃縮膠中為100V，分離膠中為120V）.電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2h，然后用脫色液脫色至背景清楚.薄層掃描分析目的蛋白表達(dá)帶占菌體蛋白百分比.

1.2.5親和層析法純化表達(dá)蛋白參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱(Ni2+NTA)操作說明進(jìn)行.首先離心收集1L誘導(dǎo)宿主菌，冰浴15min；按5L/kg濕菌的比例加入含8mol/L尿素的BufferB（pH8.0），室溫下輕輕攪拌使細(xì)菌裂解至溶液清亮，4℃下10000g離心收集上清，棄去沉淀；將1mLNi2+NTA樹脂懸浮液和一定量清亮裂解上清于室溫輕柔搖動混勻(100r/min搖動15～60min)后，將其混合液裝柱；依次用BufferC（pH6.3）,BufferD（pH5.9）,BufferE（pH4.5）洗脫，分別收集洗脫液.取各部分樣品進(jìn)行SDSPAGE分析.

1.2.6WesternBlot檢測表達(dá)蛋白將純化蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，然后將蛋白質(zhì)進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至NC膜上（濾膜孔徑0.22μm，轉(zhuǎn)移條件為恒流100V，1h）.用乙型肝炎陽性患者抗HbcAg，抗preS1陽性血清（來自西京醫(yī)院檢驗科）作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗人的IgG作為二抗，DAB（0.6g／L）顯色，至目的條帶染色清楚時終止反應(yīng).

2結(jié)果

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定陽性重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物預(yù)期大小（約630bp）處出現(xiàn)條帶（圖1）.序列測定結(jié)果和文獻(xiàn)報道一致.

2.2融合蛋白的表達(dá)和溶解形式分析經(jīng)SDSPAGE電泳檢測，在Mr約24000處有一明顯的條帶，和預(yù)期的融合蛋白大小一致.該融合蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，上清液中幾乎無誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白.薄層掃描顯示其占菌體蛋白的40%（圖2）.

2.3融合蛋白的大量表達(dá)及純化目的蛋白在BufferD（pH5.9），BufferE（pH4.5）洗脫液中，掃描顯示純度在90%以上（圖3）.

2.4表達(dá)蛋白的Westernblot預(yù)期大小處可見條帶染色清楚,純化的蛋白很好地保持了和HBV陽性患者血清的結(jié)合活性（圖4）.

3討論

疫苗是預(yù)防HBV感染的重要手段，但相當(dāng)數(shù)量的接種者對現(xiàn)臨床使用的疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答，而為數(shù)眾多的感染者需要有效的治療，所以迫切需要新型HBV疫苗.

抗原特異性CTL所介導(dǎo)的細(xì)胞毒功能在病毒感染的控制和痊愈過程中起核心功能［2-3］.多個CTL表位的疫苗探究策略是近年各類HBV新型疫苗探究的熱點.HBV核心C基因在不同亞型間最為保守,在它編碼的180多個氨基酸中，CTL表位多位于第150位氨基酸（aminoacid,AA）以前，其中18～27位AA為HLAA0201所限制，第88～96位AA被HLAA11所限制，第141～150位AA為HLAAw68和HLAA31分子所限制，此外第75～81位AA或72～88位AA是很強(qiáng)的構(gòu)像型B細(xì)胞表位，因此核心抗原是比較理想的疫苗探究靶分子［4-5］.在既往HBV疫苗探究中人們大多選用S基因編碼的蛋白，并輔以CpG,IL2等分子佐劑試圖達(dá)到免疫目的，但效果并不理想［6-7］.而preS1基因編碼蛋白含有HBV和肝細(xì)胞膜結(jié)合的位點，并且相當(dāng)保守,肝細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞均可表達(dá)針對其第21～47位AA的受體，故前S1抗體是除表面抗體外又一重要的中和抗體［8］.因此HBV的C基因和preS1基因已經(jīng)成為近年來HBV新型疫苗探究的重點［9］.

幾乎所有新型HBV疫苗如亞單位疫苗、DNA疫苗、分枝肽合成疫苗、新載體疫苗或植物轉(zhuǎn)基因疫苗的前期探究工作中都需要候選分子高效表達(dá),以便在體外評價疫苗候選分子刺激細(xì)胞增殖的潛力和CTL殺傷效應(yīng),達(dá)到全面評價候選分子的目的［10-12］.而HBV各個基因片段原核表達(dá)難易程度不同，考慮到C基因原核表達(dá)難度低，本探究采用將截短C基因置于preS1基因前面的方式，構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒并獲得了高效表達(dá).目的蛋白純化以后，Westernblot進(jìn)一步證實該濃縮蛋白可以和抗HBcAg、抗preS1陽性患者血清結(jié)合，具有很好的抗原性和特異性，可用于進(jìn)一步的HBV新型疫苗探究；和Chen等［9］采用經(jīng)典的preS1基因在前、C基因在后的表達(dá)方式所獲取的同類蛋白相比，本探究中蛋白表達(dá)量明顯較高.在后續(xù)工作中，我們將選用新型的疫苗載體BCG運載候選疫苗分子，進(jìn)一步探究該蛋白在CTL免疫和體液免疫中的功能.

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