皮膚腫瘤治療

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1材料和方法

1.1材料石蠟包埋組織標(biāo)本選自西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院199901/200605病理確診手術(shù)患者.SCC45例，年齡45～95(平均68.8)歲，男27例，女18例.Bowen病19例，年齡45～87(平均65.2)歲，男12例，女7例.正常人皮膚10例對照，年齡46～78（平均62.5）歲，男5例，女5例作鼠抗人MMP9mAb（MAB0245）和CD34mAb（(MAB0034)，免疫組化SP試劑盒(KIT9710)及DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司.

1.2方法所有組織均經(jīng)40g/L甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，連續(xù)切片5張，厚約4μm.采用SP法，免疫組化染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行.陽性對照采用自身對照,用PBS代替一抗和二抗進(jìn)行陰性對照.MMP9和CD34均采用高溫高壓抗原修復(fù).MMP9結(jié)果判定：在不知任何背景資料的情形下,采用雙盲法進(jìn)行判定,以腫瘤細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡棕黃色顆粒為陽性，并按著色強(qiáng)弱分級：無色為0，淺黃色為1，深黃色為2，棕黃色為3；著色范圍以在10×40高倍鏡下隨機(jī)選區(qū)5個(gè)視野（每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)均值：＜25%為1,25%~49%為2，50%為3.上述兩項(xiàng)相加為MMP9的表達(dá)強(qiáng)度積分：＜2為陰性，＜3為弱陽性（+），3~4為陽性（），＞4為強(qiáng)陽性（）.MVD計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)［3-4］方法進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，先在低倍鏡（×100）下觀察確定血管密度最高處，在（×200）視野下選擇3個(gè)高血管密度區(qū)，計(jì)算單位視野（×200）平均血管數(shù).單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，而直徑大于約8個(gè)紅細(xì)胞的血管，有較厚肌層的血管以及硬化區(qū)的血管不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理,根據(jù)資料類型組間比較分別采用方差分析和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1MMP9MMP9陽性改變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色，偶爾可見細(xì)胞核著色，陽性顆粒多呈團(tuán)塊狀.正常人皮膚組織中MMP9呈弱陽性表達(dá)，主要表達(dá)于顆粒層和棘細(xì)胞層，真皮層中纖維樣細(xì)胞、單一核細(xì)胞等見陽性染色.BD組織中表皮全層均有MMP9均勻彌漫表達(dá).SCC中MMP9在癌巢組織彌漫分布，以腫瘤周邊表達(dá)強(qiáng)烈（圖1）MMP9表達(dá)在正常皮膚組、Bowen病組、SCC組依次增高（表1）.MMP9在SCC組中高于Bowen病組織（χ2=6.667,P<0.05），Bowen病組中MMP9高于正常皮膚組（P=0.028，P<0.05）.在SCC組中MMP9的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤組織的病理分級均無關(guān)（P＞0.05）.

表1MMP9在正常皮膚組、Bowen病組和SCC表達(dá)(略)

2.2MVD計(jì)數(shù)CD34標(biāo)記的微血管呈點(diǎn)狀分布，血管內(nèi)皮細(xì)胞膜被染成褐色.在SCC組織中微血管形態(tài)不規(guī)則，部分血管呈現(xiàn)發(fā)芽狀，血管分布不均勻，在SCC的邊緣區(qū)域最為密集，呈簇狀(圖2).Bowen病組織中微血管形態(tài)較規(guī)則，但分布不均，血管簇偶見.正常皮膚組織內(nèi)的微血管形態(tài)規(guī)則，分布均勻.Bowen病組中和SCC組中MVD明顯升高（表3）.

圖1SCC組織MMP9表達(dá)SP×400(略)

表2SCC組織MMP9表達(dá)與患者年齡、性別及鱗癌分期的關(guān)系(略)

圖2SCC組織MVD計(jì)數(shù)SP×100(略)

表3CD34和MVD在Bowen病和SCC中表達(dá)(略)

aP<0.05vs正常皮膚.

3討論

本研究結(jié)果顯示,MMP9在SCC組中高于Bowen病組織（P<0.05），Bowen病組中MMP9高于正常皮膚組（P<0.05）.Bowen病MMP9在增生表皮細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核表達(dá)；在SCC組織中MMP9在腫瘤細(xì)胞，增生上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有陽性表達(dá)，在表達(dá)的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞的種類、數(shù)量上均高于Bowen病組，提示MMP9高表達(dá)可能是SCC轉(zhuǎn)移、侵襲能力的分子基礎(chǔ).同時(shí)觀察到僅有部分有腫瘤細(xì)胞能表達(dá)MMP9，且表達(dá)MMP9的腫瘤細(xì)胞多位于癌巢的外周部分和毛細(xì)血管、淋巴管管腔周圍，提示MMP9表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的侵襲能力.實(shí)體腫瘤的新生血管提供了更多與體循環(huán)連接的通路，這使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶向遠(yuǎn)隔部位轉(zhuǎn)移.腫瘤組織中微血管密度越大，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)及淋巴循環(huán)的機(jī)會(huì)越多，淋巴結(jié)及鄰近臟器轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)也增大.在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)：微血管密度與腫瘤侵襲性與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率相關(guān)［1,5-6］.近來研究表明，MMP9不僅是降解基底膜和ECM的關(guān)鍵酶，而且在腫瘤間質(zhì)血管生成中起重要作用［1，5］.Wang等［7］人的研究表明,存在于細(xì)胞外基質(zhì)的VEGF能夠通過存在于血管平滑肌細(xì)胞上的VEGFR1受體調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá).而MMPs又能降解細(xì)胞外基質(zhì)釋放更多的VEGF,這便建立了一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路來促進(jìn)新生血管的形成.Naglich等［8］研究發(fā)現(xiàn)MMP1,MMP2,MMP9誘發(fā)和促進(jìn)血管生成，TIMP1,TIMP2,TIMP3,TIMP4抑制新血管生成.

本實(shí)驗(yàn)顯示，在SCC組織中微血管形態(tài)不規(guī)則，血管分布不均勻，在SCC的邊緣區(qū)域最為密集，呈簇狀.Bowen病組織中微血管形態(tài)較規(guī)則，但分布不均.正常皮膚組織內(nèi)的微血管形態(tài)規(guī)則，分布均勻.SCC組中MVD高于Bowen病組織（P<0.05），Bowen病組中MVD高于正常皮膚組（P<0.05），提示細(xì)胞在發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化之前已有血管生成增多，這很可能是SCC血管生成的啟動(dòng)階段.我們發(fā)現(xiàn)在SCC組、Bowen病和正常皮膚組中MMP9表達(dá)高者M(jìn)VD表達(dá)亦高，且MMP9的高表達(dá)的部位與MVD高密度區(qū)具有一致性，均位于癌巢邊緣地區(qū)，提示：腫瘤的浸潤生長與新生血管生成是同步進(jìn)行的，MMP9的表達(dá)與腫瘤血管形成有關(guān).本研究結(jié)果表明，SCC的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的分化程度及新生血管的密度密切相關(guān)，MMP9可能是SCC的重要促血管生成因子之一.阻斷MMP9的表達(dá)，抑制MMP9的活化可能對抑制SCC轉(zhuǎn)移具有重要意義.

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