金釵石斛提取物抗白內障研究論文

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【摘要】【目的】探討金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)總生物堿和粗多糖對白內障的抑制作用。【方法】采用溶劑法分離提取金釵石斛總生物堿和粗多糖;體外培養(yǎng)大鼠晶狀體,加入H2O2與總生物堿(或粗多糖)共培養(yǎng)24h;分別在培養(yǎng)后6、12、18、24h共4個時段于解剖顯微鏡下觀察并記錄晶狀體混濁度的改變;檢測晶狀體水溶性蛋白、谷胱甘肽(GSH)的含量及總超氧化物歧化酶(TSOD)和丙二醛(MDA)的活性。【結果】金釵石斛總生物堿和粗多糖均能減輕晶狀體混濁度,并能顯著升高晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及TSOD活性,降低MDA的活性(均P<0.05),其中石斛總生物堿高劑量組效果最佳。【結論】金釵石斛總生物堿和粗多糖在體外均有一定的抗白內障作用,其機制與拮抗晶狀體的氧化損傷有關,而總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。

【關鍵詞】金釵石斛/藥理學金釵石斛/化學白內障/中藥療法晶狀體/病理學器官培養(yǎng)

白內障(cataract)是一種常見的致盲眼病,它是多種因素共同作用的結果,氧化損傷是其發(fā)病機制之一[1]。當前許多中藥研究都是從提高晶狀體抗氧化能力入手,利用抗氧化劑或抗氧化酶激活劑來消除或中和晶狀體中的氧化產物,阻止或逆轉晶狀體變渾濁,從而抑制或延緩白內障的發(fā)生發(fā)展[2]。石斛是一種名貴中藥材,抗白內障是其主治功效之一。已有研究證實,石斛水煎劑可通過改變晶狀體相關酶的活性而對D半乳糖性白內障起到防治作用[3],石斛的乙酸乙酯提取物在體外還可抑制醛糖還原酶和過氧化脂質(LPO)的產生[4],這些研究在一定程度上揭示了石斛抗白內障的作用機理。然而,石斛化學成分復雜,其抗白內障的具體有效成分是什么,至今仍未見報道。本實驗通過體外培養(yǎng)晶狀體,對金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)的粗提物總生物堿(totalalkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白內障作用進行了探討,現報道如下。

1材料和方法

1.1動物4~5周齡Wistar大鼠20只,體質量80~120g,雌雄不限,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號:粵臨證字2007A025。

1.2藥材和試劑金釵石斛由貴州赤水信天石斛有限公司提供,經廣州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李薇教授鑒定。DMEM低糖培養(yǎng)基(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,福州邁新生物技術開發(fā)公司);體積分數30%過氧化氫(H2O2,浙江臨安化工二廠);吡諾克辛鈉滴眼液(武漢天天明藥業(yè)有限責任公司,批號:070102);Bradford蛋白質定量試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品;其他試劑均為國產分析純。

試劑配制如下。改良碘化鉍鉀試劑:甲液:0.85g次硝酸鉍溶于10mL冰醋酸,加水40mL;乙液:8g碘化鉀溶于20mL水中;將甲液與乙液等量混合后,取1mL與2mL醋酸混合,供生物堿的顯色用。Molish試劑:甲液:α萘酚1g,加體積分數75%乙醇至10mL;乙液:濃硫酸;供多糖的檢測用。

1.3儀器E52AA型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHZDIII型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);HI98128型pH計(北京HANNA);SWCJIF型超凈臺(蘇州凈化設備廠);Galaxys型CO2培養(yǎng)箱(美國RSBiotech);STPT型解剖顯微鏡(日本OLYMPUS);5810R型低溫高速離心機(德國Eppendorf);7200型分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.4金釵石斛總生物堿和粗多糖的分離提取及檢識金釵石斛總生物堿和粗多糖的提取方法參照文獻[5-6]并略加改進:干燥金釵石斛切碎打成粗粉,加入體積分數為95%乙醇85℃回流提取(4h/次×3次),合并提取液,減壓回收乙醇后得到石斛浸膏,加1moL/LHCL調節(jié)浸膏的pH為3,氯仿萃取3遍后,棄氯仿層,加濃氨水調母液pH=11,再經氯仿萃取3遍,將氯仿層合并,減壓濃縮,揮干氯仿后即得到總生物堿。將醇提后的藥渣曬干后加入20倍體積的水,100℃回流提取(2.5h/次×4次),合并提取液,減壓濃縮至一定容積后,加入體積分數95%乙醇,直至醇濃度為70%,置于冰箱內,隔夜取出沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌3遍,再經Sevag法除蛋白處理,冷凍干燥,得到粗多糖。總生物堿的檢識參照文獻[7]:取少量分離所得的總生物堿于試管內,加入蒸餾水和10μL二甲基亞砜(DMSO)將其充分溶解,滴在硅膠板上,噴霧改良碘化鉍鉀試劑后,可見硅膠板上滴了提取物溶液的點顯現出非常明顯的桔紅色斑點,由此證明提取物為生物堿。粗多糖的檢識參照文獻[7]:取多糖水溶液1mL加入Molish試劑3滴,搖勻,傾斜試管,沿試管壁緩慢滴加1mL濃硫酸,靜置,可見在試液與濃硫酸交界面產生非常明顯的紫色環(huán),證明提取物為多糖。

1.5藥物配制用PBS分別將總生物堿和粗多糖配制成濃度為50mg/mL的溶液(生物堿加10μLDMSO助溶),0.22μm微孔濾膜過濾滅菌處理后-20℃保存待用。

1.6晶狀體的培養(yǎng)及分組參照文獻[8]的方法并略加改進:頸椎脫臼處死大鼠,用眼科剪鑷迅速摘取雙眼眼球,以含800U/mL青霉素、800μg/mL鏈霉素的冷PBS液漂洗眼球后,投入含相同濃度雙抗液的PBS液中浸泡,轉入超凈臺。約10min后將大鼠眼球轉移至含500U/mL青霉素、500μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,小心從眼球后極部剪開鞏膜,取出晶狀體,去除晶狀體表面的虹膜和玻璃體,晶狀體經PBS液漂洗2遍后,再用DMEM液漂洗1遍,然后再放入已預熱的24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔含1mLDMEM培養(yǎng)基(含體積分數20%胎牛血清、100μ/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素),預培養(yǎng)5h(37.0℃、體積分數5%CO2)后,剔除受損傷或已混濁的晶狀體。將35只未受損傷、透明的晶狀體按照隨機原則分7個組培養(yǎng),每組5只:正常對照組(DMEM培養(yǎng)基+100μL胎牛血清),模型組(正常對照組培養(yǎng)基+2mmol/LH2O2),生物堿高、低劑量組(正常對照組培養(yǎng)基中各加入2mmol/L的H2O2,同時分別添加4、2mg/mL生物堿),多糖高、低劑量組(在正常組培養(yǎng)基中各加入2mmol/L的H2O2,同時分別添加4、2mg/mL粗多糖),陽性對照組(正常對照組培養(yǎng)基+2mmoL/L的H2O2+100μL吡諾克辛鈉滴眼液)。上述各組培養(yǎng)基均含100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素。

1.7觀察并照相記錄晶狀體混濁度加藥培養(yǎng)后,每6h更換1次培養(yǎng)液以保持H2O2濃度不變。同時觀察并記錄各組晶狀體混濁度。離體培養(yǎng)晶狀體混濁度的分級方法參照文獻[9]:在黑色背景下設計1mm×1mm的黑色方格圖,將被檢晶狀體置于"+"字交叉的黑色線條之上,在解剖顯微鏡下觀察晶狀體,按透過晶狀體所能看到的線條清晰度進行分級。"-"表示線條清晰可見,為完全透明;晶狀體"+"混濁:線條模糊,但輪廓尚可辨;"++"混濁:線條輪廓不清,僅中央部隱約可見;"+++"混濁:線條完全不見,晶狀體全部混濁。最后以各組晶狀體混濁度,即"+"出現量的多少進行統計學處理。培養(yǎng)后24h,給各只晶狀體拍照。

1.8晶狀體水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性檢測晶狀體拍照后,用冷PBS液洗滌2遍,盡量洗凈培養(yǎng)液,再用濾紙吸干水分,稱質量。按質量與體積比為1∶10的量加入冷PBS液,在冰浴上充分勻漿后倒入2mL離心管中,4℃、12000r/min離心20min,取上清即為晶狀體水溶性蛋白,采用Bradford法檢測定蛋白含量。取剩余上清,分別采用二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH含量,采用黃嘌呤氧化酶法測定總超氧化物歧化酶(TSOD)活性,采用硫代巴比妥酸(thibabituricacid,TBA)法檢測MDA活性,以上操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.9統計學方法應用統計軟件SPSS11.5對所有數據進行統計分析。

2結果

2.1各組藥物對晶狀體混濁度的影響晶狀體分組培養(yǎng)后6h,模型組晶狀體均出現"+"度渾濁,其他各組均透明;繼續(xù)培養(yǎng)6h,可見正常對照組晶狀體均保持透明,模型組晶狀體為"++"~"+++"度混濁,其他各組晶狀體混濁度在"+"~"++"度不等;培養(yǎng)后24h,正常對照組晶狀體均保持透明,模型組晶狀體均為"+++"度混濁,肉眼觀為乳白色,且晶狀體體積明顯縮小,其他各組晶狀體混濁度表現為"+"~"+++"不等。各個藥物添加組中,陽性對照組、生物堿高劑量組晶狀體混濁度較模型組顯著減輕(均P<0.05);生物堿高、低劑量組及粗多糖高、低劑量組晶狀體混濁度與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。將各組晶狀體混濁度與過氧化氫損傷的時間進行相關性分析,其中生物堿高劑量組差異有顯著性意義(P<0.01),其他各組差異也均有顯著性意義(P<0.05),由此可見,隨H2O2作用時間的延長,晶狀體混濁度逐漸加重。結果見表1及圖1。

表1不同時段各組晶狀體混濁度量化比較(略)

Table1Comparisonofthelensopacityratioatdifferentstages

統計方法:t檢驗;①P<0.05,與正常對照組比較;②P<0.05,與模型組比較

a.正常對照組b.模型組c.陽性對照組d.生物堿高劑量組e.生物堿低劑量組f.多糖高劑量組g.多糖低劑量組

圖1培養(yǎng)24h后各組晶狀體混濁度比較(×25)(略)

Figure1Thelensopacityindifferentgroupsafterculturingfor24h(×25)

2.2各組藥物對晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及MDA、TSOD活性的影響由表2可見,模型組與正常對照組比較,水溶性蛋白含量、GSH含量、TSOD活性均顯著降低,MDA活性顯著升高(均P<0.05),而陽性對照組、生物堿組、粗多糖組可顯著升高水溶性蛋白、GSH含量以及TSOD活性,降低MDA活性,各給藥組與模型組比較,差異均有顯著性意義(P<0.05)。生物堿高劑量組水溶性蛋白含量顯著高于陽性對照組(P<0.05),GSH含量除多糖低劑量組顯著低于陽性對照組外(P<0.05),其他各實驗組與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05);TSOD活性除生物堿低

表2各組晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及MDA、TSOD活性變化比較(略)

Table2Comparisonofthecontentsofwatersolubleprotein,GSH,andtheactivityofMDA,TSODindifferentgroups

統計方法:t檢驗;①P<0.05,與正常對照組比較;②P<0.05,與模型組比較;③P<0.05,與陽性對照組比較劑量組和多糖低劑量組顯著低于陽性對照組外(P<0.05),其他各組與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05);MDA活性除生物堿高劑量組顯著低于陽性對照組(P<0.05)外,其他各組與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

晶狀體的氧化損傷是目前常用的白內障研究模型,而H2O2是很好的氧化損傷誘導劑。體內抗氧化系統功能下降或氧化作用增強均可導致眼組織的損傷,誘發(fā)或促進白內障的形成[10-11]。而活性氧簇,如H2O2、超氧陰離子、單態(tài)氧、氫氧根等可以引起很多生物學變化,最終使晶狀體的水不溶性蛋白增加而形成白內障[12]。GSH是一種抗氧化酶,在晶狀體中含量較高,對晶狀體起著多方面的重要作用[13]。SOD和MDA常常相互配合用以反映組織細胞氧化/抗氧化系統功能的平衡。此外,氧化損傷等因素致晶狀體蛋白質分子構型發(fā)生改變,造成可溶性蛋白質含量的減少和不可溶性蛋白質含量的增高[14],而不溶性蛋白質聚集,即導致晶狀體光散射作用增加,即失去透明性。本研究采用體外構建氧化損傷白內障模型的方法,對金釵石斛總生物堿和粗多糖的抗白內障作用進行探討。結果顯示,模型組可溶性蛋白含量顯著低于正常對照組,而各用藥組可顯著緩解可溶性蛋白的減少,生物堿高劑量組尤其明顯;同時,金釵石斛的提取物總生物堿和粗多糖均可提高晶狀體GSH含量及SOD活性,同時降低MDA活性,即通過提高晶狀體抗氧化能力而達到抑制白內障的作用。

石斛具有抗白內障的作用早已被證實,但其抗白內障的確切有效成分至今仍未見報道。本實驗證實,金釵石斛的兩種藥效部位(總生物堿和粗多糖)在體外可通過減輕晶狀體的氧化損傷而抑制白內障的進程,且總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。然而,金釵石斛化學成分復雜,據文獻報道,其總生物堿含量達0.4%~0.6%,種類有30多種,多糖含量也高達4%,并以各種不同的形式存在[15],因此,下一步研究可從這兩種粗提物入手,進一步挖掘金釵石斛抗白內障的確切有效成分,并闡明其抗氧化的具體反應過程,這對于抗白內障的藥物研究以及金釵石斛藥用價值的開發(fā)都有著重要的意義。

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