蛋白質質譜分析論文

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摘要：隨著科學的不斷發展，運用質譜法進行蛋白質的分析日益增多，本文簡要綜述了肽和蛋白質等生物大分子質譜分析的特點、方法及蛋白質質譜分析的原理、方式和應用，并對其發展前景作出展望。

關鍵詞：蛋白質，質譜分析，應用

前言：

蛋白質是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細胞，約占細胞干質量的50%以上，作為生命的物質基礎之一，蛋白質在催化生命體內各種反應進行、調節代謝、抵御外來物質入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關重要的作用，因此蛋白質也是生命科學中極為重要的研究對象。關于蛋白質的分析研究，一直是化學家及生物學家極為關注的問題，其研究的內容主要包括分子量測定，氨基酸鑒定，蛋白質序列分析及立體化學分析等。隨著生命科學的發展，儀器分析手段的更新，尤其是質譜分析技術的不斷成熟，使這一領域的研究發展迅速。

自約翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)發明了對生物大分子進行確認和結構分析的方法及發明了對生物大分子的質譜分析法以來，隨著生命科學及生物技術的迅速發展，生物質譜目前已成為有機質譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領域之一[1]。它的發展強有力地推動了人類基因組計劃及其后基因組計劃的提前完成和有力實施。質譜法已成為研究生物大分子特別是蛋白質研究的主要支撐技術之一，在對蛋白質結構分析的研究中占據了重要地位[2]。

1．質譜分析的特點

質譜分析用于蛋白質等生物活性分子的研究具有如下優點：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯用，適用于復雜體系中痕量物質的鑒定或結構測定，同時具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

2．質譜分析的方法

近年來涌現出較成功地用于生物大分子質譜分析的軟電離技術主要有下列幾種：1)電噴霧電離質譜；2)基質輔助激光解吸電離質譜；3)快原子轟擊質譜；4)離子噴霧電離質譜；5)大氣壓電離質譜。在這些軟電離技術中，以前面三種近年來研究得最多，應用得也最廣泛[3]。

3．蛋白質的質譜分析

蛋自質是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復雜結構主要包括以肽鏈為基礎的肽鏈線型序列[稱為一級結構]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱為二級，三級或四級]結構。目前質譜主要測定蛋自質一級結構包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數目和位置。

3.1蛋白質的質譜分析原理

以往質譜(MS)僅用于小分子揮發物質的分析，由于新的離子化技術的出現，如介質輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質譜技術開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質分子轉化為氣相離子，然后利用質譜分析儀的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質離子分離開來，經過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質。

3.2蛋白質和肽的序列分析

現代研究結果發現越來越多的小肽同蛋白質一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現在的研究熱點之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質序列測定方法支持這些研究的進行。現有的肽和蛋白質測序方法包括N末端序列測定的化學方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質序列測定標準方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對N末端保護的肽鏈則無法測序[4]。C末端化學降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學探針，其發展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質譜由于很高的靈敏度、準確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學家的廣泛注意。在質譜測序中，靈敏度及準確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進行的。近年來隨著電噴霧電離質譜(electrosprayionisation，ESI)及基質輔助激光解吸質譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等質譜軟電離技術的發展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達100000Da，目前基質輔助的激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDITOFMS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質、多肽分子量和一級結構的有效工具，也是當今生命科學領域中重大課題——蛋白質組研究所必不可缺的關鍵技術之一[5]。目前在歐洲分子生物實驗室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白質一級結構(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結果提供可靠的依據[6]。3蛋白質的質譜分析方式

質譜用于肽和蛋白質的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質譜檢測各產物肽分子量，將所得到的肽譜數據輸入數據庫，搜索與之相對應的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產生的亞穩離子，通過分析相鄰同組類型峰的質量差，識別相應的氨基酸殘基，其中亞穩離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經質譜檢測，由相鄰峰的質量差知道相應氨基酸殘基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基團越大，質譜檢測的準確率越低。因此，在質譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質譜檢測的準確率。一般而言，6-20個氨基酸的多肽最適合質譜儀的檢測。現今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經胰蛋白酶消化后，會產生相同的多肽。

3.3.2基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量法(MALDI-TOFMS)[7]

簡而言之，基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量儀是將多肽成分轉換成離子信號，并依據質量/電荷之比(mass/charge，m/z)來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。待檢樣品與含有在特定波長下吸光的發光團的化學基質(matrix)混合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進行揮發，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發生器(lasersource)。激光作用于樣品混合物，使化學基質吸收光子而被激活。此激活產生的能量作用于多肽，使之由固態樣品混合物變成氣態。由于多肽分子傾向于吸收單一光子，故多肽離子帶單一電荷.這些形成的多肽離子直接進入飛行時間質量分析儀(TOFmassanalyzer)。飛行時間質量分析儀用于測量多肽離子由分析儀的一端飛抵另一端探測器所需要的時間。而此飛行時間同多肽離子的質量/電荷的比值成反比，即質量/電荷之比越高，飛行時間越短。最后，由電腦軟件將探測器錄得的多肽質量/電荷比值同數據庫中不同蛋白經蛋白酶消化后所形成的特定多肽的質量/電荷比值進行比較，以鑒定該多肽源自何種蛋白.此法稱為多肽質量指紋分析(peptidemassfin-gerprinting)。基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量法操作簡便，敏感度高，同許多蛋白分離方法相匹配，而且，現有數據庫中有充足的關于多肽質量/電荷比值的數據，因此成為許多實驗室的首選蛋白質譜鑒定方法。

3.3.3電子噴霧電離質譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]

同基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量法在固態下完成不同，電子噴霧電離質譜測量法是在液態下完成，而且多肽離子帶有多個電荷，由高效液相層析等方法分離的液體多肽混合物，在高壓下經過一細針孔。當樣本由針孔射出時，噴射成霧狀的細小液滴，這些細小液滴包含多肽離子及水份等其他雜質成分。去除這些雜質成分后，多肽離子進入連續質量分析儀(tan-demmassanalyzer)，連續質量分析儀選取某一特定質量/電荷比值的多肽離子，并以碰撞解離的方式將多肽離子碎裂成不同電離或非電離片段。隨后，依質量/電荷比值對電離片段進行分析并匯集成離子譜(ionspectrum)，通過數據庫檢索，由這些離子譜得到該多肽的氨基酸序列。依據氨基酸序列進行的蛋白鑒定較依據多肽質量指紋進行的蛋白鑒定更準確、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通過蛋白氨基酸序列數據庫檢索，也可通過核糖核酸數據庫檢索來進行蛋白鑒定。4．蛋白質質譜分析的應用

1981年首先采用FAB雙聚焦質譜測定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質譜中出現準分子離子[M+1]+=1319強峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白質合適用FAB質譜分析，更大分子量的多肽和蛋自質可用MALDI質譜或ESI質譜分析。用MALDI-TOF質譜分析蛋自質最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以煙酸為基質在TOF譜儀上測出質量數高達60kDa蛋白質，精確度開始只有0.5%，后改進到0.1-0.2%。質譜技術主要用于檢測雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質及酶解所得的多肽的質量，也可用于蛋白質高級結構及蛋白質間相互作用等方面的研究[10,11],三條肽段的精確質量數便可鑒定蛋白質。近年來，串聯質譜分析儀發展迅猛，其數據采集方面的自動化程度、檢測的敏感性及效率都大大提高，大規模數據庫和一些分析軟件(如:SEQUEST)的應用使得串聯質譜分析儀可以進行更大規模的測序工作。目前，利用2D電泳及MS技術對整個酵母細胞裂解產物進行分析，已經鑒定出1484種蛋白質，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質[12]；分析肝細胞癌患者血清蛋白質組成分[13]，并利用質譜進行鑒定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用質譜技術研究許旺細胞源神經營養蛋白(SDNP)的分子結構[15]等。

結束語：

在蛋白質的質譜分析中，質譜的準確性(accuracy)對測定結果有很大影響，因此質譜測序現在仍很難被應用于未知蛋白的序列測定。肽和蛋白的質譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優點，這些都非常適合于現在科學研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進，蛋白雙向電泳的應用[16]以及質譜技術的不斷完善，質譜將會成為多肽和蛋白質分析最有威力的工具之一。

參考文獻

1．吳世容,李志良,李根容,等.生物質譜的研究及其應用.重慶大學學報,2004,27(1):123-127.

2．成海平,錢小紅.蛋白質組研究的技術體系及其進展.生物化學與生物物理進展,2000,27:584588.

3．陳紹農,潘遠江,陳耀祖.多肽及蛋白質質譜分析新進展.質譜學報,1995,16(3):15-21.

4．陳晶,付華,陳益.質譜在肽和蛋白質序列分析中的應用.有機化學,2002,22(2):81～90.

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6．劉慧敏,賴志輝,黎軍,等.碎片結構分析在MALDITOFMS法測定多肽序列中的應用.生物化學與生物物理學報,2000,32:179-182.

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8．HarveyDJ.Identificationofprotein-boundcarbohydratesbymassspectrometry[J].Proteomic,2001;1(2):311-328.

9．KARASM,HILLENKAMPF.Laserdesorptionionizationofproteinswithmolecularmassesexceeding10000daltons[J].Anal.Chem,1988,60:2299-2301.

10．龔海霞,陳榮華,郭錫熔.蛋白質組技術及其在臨床醫學領域的運用.國外醫學兒科學分冊,2001;28(6):287-289.

11．魏開華,楊松成,王紅霞,等.轉印到膜上的蛋白質的質譜分析.質譜學報,2000;20(3,4):89-90