二至丸合桂枝湯對三陰性乳腺癌的作用

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摘要目的：探討二至丸合桂枝湯對三陰性乳腺癌（TNBC）細胞系順鉑耐藥性的影響及其分子機制作用。方法：設計并合成3條缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）siRNA，分為1#siRNA組、2#siRNA組、3#siRNA組、陰性對照組及Control組分別轉染，Westernblot篩選最適siRNA。同時利用藥物連續誘導法篩選順鉑耐藥性MDA-MB-231細胞株(MDA-MB-231/CDDP)。制備含二至丸合桂枝湯血清，MDA-MB-231/CDDP細胞株隨機分為A：空白組(轉染siRNA陰性對照)、B：HIF-1αsiRNA組、C：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯組(200µg/ml含藥血清)、D：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200µg/ml)+順鉑(10μmol/L)組，繼續培養，檢測細胞活性、細胞凋亡及細胞侵襲情況。同時利用qRT-PCR和Westernblot分別檢測各組細胞中血管內皮生長因子（VEGF）、HIF-1αmRNA及蛋白表達情況。結果：3#siRNA組HIF-1α蛋白表達水平抑制最顯著，選此siRNA用于后續研究。與A組相比，C組和D組在作用24h、48h后均可顯著抑制MDA-MB-231/CDDP細胞活性(P＜0.05或P＜0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P＜0.01)，且能顯著抑制細胞侵襲能力(P＜0.05或P＜0.01)，其中，D組作用效果最顯著。qRT-PCR和Westernblot檢測結果顯示二至丸合桂枝湯與順鉑聯合干預，可顯著下調MDA-MB-231/CDDP細胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表達。結論：二至丸合桂枝湯可通過抑制HIF-1α通路，下調VEGF表達，調控TNBC細胞系的順鉑耐藥性。

關鍵詞：三陰性乳腺癌；二至丸；桂枝湯；順鉑耐藥性

HIF-1α通路三陰性乳腺癌（TNBC）靶向及內分泌治療效果不佳，新輔助化療方案對TNBC具有較高的緩解率和良好的預后，順鉑為首選化療藥物之一，但存在順鉑耐藥性，逆轉順鉑耐藥性是有效治療TNBC的潛在策略。缺氧誘導因子l（HIF-1）可促進腫瘤增殖和血管新生；HIF-1α功能性亞基與HIF-1活性水平密切相關。二至丸合桂枝湯可介導HIF-1α對TNBC細胞順鉑耐受機制進行調控，但其機制仍未闡明。基于此，本研究利用HIF-1αsiRNA轉染順鉑耐藥性MDA-MB-231（MDA-MB-231/CDDP）細胞株，深入探討二至丸合桂枝湯介導HIF-1通路對TNBC細胞系順鉑耐藥性的調控機制，以期為二至丸合桂枝湯的臨床推廣應用提供堅實的理論基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物與細胞：健康SPF級SD大鼠，體質量200±30g[購于上海斯萊克動物實驗有限公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0015]，飼養于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心，動物使用SYXK許可證號為(浙)2020-0024。適應喂養1周。轉移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231(貨號：iCell-h133，賽百慷)，于含青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、5%胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)的DMEM培養基培養，置于恒溫培養箱中(37ºC，含5%CO2)。1.2實驗試劑與儀器：二至丸合桂枝湯(女貞子、旱蓮草各10g，桂枝、芍藥、生姜各9g，炙甘草6g，大棗12枚，水煎至300ml，濃縮至1g/ml)。FBS(貨號：11011-8615，浙江天杭生物科技)；DMEM高糖培養基(貨號：SH30243.01，Hyclone)；CCK-8試劑盒(貨號：HY-K0301，MCE)；細胞凋亡試劑盒(貨號：556547，BD)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：pc0020，Solarbio)。HIF-1α、血管內皮生長因子（VEGF）、GAPDH抗體(貨號：AF1009、AF5131、AF7021，Affinity)。CMaxPlus酶標儀(MD)；Micro17R低溫高速離心機(Thermo)；C6流式細胞儀(BD)；LightCy-cler®96實時熒光定量PCR(羅氏)；NanodroponemRNA定量儀(ThermoScientific)。1.3HIF-1αsiRNA設計、轉染與分組：合成三條Gan-kyrinsiRNA和一條對照siRNA，具體序列如下：1#siRNA組(5'-GCUGGAGACACAAUCAUAUTT-3’)；2#siRNA組(5'-AGGAAGAACTATGAACATAAA-3')；3#siRNA組(5'-TACGTTGTGAGTGGTATTATT-3')；陰性對照組(5'-UUCUCC-GAACGUGUCACGUTT-3')。將HIF-1αsiRNA和Lipo-fectamine™2000轉染試劑在OptiMEM介質中按照siRNA∶聚合物為1∶1(w/w)制備復合物。在50nMsiRNA濃度下向細胞中加入配合物；細胞在50%～60%融合時轉染siRNA復合物。同時設置Control組，不做處理。1.4MDA-MB-231/CDDP細胞株建立：順鉑連續誘導法篩選耐藥細胞株。MDA-MB-231細胞系取對數生長期接種于DMEM培養液(含順鉑+10%FBS)，0.01、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的順鉑逐漸誘導，48h后換培養液，每2～3d傳代1次，誘導6個月獲得細胞株。1.5制備二至丸合桂枝湯血清：20只SD大鼠隨機分為兩組，正常組：蒸餾水；給藥組：8.5g·kg-1·d-1二至丸合桂枝湯，灌胃7d。腹主動脈收集5ml血標本，合并清液，滅活。微孔濾膜濾過，于－80℃冰箱保存。1.6給藥處理實驗分組：MDA-MB-231/CDDP細胞株在10%FBS的DMEM高糖培養基培養。細胞隨機分為A：空白組(轉染siRNA陰性對照)、B：HIF-1αsiRNA組、C：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200µg/ml含藥血清)組、D：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200µg/ml)+順鉑(10μmol/L)組，培養48h。1.7Westernblot：分離目標蛋白，SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜，先后加一抗和二抗孵育，免疫印跡反應結束后，化學發光儀顯影。1.8CCK-8檢測：根據“1.6”細胞分組，培養對數生長期細胞懸液，加入10μl/孔CCK-8試劑，而后于450nm處測定吸光度值，計算細胞活性。1.9流式細胞術：于6孔板接種對數生長期細胞，細胞濃度調至1×106/ml。添加500μl結合緩沖液，上清液離心并添加100μl結合緩沖液。之后分別加入5μl和10μlPI的膜AnnexinV-FITC。室溫下反應15min，加入400μl結合緩沖液，1h內檢測細胞凋亡率。重復3次。1.10Transwell細胞侵襲：將5×104個細胞接種在Transwell上部隔室的無血清培養基中，并在下部隔室中添加含10%FBS的DMEM培養基。24h后棉簽擦拭基質膠和上部隔室的細胞，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，0.1%結晶紫染色30min。倒置顯微鏡觀察。重復3次。1.11qRT-PCR檢測：按試劑盒操作說明，加Trizol提取各組細胞總mRNA，mRNA質量檢測完畢后，逆轉錄合成cDNA，cDNA為模板，特異性擴增VEGF、HIF-1α，GAPDH為內參。VEGF及HIF-1αmRNA表達量應采用2-△△Ct方法計算。各引物序列見表1。

2結果

2.1HIF-1α蛋白表達在不同siRNA下的影響：利用Westernblot篩選合適的HIF-1αsiRNA轉染用于后續實驗。由圖1，在MDA-MB-231細胞中，相比Control組，2#、3#siRNA組的HIF-1α蛋白表達水平顯著降低(P＜0.01)，且3#siRNA抑制效果比2#siRNA更好，因此后續實驗選擇3#siRNA進行轉染。圖1不同siRNA對MDA-MB-231細胞中HIF-1α蛋白表達情況2.2MDA-MB-231/CDDP細胞活性在二至丸合桂枝湯聯合用藥下的影響：由圖2，作用24h、48h后，與A組相比，C組和D組細胞活性均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。圖2MDA-MB-231細胞活性變化情況（-x±s，n=6)2.3二至丸合桂枝湯聯合用藥對MDA-MB-231/CDDP細胞凋亡的影響：由圖3，與A組相比，各組別細胞凋亡率均有一定程度的升高，其中，D組促進細胞凋亡效果最好，凋亡率最高。2.4二至丸合桂枝湯聯合用藥對MDA-MB-231/CDDP細胞侵襲能力的影響：由圖4，各給藥組不同程度地抑制細胞侵襲。與A組相比，細胞侵襲能力顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)的是C和D組MDA-MB-231/CDDP，且D組抑制細胞侵襲能力最顯著。2.5MDA-MB-231/CDDP細胞中VEGF、HIF-1αmRNA及蛋白表達在二至丸合桂枝湯聯合用藥下的影響：由圖5可知，與A組相比，VEGF、HIF-1αmRNA表達均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，在各干預組MDA-MB-231/CDDP細胞中，C組、D組細胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中，降低程度最明顯的是D組細胞中HIF-1α、VEGFmRNA及蛋白表達。

討論

TNBC在中醫學屬“奶巖”“乳巖”等范疇，病位在乳房，病根在肝腎，治療的關鍵在于補腎益肝、調理陰陽。臨床研究發現，二至丸合桂枝湯可通過上調5-羥色胺、抑制素B水平，有效改善絕經前Luminal型乳腺癌患者的臨床癥狀[1]。研究表明，HIF-1αsiRNA通過Westernblot篩選而來，從結果得出，受到明顯抑制的是位于3#siRNA組MDA-MB-231細胞中的HIF-1α蛋白表達，故選用3#siRNA組HIF-1αsiRNA進行轉染。CCK-8檢測結果作用24h、48h后，D組可顯著抑制細胞活性且效果最好，提示二至丸合桂枝湯聯合順鉑可有效抑制MDA-MB-231/CDDP細胞活性，有效改善MDA-MB-231/CD-DP細胞的耐藥性。HIF-1可調節氧代謝，HIF-1α在多種腫瘤中表達高[2]。乳腺癌細胞耐藥形成過程中HIF-1α意義特殊，利用HIF抑制劑共同給藥可逆轉耐藥。此外，VEGF在多種腫瘤疾病中作用顯著，可促進腫瘤血管新生和癌細胞增殖[3]。研究發現，VEGF受HIF-1α調控，可促進VEGF表達，提高腫瘤細胞適應缺氧微環境，進而利于癌細胞的生長浸潤與遷移[4]。研究指出[5]，通過抑制HIF-1α/VEGF信號傳導途徑，可提高多西他賽的化學敏感性，抵抗轉移性去勢抵抗性前列腺癌的進程。各干預組均可在一定程度上降低MDA-MB-231/CDDP細胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表達，且D組降低程度最顯著，證實二至丸合桂枝可介導HIF-1α通路，下調VEGF表達，逆轉順鉑耐藥性，加大順鉑對TNBC的治療效果。HIF-1α還可活化促凋亡分子，拮抗抑凋亡分子，參與細胞凋亡[6]。研究結果證實，介導HIF-1α途徑抑制VEGF表達量，可促進卵巢癌細胞凋亡。各干預組均可上調MDA-MB-231/CDDP細胞凋亡率，而HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯+順鉑組凋亡率最高，證實二至丸合桂枝湯可增加MDA-MB-231/CDDP細胞對順鉑的敏感度，通過抑制HIF-1α表達，然后加快細胞凋亡。綜上，二至丸合桂枝湯可通過抑制HIF-1α通路，下調VEGF表達，調控TNBC細胞系的順鉑耐藥性。

作者：楊慧芬 毛娟娟 單位：杭州市中醫院 寧波市中醫院