小議銅綠假單胞菌整合子與多重抗藥性探索

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摘要目的在銅綠假單胞菌中檢測1類整合子并分析整合子對細菌耐藥性的影響。方法用VITEK-AMS微生物自動分析儀鑒定細菌和藥敏試驗，用PCR方法擴增I類整合酶基因，經電泳后檢測擴增產物。結果158株銅綠假單胞菌中檢測出1類整合子42株，檢出率為26.6%。1類整合子陽性菌對氨基糖苷類、喹諾酮類及頭孢菌素類藥物表現出較高的耐藥率。攜帶1類整合子菌株易表現出對至少4種抗菌素的多重耐藥性，其多重耐藥率為68.6%(33/48)，明顯高于1類整合子陰性菌株（28.6%），P＜0.05。結論1類整合子廣泛存在銅綠假單胞菌中,1類整合子對細菌多重耐藥性的產生和傳播起著重要作用，應加強臨床細菌基因水平的耐藥監測，采取有效措施防止耐藥性的傳播。

關鍵詞銅綠假單胞菌整合子多重耐藥

銅綠假單胞菌為條件致病菌，是醫院內感染的主要病原菌之一。患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者以及術后或某些治療后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可導致血行散播，而發生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染了銅綠色假單胞菌可造成死亡。隨著抗生素的廣泛使用和不合理使用，使包括銅綠假單胞菌在內的多種細菌的耐藥性問題日益嚴重。

整合子是與細菌耐藥性傳播有關的基因系統，整合子通過捕捉和整合細菌耐藥基因，在細菌耐藥性的傳播和擴散中起了重要的作用。整合子通過位點特異性的基因重組可整合多種耐藥基因對細菌多重耐藥的形成起著重要作用。

本文對158株銅綠假單胞菌進行分析，以探討銅綠假單胞菌整合子與其多重耐藥性之間的關系。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

2009年10月～2010年5月從我院臨床標本中分離的銅綠假單胞菌158株。標本分別來自老年病房(53株)、呼吸科病房（49株）、普外科病房(28株)、泌尿科病房(16株)和內分泌病房(12株)。菌株分別分離自痰標本（68株）、膿汁(42株)、咽拭子(18株)、尿標本(12株)、傷口分泌物（10株）和血液（8株）。標準質控菌株為銅綠假單胞菌（ATCC27853）。攜帶1型整合子銅綠假單胞菌為本實驗室分離株經測序證實，作為PCR實驗陽性對照。

1.1.2鑒定卡片

全自動微生物分析儀(VITEK-AMS)采用的GNI鑒定卡、GNS藥敏卡均購自法國Biomerievx公司,GNS藥敏卡包括氨芐青霉素、慶大霉素、環丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、復方新諾明、頭孢噻肟、亞胺培南11種抗菌藥物職稱論文。

1.1.3PCR試劑

TaqDNA聚合酶,4種dNTP混合液,DNA分子標準參照物購自Takara公司;瓊脂糖,溴化乙啶等常用分子生物學試劑購自上海生工公司。

1.1.4主要儀器

VITEK-AMS自動鑒定系統購自法國Biomerievx公司;PCR擴增儀、DNA/RNA/proteinanalyzer分析儀和高速低溫離心機購自德國eppendorf公司;PCR電泳儀為北京崇文東方儀器廠產品;DGW-99型臺式高速微型離心機為寧波新芝科器研究所產品。

1.2實驗方法

1.2.1菌株鑒定

所有菌株都用VITEKAMS分析儀GNI細菌鑒定卡進行菌種鑒定。體外藥物敏感試驗：采用GNS檢測卡測定13種抗菌藥物對158株銅綠假單胞菌的MIC值，操作方法按照VITEKAMS規定的方法進行。

1.2.2加熱裂解法制備DNA模板

:用Luria-Bertani液體培養基200r/min振蕩培養8h獲得對數生長期菌株。攜帶1型整合子銅綠假單胞菌為本實驗室分離株經測序證實，作為PCR實驗陽性對照。

1.2.3篩選1型整合子陽性菌株

用PCR方法擴增整合子可變區，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可變區下游引物aagcagacttgacctgat，進行PCR擴增。50ulPCR反應體系為:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反應循環參數設置如下94℃預變性4分鐘；94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分鐘，循環35次；最后72℃延伸10分鐘。

1.2.4PCR反應結束后取產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下拍照記錄結果。

1.2.5統計學處理

采用χ2檢驗，P＜0.05有顯著差異。統計軟件為SPSS10.0。

2結果

2.11類整合子基因檢測結果

全部158株銅綠假單胞菌的DNA上有42株檢測到I類整合子，占細菌總數的26.6%。1類整合子的大小分別為600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根據各株細菌質粒DNA上檢測到1類整合子的大小和數目，細菌質粒NDA上的整合子可分為5種整合子譜。

2.21類整合子陽性菌株與耐藥性的關系

對比1類整合子陽性菌株與陰性菌株對抗菌藥物的耐藥率，并做統計分析，結果見表1。

1類整合子陰性菌株對11種抗菌藥物完全敏感率為54.4%（86/158）。1類整合子陽性菌株更易表現出對青霉素、喹諾酮類、磺胺類藥物的耐藥。耐藥率最高的是復方新諾明（100%）其次為氨芐青霉素（90.5%）和慶大霉素（85.7%），丁胺卡那也表現出較高的耐藥率（76.7%）。1類整合子陽性菌株對6種藥物的耐藥率顯著高于陰性菌株，P<0.05。

2.31類整合子與多重耐藥率的相關性

多重耐藥率(耐4種以上抗生素)為62.0%(98/158)，其中1類整合子陽性菌株多重耐藥率占85.7%(36/42)，陰性菌株多重耐藥率為20.7%(24/116)。1類整合子陽性菌株多重耐藥率明顯高于陰性株，差異有統計學意義(χ2=18.23，P<0.01)。

3討論

整合子是存在于細菌質粒、染色體或轉座子上的一種遺傳結構，可以捕獲耐藥基因，使細菌表現為對抗生素的多重耐藥[1]給臨床治療帶來極大的困難。整合子本身不能移動，但常作為轉座子的一部分或借助可移動性質粒在同種細菌或不同種細菌間播散，造成細菌耐藥性的擴大，是細菌多重耐藥迅速發展的重要原因。根據整合酶的不同分為6類[2]在臨床分離的菌株中以1類合子最為常見。1類整合子基本結構由三部分組成,兩端為高度保守的序列，分別稱作5’CS和3’CS,5’CS和3’CS之間為可變區，可變區由一個或多個外來插入的基因盒組成[3]。在整合酶的催化下．通過位點重組系統整合外來耐藥基因，使耐藥基因得到不斷的累積，從而使細菌具有耐藥性和多重耐藥性。目前在1類整合子中發現的基因盒已超過80種，大部分是耐藥基因盒，編碼產物可賦予細菌對幾乎全部臨床抗生素耐藥。

銅綠假單胞菌作為醫院感染的重要的條件致病菌，在長期應用激素、免疫抑制劑，進行腫瘤化療、放射治療等導致病人免疫功能低下，以及手術后或某些治療操作后的病人易導致本菌感染，該菌常常具有多重耐藥的特點，因此其所造成的感染難以治愈，病死率高。而近年證實整合子介導的多重耐藥基因也是造成銅綠假單胞菌多重耐藥的主要原因之一[4]。

本研究顯示，銅綠假單胞菌在呼吸道的感染占首位為54.5%（86/158），這與大多數文獻的報導相符合[5]究其原因，可能與銅綠假單胞菌容易定植于呼吸道，且由于氣管插管、流感病毒感染及其他各種炎癥等因素損害了呼吸道黏膜，在鞭毛或蛋白酶作用下，細菌易于移生、粘附有關。傷口創面也較易受其侵害，檢出率32.9%（52/158），居第二位，與其存在廣泛及醫院環境的隔離消毒程度關系頗大。實驗證明，我院患者分離的銅綠假單胞菌對多種抗生素出現高耐藥，尤其是表現出對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、單環β-內酰胺類以及磺胺類等的多重耐藥性，更是不容忽視。

研究表明1型整合子在銅綠假單胞菌耐藥性產生的遺傳機制上起著重要作用，它是引起細菌多重耐藥的重要因素。由于抗生素使用量和種類日趨增多，使細菌生存面臨更大的抗生素選擇壓力。本次研究客觀反映了我院銅綠假單胞菌的整合子攜帶情況，分析本次結果發現在158株銅綠假單胞菌中檢出42株整合子陽性，檢出率為26.6%，與其他報道銅綠假單胞菌整合子檢出率不完全相同[6]，這可能是由于地域的不同所造成的，也可能與菌株的來源有關。整合子陽性的細菌表現出多重耐藥性比整合子陰性菌高，證實了整合子介導了多重耐藥性產生。但由于銅綠假單胞菌耐藥機制比較復雜，耐藥性還與抗菌藥物作用的靶位改變、OprD蛋白缺失引起的菌膜通透性下降、菌體細胞膜上主動外排泵系統的上調以及產生B一內酰胺酶等機制有關，對于銅綠假單胞菌的耐藥機制還有待于進一步研究，以采取有效措施控制其耐藥性傳播。抗生素的使用越廣泛，使攜帶新耐藥基因的優勢菌越多，并導致攜帶耐藥基因菌群量更大，為1類整合子多重耐藥細菌提供了選擇性壓力，可能使其耐藥種類更多，傳播更廣泛。因此，這種耐藥機制引起的細菌耐藥應該引起臨床的足夠重視，加大監測力度，預防醫院感染的發生。

參考文獻

1.王志銳，李力，張堅磊，等.耐藥銅綠假單胞菌攜帶的整合子及其耐藥基因盒檢測分析。中華檢驗醫學雜志，2007，30(7)：802～803

2.王志銳，李力，張堅磊，等。耐藥銅綠假單胞菌攜帶的整合子及其耐藥基因盒檢測分析。中華檢驗醫學雜志，2007，30(7)：802～803

3.楊維青，石磊，尹曉琳，等.不同地區銅綠假單胞菌第一類整合子和整合子相關基因盒的分布J..中國抗生素雜志，2006，31(1):15