錦紅片影響膽管炎大鼠胸腺論文

導語：錦紅片影響膽管炎大鼠胸腺論文一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】探討急性膽管炎狀態下細胞免疫中樞胸腺的變化以及中藥錦紅片的干預作用。方法:雄性清潔級SD大鼠24只，隨機分為3組，每組8只。膽總管單純結扎組（簡稱單純結扎組）:結扎膽總管，但不注射細菌，手術后喂生理鹽水;模型組:建立大鼠急性膽管炎模型，造模手術后喂生理鹽水;錦紅片治療組:造模手術后喂錦紅片懸液。手術后5d處死大鼠，胸腺取材，做胸腺電鏡和光鏡形態學觀察，并檢測胸腺質量、胸腺指數、凋亡指數、胸腺Bcl-2基因編碼蛋白表達和胸腺Fas基因編碼蛋白的表達。結果:形態學上凋亡細胞出現頻率由高到低依次為模型組、錦紅片治療組和單純結扎組。模型組胸腺質量和胸腺指數均降低，與錦紅片治療組和單純結扎組相比，差異有統計學意義。模型組胸腺凋亡指數明顯高于錦紅片治療組和單純結扎組。錦紅片治療組Bcl-2基因編碼蛋白表達高于模型組，Fas基因編碼蛋白表達組間差異無統計學意義。結論:急性膽管炎時大鼠胸腺質量、胸腺指數降低，胸腺凋亡指數升高，非生理性凋亡增加。清熱通下中藥錦紅片有一定的抑制這種非生理性凋亡的作用，這種作用可能是通過上調凋亡抑制基因Bcl-2編碼蛋白的表達實現的。

【關鍵詞】胸腺;膽管炎;清熱;通下;錦紅片

胸腺是機體的細胞免疫中樞，未成熟的T淋巴細胞通過在胸腺內的分化、發育，成熟后釋放入血，以維持外周T淋巴細胞池的衡定［1］。凋亡是胸腺細胞維持外周T淋巴細胞質和量的主要方式，其過程受到嚴格調控［2］。以往鮮有急性膽管炎與胸腺細胞凋亡方面的報道，而我們在過去的實驗中發現，治療急性膽道感染方面療效顯著的清熱通下中藥錦紅片對膽管炎動物外周免疫反應有調控作用［3～5］。為了解中藥錦紅片在治療急性膽管炎中對細胞免疫中樞胸腺的影響，我們進行了以下實驗研究。

1材料與方法

1.1實驗材料清潔級SD大鼠，雄性，10周齡，體質量160～180g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。LIBRORAEL-160電子天平，日本島津公司產品;AHBT-5B顯微鏡，Olympus公司產品;TEM-1200透射電鏡，日本日立公司產品;石臘切片機，日本Aiwa公司產品;缺口末端標記法（Tdt-mediatedfluorescein-dUTPnickendlabeling，TUNEL）試劑盒，BoehringerMannheim公司產品;Bcl-2單克隆抗體（兔抗鼠IgG）和Fas單克隆抗體（兔抗鼠IgG），Gene公司產品;免疫組化試劑盒，福州邁新生物技術公司產品;蛋白酶K、DNA酶和二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB），Sigma公司產品。

1.2實驗方法動物領來后放入實驗場所3d以適應環境，造模前禁食8h，禁水4h。參照龔建平等［6］的造模方法，將實驗大鼠膽總管結扎，同時向膽總管內注入致病性大腸桿菌，建立大鼠急性膽道感染模型。

1.3實驗分組24只SD大鼠隨機分為3組，每組8只。膽總管單純結扎組（簡稱單純結扎組）:結扎膽總管，但不注射細菌，手術后喂以生理鹽水。模型組:造模手術后喂以生理鹽水。錦紅片治療組:造模手術后喂錦紅片懸液，由上海中藥制藥一廠提供錦紅片干粉，以蒸餾水配成含干粉110mg/ml的懸混液，按10ml/kg體質量灌胃，2次/d。于手術后第5天處死大鼠，胸腺取材。

1.4檢測指標

1.4.1胸腺質量和胸腺指數完整取出胸腺后，電子天平稱取胸腺質量，計算胸腺指數。胸腺指數=胸腺質量（mg）/體質量（g）

1.4.2光鏡觀察胸腺組織以中性福爾馬林固定，常規脫水，包埋，切片，脫臘至水，HE染色。

1.4.3電鏡觀察取約1mm×2mm的胸腺組織，用2.5%戊二醛固定，梯度脫水，包埋，超薄切片，醋酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

1.4.4Bcl-2基因編碼蛋白免疫組化2μm石臘切片，脫臘至水，3%H2O2室溫孵育5～10min，以消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，用微波熱修復抗原，PBS浸泡5min，5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min;傾去血清，滴加1∶200Bcl-2單抗100μl，37℃孵育60min或4℃過夜;PBS沖洗3次，5min/次;滴加適當比例的生物素標記二抗100μl，37℃孵育10～30min;PBS沖洗3次，5min/次;滴加適當比例稀釋的抗生物素辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育10～30min;PBS沖洗3次，5min/次，加DAB顯色;自來水充分沖洗，復染，封片。同時設立陰性對照，以正常兔血清代替一抗。

1.4.5Fas基因編碼蛋白免疫組化步驟基本同上，Fas單抗工作濃度為1∶150。

1.4.6TUNEL檢測按原位細胞凋亡檢測試劑盒說明操作，即以生物素化脫氧三磷酸尿苷（deoxy-uridinetriphosphate，dUTP）標記DN段鈍端，再用免疫組化法放大標記信號，用DAB顯色，蘇木素襯染。

1.4.7切片分析對TUNEL檢測、Bcl-2及Fas表達分析，在不告知動物分組信息的前提下，分別送復旦大學醫學院和上海交通大學醫學院作閱讀分析并出具報告。

1.5統計學方法胸腺質量、胸腺指數、凋亡指數等用x±s表示，數據用SPSS10.0統計軟件進行方差分析。免疫組化數據用χ2檢驗。

2結果

2.1各組胸腺質量和胸腺指數模型組胸腺質量和胸腺指數均降低，而錦紅片治療組均升高。見表1。

2.2TUNEL檢測高倍鏡下隨機計算各組每份標本上、下、左、中、右5個視野的凋亡指數。凋亡指數（%）=（陽性細胞數/細胞總數）×100。經TUNEL標記后，光鏡下凋亡細胞的核呈深棕色，標記陽性細胞著色多位于細胞核周邊，核中央反應不明顯，細胞結構仍較完好。見表2、圖1。

表1各組胸腺質量和胸腺指數（略）

Table1Theweightandindexofthymusinthreegroups

*P<0.05，**P<0.01，vsuntreatedgroup.

表2各組胸腺凋亡指數（略）

Table2Theindexofapoptosisofthymusinthreegroups

*P<0.05，**P<0.01，vsuntreatedgroup.

2.3Bcl-2和Fas表達分析Bcl-2陽性細胞著色多位于胞漿及胞膜。錦紅片治療組胸腺Bcl-2基因編碼蛋白表達與模型組相比，差異有統計學意義（P<0.01）。Fas陽性細胞著色多位于胞漿、胞膜，部分位于胞膜外。根據細胞有無著色、著色深淺及著色細胞的比例擬定半定量評分。A項按顯色有無及顯色深淺計分:0分為不著色，1分為淺黃色，2分為

棕黃色，3分為棕褐色;B項按顯色細胞的比例評分:1分為1%～10%，2分為11%～30%，3分為31%～50%，4分為51%以上。每例總積分=A×B，總積分0分為（），1～3分為（+），3～6分為（++），6分以上為（+++）。各組Bcl-2和Fas表達均檢測8份標本，每張切片高倍鏡下隨機取上、下、左、中、右5個視野計數。結果見表3。

2.4光鏡觀察模型組胸腺皮質變薄，有少量炎性細胞浸潤，胸腺細胞密度降低，有少量點狀壞死灶;錦紅片治療組胸腺皮質較模型組厚，同單純結扎組基本相同，有少量炎性細胞浸潤，胸腺細胞數較模型組多，未見明顯壞死灶。

2.5電鏡觀察各組胸腺細胞結構基本相同，模型組胸腺中有較多巨噬細胞，可見大量典型的凋亡細胞，特征為染色質濃縮、邊聚、核膜皺縮，微絨毛消失，凋亡小體形成，部分呈新月形，細胞膜完整，細胞器存在，可見凋亡小體被鄰近細胞及巨噬細胞吞噬現象。與TUNEL檢測到的胸腺凋亡指數結果相似，電鏡觀察到胸腺中的凋亡細胞比例以模型組最高，錦紅片治療組次之，單純結扎組最低。見圖2。

圖1各組胸腺組織TUNEL陽性（×400）（略）

Figure1TUNELpositivethymusinthreegroups（×400）

A:Ligationgroup;B:Untreatedgroup;C:JinhongTablet-treatedgroup.

圖2各組透射電鏡下胸腺細胞超微結構（×5000）（略）

Figure2Thestructureofthymocyteinthreegroupsunderelectrontransmissionmicroscopy（×5000）

A:Ligationgroup;B:Untreatedgroup;C:JinhongTablet-treatedgroup

表3胸腺Bcl-2和Fas基因編碼蛋白表達（略）

Table3ExpressionsofBcl-2andFasgenecodingproteins

3討論

胸腺是T淋巴細胞成熟的場所，胸腺細胞成熟過程中，某些細胞克隆的清除、選擇，都涉及到凋亡機制，識別自身抗原的自身反應T淋巴細胞在胸腺發育成熟后，甚至在發育過程中就經凋亡途徑被清除。細胞數目的動態觀察表明，胸腺是一個大量產生短命細胞的場所，大多數胸腺淋巴細胞未發育成熟即已凋亡［7，8］。脂多糖靜脈注射能引起胸腺細胞凋亡，并且伴有血漿腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）含量升高，而抗TNF-α抗體可抑制引起的胸腺細胞DNA的片段化;IL-1、IL-2可分別抑制T細胞受體介導的未成熟胸腺細胞的凋亡和糖皮質激素介導的T淋巴細胞的凋亡［9～11］。細胞凋亡的基因調控機制是近年研究的熱點，根據作用的不同，可將與細胞凋亡有關的基因分為凋亡促進基因（稱自殺基因）和凋亡抑制基因（或稱生存基因）。Bcl-2是公認的生存基因，Fas則屬于自殺基因。凋亡活動是若干相關基因共同作用完成的，不可能是單一基因表達的結果［12，13］。通過凋亡過程死亡的胸腺皮質細胞絕大多數不能表達Bcl-2，Bcl-2表達參與T細胞的保留;Fas與胸腺細胞的發育有關，Fas系統與Bcl-2的相互作用決定了胸腺細胞的發育過程［14，15］。急性梗阻性膽管炎宿主胸腺細胞凋亡情況的變化鮮有報道。有資料顯示TNF-α、內毒素體內外均可誘導胸腺細胞凋亡［16，17］。本研究同期進行的相關生化等實驗結果表明，模型組血漿內毒素、TNF-α、IL-6、IL-8等增高，因此推測急性梗阻性膽管炎宿主胸腺細胞凋亡增多。本研究發現，與膽總管單純結扎組比較，模型組胸腺質量明顯降低，胸腺指數降低（P<0.01），胸腺皮質變薄，胸腺細胞密度降低，凋亡指數增高（P<0.05），并出現大量典型的凋亡小體，提示模型組胸腺細胞凋亡明顯增加，雖然鏡下觀察到模型組胸腺有少量點狀壞死灶，但這不應成為胸腺質量減輕的主要原因。結合同期其他的實驗結果，推測外周血中CD3、CD4淋巴細胞減少是細胞免疫中樞胸腺細胞凋亡增多，導致效應細胞減少所致。錦紅片治療組胸腺質量及胸腺指數明顯高于模型組，表明中藥治療后胸腺受損程度明顯減輕，有保護胸腺的作用。并且錦紅片治療組胸腺凋亡指數明顯低于模型組，可以認為，錦紅片能抑制胸腺細胞的過度凋亡，以此維持機體細胞免疫功能的相對穩定。中藥抑制胸腺細胞的凋亡可能與其誘導內毒素耐受有關。有報道稱反復多次注射小劑量內毒素的動物其胸腺質量、胸腺指數及胸腺活細胞數均明顯高于一次注射大劑量內毒素，而梯狀DNA則減少，并且，隨注射內毒素量的增加，對胸腺的保護作用越強［1］。同期的研究中錦紅片治療組血漿內毒素明顯低于模型組，實際起到了誘導內毒素耐受、保護胸腺的作用。本研究錦紅片治療組Bcl-2基因編碼蛋白表達多于模型組，而且細胞凋亡也較少，Fas基因編碼蛋白表達組間無明顯差異，推測具有清熱通下作用的中藥錦紅片可能是通過促進Bcl-2基因編碼蛋白的表達而在一定程度上抑制了細胞凋亡。

【參考文獻】

1PiYQ，WangDH，DengGH，etal.Protectionofthy-mocytesagainstapoptosisinducedbylethaldoseoflipopolysaccharideinendotoxintolerantmice.HunanYiKeDaXueXueBao.1996;21（3）:187-191.ChinesewithabstractinEnglish.皮業慶，王殿華，鄧恭華，等.內毒素耐受性與胸腺細胞凋亡.湖南醫科大學學報.1996;21（3）:187-191.

2YuZD.Progressinmolecularbiologicalresearchonapoptosisofthymocytes.GuoWaiYiXueLinChangShengWuHuaXueYuJianYanXueFenCe.1998;19（2）:89-91.Chinese.余振東.胸腺細胞凋亡的分子生物學研究進展.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊.1998;19（2）:89-91.

3ZhuPT，ZhangJZ，GaoJ，etal.Experimentalstudyon“JinhongPill”inregulatingcytokineandpreventingin-testinalmucosalbarrierofacutebiliarytractinfectioninrats.ShanghaiZhongYiYaoZaZhi.2001;35（4）:39-42.ChinesewithabstractinEnglish.朱培庭，張靜，高炬，等.錦紅片對急性膽道感染大鼠細胞因子調節和腸黏膜屏障保護作用的實驗研究.上海中醫藥雜志.2001;35（4）:39-42.

4ZhangJZ，ZhuPT，GaoJ，etal.TheprotectiveimpactoftabletJinhongonenteralmucosalbarrierinthetreat-mentofacutebiliarytractinfections，anexperimentalstudy.JGastrointestSurg.2004;8（7s）:442A.

5ZhangJZ，ZhangXL，GaoJ，etal.Impactofantipyret-icandpurgativeherbsonintestinalmucosalbarrierandinflammatoryresponseintreatmentofacutecholangitisinrats.ZhongXiYiJieHeXueBao.2005;3（3）:211-215.ChinesewithabstractinEnglish.張靜，章學林，高炬，等.清熱通下中藥對膽管炎大鼠腸屏障保護和炎癥反應調控的研究.中西醫結合學報.2005;3（3）:211-215.

6GongJP，HanBL，LuoD，etal.Researchonintestinalmucosalbarrierdamageofacuteinfectionofbiliarytract.ZhonghuaShiYanWaiKeZaShi.1991;8（3）:115-116.Chinese.龔建平，韓本立，羅丁，等.急性膽道感染時腸粘膜屏障損傷的研究.中華實驗外科雜志.1991;8（3）:115-116.

7SurhCD，SprentJ.T-cellapoptosisdetectedinsituduringpositiveandnegativeselectioninthethymus.Nature.1994;372（6501）:100-103.

8BerkeG.TheCTL''''skissofdeath.Cell.1995;81（1）:9-12.

9ZhangYH，TakahashiK，JiangGZ，etal.Invivoin-ductionofapoptosis（programmedcelldeath）inmousethymusbyadministrationoflipopolysaccharide.InfectImmune.1993;61（12）:5044-5048.

10AyalaA，HerdonCD，LehmanDL，etal.Theinduc-tionofacceleratedthymicprogrammedcelldeathduringpolymicrobialsepsis:controlbycorticosteroidsbutnottumornecrosisfactor.Shock.1995;3（4）:259-267.

11NorimatsuM，OnoT，AokiA，etal.In-vivoinductionofapoptosisinmurinelymphocytesbybacteriallipopo-lysaccharides.JMedMicrobiol.1995;43（4）:251-257.

12ChenLJ，SongXH，LiB，etal.Effectsofanti-endotoxinmonoclonalantibodyonthymocytesapoptosisandexpressionofinterleukin1β-conventingenzymeinsepticmice.ZhonghuaShiYanWaiKeZaZhi.1998;15（3）:269-270.ChinesewithabstractinEnglish.陳立軍，宋旭華，李濱，等.抗內毒素單抗對膿毒癥小鼠胸腺細胞凋亡及白介素1β-轉移酶基因表達的影響.中華實驗外科雜志.1998;15（3）:269-270.

13MingXZ.Progressincontrolofapoptosis.GuoWaiYiXueZhongLiuXueFenCe.1998;25（6）:321-323.Chinese.明學志.細胞凋亡調控及其進展.國外醫學腫瘤學分冊.1998;25（6）:321-323.

14MiglioratiG，NicolettiI，PagliacciMC，etal.Interleu-kin-4protectsdouble-negativeandCD4single-positivethymocytesfromdexamethasone-inducedapoptosis.Blood.1993;81（5）:1352-1358.

15TanakaM，SudaT，YatomiT，etal.LethaleffectofrecombinanthumanFasligandinmicepretreatedwithPropionibacteriumacnes.JImmunol.1997;158（5）:2303-2309.

16Hernandez-CasellesT，StutmanO.Immunefunctionsoftumornecrosisfactor.I.TumornecrosisfactorinducesapoptosisofmousethymocytesandcanalsostimulateorinhibitIL-6-inducedproliferationdependingontheconcentrationofmitogeniccostimulation.JImmunol.1993;151（8）:3999-4012.

17FangBW，WuXZ.Inductionofapoptosisininfectionstate.GuoWaiYiXueWaiKeXueFenCe.1999;26（2）:71-73.Chinese.方步武，吳咸中.感染相關狀態下凋亡的誘導.國外醫學外科學分冊.1999;26（2）:71-73