大鼠腦組織表達管理論文

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【摘要】目的觀察鋁負荷大鼠腦組織單胺氧化酶B(MAOB)的活性與表達改變，并探討尼莫地平對該動物模型的影響。方法采用三氯化鋁（AlCl3）(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持續(xù)3個月，建立鋁負荷致大鼠慢性腦損傷的動物模型，尼莫地平(80mg/kg)在每次鋁給予4h后灌胃，觀察行為學、生化酶學、MAOBmRNA及蛋白表達水平等指標的變化。結果鋁負荷能明顯導致大鼠被動回避性學習記憶能力和空間識別能力障礙，使其腦組織乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活性顯著降低(P＜0.01)，而膽堿酯酶(AchE)活性顯著升高(P＜0.01)，超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低(P＜0.01)，而丙二醛（MDA）含量顯著升高(P＜0.01)，MAOB活性與MAOBmRNA及蛋白表達水平顯著增加(P＜0.01)；NMDP能明顯改善鋁負荷大鼠的學習記憶能力障礙，明顯阻遏鋁負荷大鼠海馬組織ChAT與SOD活性的降低，AchE活性與MDA含量的增高，MAOB活性及其mRNA與蛋白表達的增加。結論鋁負荷致大鼠腦損傷涉及腦組織的MAOB活性與表達改變；NMDP可能降低鋁負荷大鼠腦組織MAOB表達和活性，并增加SOD活性，減少自由基而保護大鼠慢性腦損傷。

【關鍵詞】尼莫地平；鋁負荷大鼠；單胺氧化酶B

由于阿爾茨海默病（AD）發(fā)病機制未明，目前尚缺乏理想的治療手段。尼莫地平是雙氫吡啶類鈣通道拮抗劑，脂溶性高，易通過血腦屏障，其擴張腦血管，改善腦血供應等作用已得到肯定并應用于臨床，而其對老年癡呆認知記憶障礙的改善作用〔1〕，機制至今仍不很清楚。有研究報道單胺氧化酶B（MAOB）的活性改變與神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元退變可能有密切關系〔2，3〕。為探討尼莫地平在改善老年癡呆等導致的認知記憶障礙中的作用，本研究擬采用鋁負荷大鼠腦損傷模型，觀察腦損傷學習記憶障礙與腦組織MAOB改變的關系及尼莫地平對鋁損傷大鼠腦組織MAOB表達的影響，為神經(jīng)元退行性疾病的發(fā)病機制研究奠定實驗與理論基礎，為防治藥物的開發(fā)探尋新方法與新途徑。

1材料與方法

1.1動物與分組清潔級3月齡Wistar大鼠100只，雄性，180～220g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供〔動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2005002〕。按體重隨機分成3組，每組10只，即空白對照(溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉)組，鋁模型(AlCl3400mg/kg)組與尼莫地平組(80mg/kg)，灌胃容積1ml/100g體重。在實驗過程中，鋁模型組死亡2只鼠。

1.2方法

1.2.1試劑、藥品與儀器AlCl3·6H2O和葡萄糖酸鈉為國產(chǎn)分析純，臨用前用蒸餾水配制；尼莫地平(重慶科瑞制藥廠)，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制；乙酰膽堿轉移酶(ChAT)、膽堿脂酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、MAOB試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RTPCR試劑盒（日本TaKaRa）、RNATriol、單去污劑裂解液、考馬斯亮藍、封閉液與辣根過氧化物酶等。DTT2型大鼠跳臺儀(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)、DMS2型電腦全自動程控Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)、高速冷凍離心機(美國Sigma公司)、UV265紫外分光光度計(日本島津公司)、PCR擴增儀(美國genecycleTM，BioRad公司)與凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國BioRad公司)等。

1.2.2模型制備采用AlCl3(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持續(xù)3個月，建立鋁負荷致大鼠慢性腦損傷的動物模型。

1.2.3檢測指標

1.2.3.1訓練次數(shù)與跳臺潛伏期分別在給予藥物3月后次日，用跳臺法測定每組大鼠被動回避性學習記憶能力。先將動物放入反應箱中適應1min，然后通以電壓為36V的交流電5min，大鼠遭受電擊會跳上安全平臺，而走下平臺后會再次遭受電擊，記錄5min內(nèi)大鼠受電擊次數(shù)，作為大鼠學會逃避電擊的學習能力。24h后測定大鼠的記憶成績，把大鼠置于安全平臺上，記錄大鼠第一次跳下平臺的時間即潛伏期，以此潛伏期作為大鼠的記憶成績，超過5min記為5min。

1.2.3.2尋臺潛伏期每組大鼠在完成被動回避性學習記憶能力測試后，用Morris水迷宮法進行大鼠空間定向能力測試。水溫24～25℃。整個訓練過程分為2個階段：第1階段，第1次訓練時將大鼠放到平臺上適應1min，后讓其自由游泳至平臺，3min內(nèi)未找到平臺者，實驗者協(xié)助將其引至平臺，從第2天起，每天分上、下午分段訓練，每段訓練4次，每次訓練時選擇1個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠進行定向航行，持續(xù)訓練4d；第2階段，即在第5天時進行測試，撤去平臺，并任意將大鼠從最后一次訓練時的入水方位放入，電腦記錄大鼠第1次跨越原平臺的時間即尋臺潛伏期(Stepdownlatency，SDL)，以此潛伏期作為大鼠的空間定向能力成績，超過2min以2min計算。

1.2.3.3腦組織ChAT、AchE、SOD活性和MDA含量測定在完成全部行為學測試后，處死大鼠，分離其海馬，用生理鹽水做成10%勻漿，按相關試劑盒說明書進行具體操作。

1.2.3.4腦組織MAOB活性、mRNA及蛋白表達水平的檢測10%海馬及皮質組織勻漿各取0.1ml，按照MAOB試劑盒說明書中的操作步驟測定MAOB活性。參照大鼠MAOB基因庫，根據(jù)cDNA設計引物，引物由北京鼎國生物技術發(fā)展中心合成，用來擴增535bp的MAOB片段。另外從北京鼎國生物技術發(fā)展中心購買GAPDH引物一對作為內(nèi)參照，用來擴增983bp的GAPDH片段。MAOB的上游引物為5′TGCTAGATAAGATCTGCTGG3′；下游引物為5′ATCCAATGTGTACGCAATTG3′；GADPH的上游引物為5′TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC3′；下游引物為5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′；PCR反應條件為95℃5min預變性，95℃1min、60℃55s與72℃90s，27個循環(huán)，72℃10min。擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，BioRad凝膠成像分析系統(tǒng)成像與分析。Western印跡測定MAOB蛋白表達水平，以βactin為參照，辣根過氧化物酶系統(tǒng)顯色，用可見紫外光凝膠掃描分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析。

1.3統(tǒng)計學處理結果用x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，組間差異采用Dunnett方法進行顯著性檢驗。

2結果

2.1鋁負荷大鼠腦組織生化指標的變化及尼莫地平的影響與空白對照組比較，鋁模型組大鼠腦組織的ChAT與SOD活性明顯降低，AchE活性與MDA含量顯著增高（均P＜0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠腦組織的ChAT與SOD活性明顯增加，AchE活性與MDA含量顯著降低（均P＜0.01）（表1）。

2.2鋁負荷大鼠學習記憶功能的變化及尼莫地平的影響與空白對照組比較，鋁模型組大鼠5min內(nèi)學會逃避電擊而需要的電擊次數(shù)明顯增加，而跳臺潛伏期明顯縮短，尋臺潛伏期明顯延長（均P＜0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠學會逃避電擊而需要的次數(shù)明顯減少(P＜0.01)，而跳臺潛伏期明顯延長，尋臺潛伏期明顯縮短（均P＜0.01）（表2）。

2.3鋁負荷致大鼠腦組織MAOB活性與表達變化及尼莫地平的影響與空白對照組比較，鋁負荷組大鼠腦組織MAOB活性與MAOBmRNA及蛋白表達均顯著增高（均P＜0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠腦組織MAOB活性與MAOBmRNA及蛋白表達均顯著降低（均P＜0.01）（表3）。表1尼莫地平對鋁負荷大鼠腦組織ChAT、AchE、SOD活性與MDA含量的影響表2尼莫地平對鋁負荷致大鼠學習記憶能力與空間識別能力損害的影響與鋁模型組比較：1）P＜0.01，下表同表3尼莫地平對鋁負荷大鼠腦組織MAOB活性與表達的影響

3討論

轉基因方法可以建立AD大鼠模型，并能較好地模擬AD特征改變，但建模時間長，成本昂貴，很難廣泛用于研究〔4〕。動物腦室注射、腹腔給予或者長期口服鋁鹽，鋁可在腦皮層各區(qū)以及海馬異常沉積，引起動物學習記憶功能的進行性損害和神經(jīng)元退變〔5〕。因此，本室采用AlCl3(400mg/kg)持續(xù)灌胃大鼠的方法，建立鋁負荷致大鼠慢性腦損傷模型。ChAT的表達和活性降低以及AchE活性的升高會造成乙酰膽堿含量下降，進而出現(xiàn)學習記憶功能障礙。因此ChAT和AchE表達和活性改變是AD等神經(jīng)元退行性疾病特征變化之一。本研究中，鋁模型組大鼠腦組織ChAT活性降低，AchE活性升高，同時大鼠被動回避性學習記憶能力與空間識別能力損害，故此法建立神經(jīng)元退變大鼠模型是成功的。

關于鋁致神經(jīng)毒性，特別是致神經(jīng)元退變的機制，目前尚不完全清楚。本實驗結果顯示，慢性鋁負荷可導致大鼠海馬SOD活性降低、MDA含量升高，提示與其他原因所致腦損傷相似，氧化應激也參與了慢性鋁負荷致腦損傷、神經(jīng)元退變過程。

本實驗發(fā)現(xiàn)鋁負荷大鼠腦組織MAOB活性、MAOBmRNA與蛋白表達顯著增高，提示鋁負荷致大鼠神經(jīng)元退變的毒性機制也與MAOB活性及表達增加有關。

本結果還發(fā)現(xiàn)，尼莫地平能明顯改善鋁負荷導致的大鼠被動回避性學習記憶能力損害和空間學習記憶障礙，減輕海馬神經(jīng)元損傷，明顯增加鋁負荷大鼠海馬ChAT與SOD的活性，明顯降低鋁負荷大鼠AchE活性與MDA含量，表明尼莫地平對鋁負荷大鼠腦損傷具有保護作用；同時，尼莫地平也能顯著降低鋁負荷大鼠腦組織MAOB活性，對抗鋁負荷引起的大鼠腦組織MAOBmRNA和蛋白表達增加。但尼莫地平對MAOB活性與表達的改變是該藥物直接作用引起，還是作為鈣通道拮抗劑間接作用所致，尚不清楚，有待深入研究。

【參考文獻】

1王瑋,付晶晶.尼莫地平的藥理作用及臨床應用〔J〕.沈陽醫(yī)學院學報，2000;2(2):1147.

2KurthJH，KurthMC，PodusloSE,etal.AssociationofamonoamineoxidaseBallelewithParkinson′sdisease〔J〕.AnnNeurol,1993;33（4）:36872.

3YangJQ，ZhouQX.Protectiveeffectofnimodipineagainstcerebralinjuryinducedbysubacutecarbonmonoxideintoxicationinmice〔J〕.ActaPharmacolSin，2001;22(5):42337.

4HsiaoK，ChapmanP，NilsenS,etal.Correlativememorydeficits，A8elevation，andamyloidplaquesintransgenicmice〔J〕.Science,1996;274(5284):99102.

5林巧，曹云鵬.長期經(jīng)口鋁攝入對大鼠記憶行為的影響〔J〕.中國臨床康復，2003;7(25)：34467.