海馬神經(jīng)元影響管理論文

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摘要：目的觀察鉛、硒對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長及存活的影響，研究硒對鉛的神經(jīng)細胞生長抑制的拮抗作用。方法建立新生Wistar大鼠海馬神經(jīng)元原代無血清培養(yǎng)技術，通過PbCl2,Na2SeO3單獨及聯(lián)合作用，觀察神經(jīng)細胞的生長和存活情況。結果10-5mol/L鉛明顯抑制了原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突起生長，引起神經(jīng)元存活率下降；單獨硒(2×10-6mol/L)有明顯促進海馬神經(jīng)元突起生長的作用，尤其在神經(jīng)元突起生長早期；但對海馬神經(jīng)元存活率的影響不明顯。鉛和硒共同孵育時，培養(yǎng)早期硒能拮抗鉛對神經(jīng)元突起延伸的抑制，但隨著培養(yǎng)時間延長，這種拮抗作用消失；從神經(jīng)元存活率來看，在實驗劑量下，未見硒能拮抗鉛對神經(jīng)元存活的抑制作用。結論鉛具有抑制神經(jīng)元生長和存活的毒性，本實驗劑量下的硒在細胞培養(yǎng)早期有促進神經(jīng)元突起生長和拮抗鉛對神經(jīng)元生長和存活的抑制作用。

【關鍵詞】鉛；硒；海馬；神經(jīng)元；神經(jīng)突起

鉛具有顯著的神經(jīng)發(fā)育毒性。毒理學實驗和人群流行病學調查表明，鉛能對神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆性損害，嚴重損壞海馬神經(jīng)元，影響學習、記憶及行為發(fā)育〔1，2〕。硒有防止鉛吸收和加速其排泄的作用，因此，硒有可能成為有效防治鉛神經(jīng)毒性的重要資源〔3〕。為了解硒拮抗鉛神經(jīng)毒性的效果和研究其拮抗作用機制，同時也為更多有效地利用硒，本試驗對體外原代培養(yǎng)的Wistar乳鼠海馬神經(jīng)元進行低劑量PbCl2和Na2SeO3染毒，觀察低水平鉛、硒單獨和聯(lián)合作用對神經(jīng)細胞生長和存活的影響。

1材料與方法

11材料

111試劑解剖液、種植培養(yǎng)液、無血清培養(yǎng)液［由98%Neurobasal培養(yǎng)基和2%B27(美國Gibco公司)無血清培養(yǎng)基添加劑和1%的青霉素、鏈霉素和005mol/L的谷氨酰胺(美國Sigma公司)組成］；胰酶、DNaseⅠ、左旋多聚賴氨酸和臺盼蘭(美國Sigma公司)；PbCl2(上海試四赫維化工有限公司)；Na2SeO3(天津化學試劑研究所)。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗體和神經(jīng)絲蛋白(NF)抗體(北京中山生物技術有限公司)。

112儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(美國ShelLab公司)；全自動圖像分析系統(tǒng)(德國KONTRON公司)；圖像攝錄輸入儀(日本JVC公司)；倒置顯微鏡(德國ZEISS公司)。

113動物出生24h內Wistar大鼠(中山大學北校區(qū)動物中心)。

12方法

121海馬神經(jīng)細胞的分散、移植和培養(yǎng)參考文獻〔4〕，將乳鼠全身消毒后分層剪開頭皮和顱骨，暴露兩側腦半球，分開顳葉皮層，暴露并取出海馬回，置解剖液中；清洗后剪碎成糊狀，0125%胰酶消化20min，終止消化后離心、過篩、CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。第2d更換無血清培養(yǎng)液，以后每隔2d換液1次，每次更換一半培養(yǎng)液。培養(yǎng)第2，3，4，5，6和7d在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

122分組及染毒設對照組、Pb組、Se組、Pb+Se組和先Pb后Se組。對照組加入30μl的磷酸鹽緩沖液，Pb組加入30μlNa2SeO3，Pb+Se組同時加入PbCl2和Na2SeO3各30μl，先Pb后Se組于培養(yǎng)第2d換液時加入30μl的PbCl2，次日半量換液并加入30μl的Na2SeO3。使PbCl2、Na2SeO3的終濃度分別為1×10-5mol/L和2×10-6mol/L。以后換液時補入相應量的PbCl2或Na2SeO3，維持終濃度不變。

123神經(jīng)元存活率的測定每次到培養(yǎng)的時間終點，收集細胞，洗滌定容后取10μl細胞懸液臺盼蘭拒染法進行鏡下活細胞計數(shù)，獲得各個劑量組不同時間終點的活細胞總數(shù)，再分析與同一觀察時間的對照組的活細胞總數(shù)，比較計算各組細胞的相對存活率。

124神經(jīng)元突起的測定倒置顯微鏡下(200×)，隨機選擇3個視野，利用圖像自動分析儀測量形態(tài)可辨的所有神經(jīng)元突起的長度。

2結果

21海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察對照組和單獨硒作用組的海馬神經(jīng)元鏡下呈圓形，體積小，透亮，散在分布；培養(yǎng)2h后開始貼壁，6h后絕大部分細胞已貼壁，光暈明顯；12h細胞幾乎全部貼壁，且長出短小的突起；2d后細胞有明顯增長的突起，胞體飽滿多數(shù)呈梭形、錐形，胞漿豐富，核大，核仁隱約可見，背景中可見極少數(shù)扁平狀多邊形的神經(jīng)膠質細胞鋪墊；5～6d細胞相互間搭連成片，胞體間突起連接成網(wǎng)狀逐漸明顯；7d神經(jīng)元數(shù)目不等地聚集成團，突起聯(lián)結成網(wǎng)。與對照組比較，單獨硒作用組的神經(jīng)元胞體更豐滿，神經(jīng)元突起更長、更粗壯。鉛單獨作用組(10-5mol/L)的神經(jīng)元生長改變情況如下：(1)貼壁減少：24h后，培養(yǎng)基中懸浮細胞數(shù)目較對照組多，貼壁細胞數(shù)減少，致使細胞在培養(yǎng)皿底部分布不均勻；(2)生長遲緩：第3d與對照組比較，散在分布的小體積圓形透亮細胞仍然較多，形態(tài)和大小與細胞剛種植時的情形無明顯差別；(3)出芽延遲：對照組12～24h即可見短小突起，鉛細胞種植后第2d才開始看見細胞變成梭形，伸出短小突起；(4)碎片增多：倒置顯微鏡下的視野中懸浮細胞和死亡細胞的碎片較多，培養(yǎng)后第7d，培養(yǎng)皿中的神經(jīng)元已極其稀疏；(5)成團提前：正常神經(jīng)元在本培養(yǎng)條件下第7d可見明顯的成團現(xiàn)象，鉛組于第4d即可見神經(jīng)元細胞5～10個聚齊成團，第5d可見成團細胞中間神經(jīng)元邊界模糊，核仁消失，部分出現(xiàn)裂解，第7d成團神經(jīng)元消失，皿中細胞數(shù)目顯著減少。鉛硒同時作用組神經(jīng)元生長的改變情況與鉛作用組相似，也出現(xiàn)了貼壁減少、生長遲緩、碎片增多和成團提前的改變，但是二者不完全相同，鉛硒同時作用組神經(jīng)元出芽晚于對照組但較鉛組早，培養(yǎng)第6和第7d，貼壁神經(jīng)元數(shù)目明顯較鉛組多。先加鉛后加硒作用組早期改變與鉛組相同，但從培養(yǎng)第4d開始，與鉛組相比，貼壁神經(jīng)元數(shù)目增多，細胞碎片減少，突起較多且較為粗壯。

22海馬神經(jīng)元存活率分析(表1)表1可見，10-5mol/L鉛引起神經(jīng)元存活率明顯下降；單獨硒(2×10-6mol/L)對海馬神經(jīng)元存活率的影響不明顯；鉛硒同時孵育組，存活率最低，提示使用的硒作用劑量可能偏高。

表1Pb、Se對海馬神經(jīng)元存活率的影響（略）

23海馬神經(jīng)元突起長度分析(表2)表2可見，10-5mol/L鉛明顯抑制了原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突起生長(P005)，單獨硒(2×10-6mol/L)作用有明顯促進海馬神經(jīng)元突起生長的作用，尤其在神經(jīng)元突起生長早期(P005)；鉛和硒共同孵育時，培養(yǎng)早期硒能拮抗鉛對神經(jīng)元突起延伸的抑制(P005)，但隨著培養(yǎng)時間延長，這種拮抗作用變得不明顯。

表2Pb、Se對海馬神經(jīng)元突起長度的影響（略）

注：與對照組比較，aP005；與Pb組比較，bP005；與Se組比較，cP005

3討論

低劑量的鉛一方面可以引起包括神經(jīng)細胞在內的多種細胞發(fā)生凋亡〔4，5〕，另一方面可以通過多種途徑引發(fā)神經(jīng)元死亡〔6，7〕。因此，本研究所觀察到的鉛抑制體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的存活，應該是鉛誘導神經(jīng)元凋亡和誘發(fā)神經(jīng)元壞死共同作用的結果。本次實驗發(fā)現(xiàn)，硒對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突起的生長有很明顯的促進作用，但作用機制不清楚，硒是否在神經(jīng)元生長發(fā)育過程中參與了對神經(jīng)細胞粘附因子(NCAM)表達調控需進一步研究。本實驗中未觀察到硒對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的存活有明顯的影響。鉛硒共育組較鉛組在神經(jīng)元突起長度上存在差異，尤其在生長早期，提示硒對鉛抑制神經(jīng)元突起生長具有一定的拮抗作用，至于這種拮抗作用隨培養(yǎng)時間延長而逐漸減弱至不顯著，認為可能與鉛的毒作用劑量過高有關，從神經(jīng)元存活率的結果也能反映這一點，由于高劑量的鉛導致對神經(jīng)元生長的累積毒效應已經(jīng)超過了硒的拮抗能力。提示應進一步降低鉛的毒作用劑量再進行觀察研究。

參考文獻

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