欖香烯聯合生物合成管理論文

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【摘要】目的本實驗采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯合處理小鼠肝癌細胞Hca-F，觀察腫瘤細胞增殖、凋亡和形態學的變化，探討抑制/干擾腫瘤細胞的DNA、RNA或蛋白質合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點提供線索與依據。方法將Hca-F肝癌細胞用欖香烯（50μg/ml）、吡柔比星（THP）（10μmol/ml）、單獨和復合處理，設單獨瘤細胞（不處理）為陰性對照。Hca-F細胞濃度均為1×106/ml，每個觀察時間點均設3支復管，用臺盼藍拒染法計算細胞存活率，在透射電鏡下觀察欖香烯與THP聯合處理對腫瘤細胞超微結構的影響，用流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期。結果欖香烯聯合吡柔比星處理Hca-F比單獨使用兩種藥物的抑瘤率都高。結論本實驗所用生物大分子合成抑制劑不能阻斷欖香烯的抗瘤作用，提示欖香烯抗腫瘤作用對新的蛋白質表達依賴性較低。結合欖香烯處理后瘤細胞形態學的變化，提示欖香烯可能作用于腫瘤細胞膜或細胞中的某些蛋白質（如酶）等而直接殺傷腫瘤靶細胞，使對欖香烯抗瘤作用靶點的認識又進了一步。本實驗結果表明欖香烯和THP合用可使抗癌作用增強，這對欖香烯聯合其他藥物治療腫瘤可能有一定參考意義。

【關鍵詞】欖香烯；抑制劑；肝細胞癌

Theeffectofelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesisforhepaticcancer

【Abstract】ObjectiveInthisexperimentofHca-Fcells(amurinehepaticcellcarcinoma)weretreatedwithelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesis，theirproliferation，survival，cellcycle，apoptosisandmorphologywereobserved.ToclarifytheinfluencesofinhibitionofDNA，RNAandproteinontheantitumoreffectsofelemeneandtofindthepossibletargetsiteofelemene.MethodsTheHca-Fcellsweresingledormingledtreatedwithelemene（50μg/ml），aloneorcombinedwithTHP（10μmol/ml），theHca-Fcells(withouttreatment)wereusedtobethenegativecompare.TheendconsistenceofHca-Fcellsis1×106/ml，threetublesineverytimepoint.Tocalculatetheproportionofsurvivalwithtrypanblue，andobservetheimpactontheultrastructureofHca-FcellstreatedwithelemeneandTHPintransmissionelectronmicroscope，andexaminetheapoptosisandcellcyclesinflowcytometer.ResultsTheinhibitionrateofproliferationofHca-FtreatedwithelemeneandTHPwashigherthanthatofHca-Ftreatedwithelemeneonly.ConclusionTheseresultsshowedthattheantitumoreffectsofelemenecouldnotabolishedbycombinedtreatmentorpretreatmentwiththeinhibitorsofDNA，RNA，proteinsynthesis，binedusageofelemenewithTHPtocancertherapyisadvisable.

【Keywords】elemene；inhibitor；hepatocellularcarcinoma

欖香烯(elemene)是從中藥溫莪術（經鑒定為我國特有新種定名為溫郁金，CurcumaWenyujin）揮發油中提取的抗癌有效成分，它是一種僅含碳氫(C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜類化合物，此類物質有抗癌活性屬我國首報［1］。動物實驗與臨床應用均表明欖香烯的抗癌作用確切，而且不良反應很低。我們過去的研究表明欖香烯處理除可抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡外，還能增強腫瘤細胞的免疫原性，欖香烯處理能增強腫瘤細胞膜HSP70的表達，用表達譜基因芯片技術的研究表明欖香烯處理引起基因表達譜的變化。過去對欖香烯抗癌作用機制的研究僅限于欖香烯對腫瘤細胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影響，關于它的作用靶點及其信號傳導通路迄今研究很少。本實驗在上述研究的基礎上，采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯合處理小鼠肝癌細胞Hca-F，觀察腫瘤細胞增殖、凋亡和形態學的變化，探討抑制或干擾腫瘤細胞的DNA、RNA或蛋白質合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點提供線索與依據。

1材料與方法

1．1動物Balb/c系小鼠，引自中國醫學科學院北京藥物研究所，由本室自行繁殖提供。

1．2瘤株小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道轉移亞系Hca-F［2］，由本校病理學教研室凌茂英教授贈送，本室常規傳代、保種。

1.3主要藥品和試劑1%欖香烯注射液(elemene，大連市醫藥科學研究所)。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳萬樂藥業有限公司生產)。RPMI1640培養基（GIBCO，USA）。

1.4Hca-F細胞懸液的制備將傳代保種的Hca-F腹水型肝癌細胞常規接種于小鼠腹腔，0.2ml/只，收集第7～8天的腹水（腫瘤細胞生長最旺盛時期，死亡細胞和紅細胞含量較少），HS液破除紅細胞，PBS洗3次，計活細胞數，用含20%小牛血清RPMI1640培養液調細胞數至所需濃度。

1.5Hca-F肝癌細胞的處理將Hca-F肝癌細胞用欖香烯（50μg/ml）、吡柔比星（10μmol/ml）按本室常規方法單獨或復合處理，設單獨瘤細胞（不處理）對照。Hca-F細胞濃度均為1×106/ml，每個觀察時間點均設3支復管，加入相應的藥品，以臺盼藍拒染法于不同時間計數活細胞數，計算存活率。

1.6單純欖香烯處理和欖香烯聯合THP處理對Hca-F增殖的影響用MTT法測其OD值。

1.7欖香烯聯合THP處理對瘤細胞超微結構的影響［3］Hca-F細胞用欖香烯、THP單一或復合處理，細胞濃度和處理方法同前，處理時間為1h，收細胞，用PBS洗3次，以2.5%戊二醛固定，常規包埋制片，鈾—鉛雙染色，透射電鏡下觀察攝片。

1.8細胞凋亡的檢測和細胞周期的測定細胞收集同前，用PBS洗3次，加入PI染色液染色30min（避光、室溫）。上機檢測，Cellquest軟件低速獲取。用Modfit2.0軟件分析。

2實驗結果

2.1欖香烯聯合THP處理對Hca-F存活的影響單純用欖香烯處理，Hca-F的存活率就明顯降低，在30min～1h的時間內，細胞死亡率隨著藥物濃度增加而增加（表1），單用THP處理，也可導致Hca-F細胞死亡、藍染，其細胞死亡率也隨著藥物濃度增加而增加，欖香烯聯合THP處理，腫瘤細胞死亡率可達100%。

2.2欖香烯和THP聯合處理對Hca-F細胞周期與凋亡的影響實驗結果表明欖香烯與THP聯合處理對Hca-F細胞周期變化的影響及凋亡細胞百分率變化與單用THP相比也無明顯區別，欖香烯處理與不處理Hca-F對照組細胞各時相百分率及凋亡細胞百分率變化無明顯區別（見表2和圖1）。

2.3欖香烯聯合THP處理對Hca-F細胞形態學的影響見圖2。圖2可示：當欖香烯與THP聯合處理的腫瘤細胞形態發生了明顯的變化，細胞核染色質濃縮，核縮小，細胞腫脹破裂，細胞完整性受到明顯破壞，而單純用THP處理的30min內大多數沒有明顯改變，受損細胞形態學變化不典型，偶可見到凋亡、壞死的細胞，但比率并不高。圖1A：對照組；B：欖香烯50μg/ml；C：THP10μmol/ml；

3討論

大連醫科大學病理生理學教研室和腫瘤生物治療研究所從20世紀70年代起就開展了莪術油、欖香烯抗癌作用的機理研究［3～5］。結果表明欖香烯處理能誘導腫瘤細胞壞死、凋亡，增強腫瘤細胞的免疫原性。為了闡明后者與欖香烯誘導腫瘤細胞膜熱休克蛋白（heatshockprotein，HSP）表達之間的關系［7］，我們采用流式細胞術（FCM）、免疫組化、RT－PCR以及基因芯片等技術進行了較深入的研究，結果表明，欖香烯處理能增強腫瘤細胞膜HSP70的表達，但不增強HSP70基因的轉錄，提示這僅僅涉及HSP分布的改變。為較準確展現可能與欖香烯抗癌作用有直接關系的基因表達變化，我們用欖香烯（濃度為50μg/ml，作用時間1h）處理人肝癌細胞HepG2，用表達譜基因芯片（Affymetrix，HumanGenome，U95APart#，510448，Lot#9913250-9913251，U.S.A.，其上有12550條寡聚核苷酸）技術研究了欖香烯處理引起基因表達譜的變化并與未經欖香烯處理的和熱休克的HepG2細胞對比，有34條基因表達發生變化，19條基因變化是欖香烯特異的，如肝特異轉錄因子HNF-6轉錄增加，肝再生因子（LRF）的基因表達下降，細胞周期調控因子CDC25Hu2的基因表達降低，凋亡相關分子BBC3、TRIP的基因表達下降等，采用RT-PCR方法驗證了BBC3和TRIP基因的變化［6］。

本實驗在上述研究工作的基礎上研究了欖香烯聯合生物大分子合成的抑制劑對Hca-F的增殖、存活、凋亡、細胞周期及形態學改變的影響。結果表明本實驗所用三種生物大分子合成抑制劑都不能阻斷欖香烯的抗瘤作用。THP可嵌入DNA雙鏈中，抑制DNA聚合酶的活性，從而抑制DNA的復制與轉錄。拓撲替康能夠抑制拓撲異構酶，從而抑制DNA復制。兩藥都不能阻斷欖香烯的抗瘤作用。放線菌酮是真核細胞蛋白質合成的抑制劑，能特異阻斷蛋白質的合成，許多實驗常用放線菌酮預處理觀察藥物作用及細胞代謝、功能、凋亡等過程對新的蛋白質生物合成的依賴性［7］。放線菌酮預處理并不能阻斷欖香烯對Hca-F細胞增殖的抑制作用，表明欖香烯抗腫瘤作用對新的蛋白質表達依賴性較低。結合欖香烯處理后瘤細胞形態學的變化，提示欖香烯作用于腫瘤細胞膜或細胞中的某些蛋白質（如酶）等直接殺傷腫瘤靶細胞。由于欖香烯分子小，抗癌作用比較獨特，尤其是不與其他抗癌藥有交叉耐藥性，與其他抗癌藥聯合應用是值得探討的問題。本實驗結果表明欖香烯和拓撲替康、THP合用可使其抗癌作用增強，這對欖香烯聯合其他藥物治療腫瘤可能有一定參考意義。

【參考文獻】

1時繼慧.溫莪術揮發油的實驗研究—β欖香烯抗腫瘤作用的研究.中藥通報，1981，6：32.

2凌茂英.小鼠肝癌（Hca）兩株克隆細胞系轉移表型的比較.大連醫學院學報，1994，16：124-129.

3金梅.欖香烯對腫瘤細胞生物學特性的影響及其瘤苗免疫效應的研究.中國腫瘤生物治療雜志，1999，6：219-222.

4錢振超，劉金友，趙肅榮，等.莪術瘤苗的主動免疫保護效應——莪術抗瘤原理的探討.藥學學報，1981，16：892-899.

5錢振超，王大慶，金成鋼，等.瘤苗特異主動免疫治療及其機制的研究.中國腫瘤生物治療雜志，1995，2：120-128.

6高志紅，施廣下，郭連英，等.欖香烯復合瘤苗免疫原性增強的分子機制.中國腫瘤生物治療雜志，2002，9：94-96.

7LiuTX，ZhangJW，TaoJ，etal.Geneexpressionnetworksunderlyingretinoicacid-induceddifferentiationofacutepromyelocyticleukemiacells.Blood，2000，96(4)：1496-1504.